鸡胚的结构及尿囊腔接毒
鸡胚的结构及尿囊腔接毒
鸡胚的结构及尿囊腔接毒
气室 绒毛尿囊腔
羊膜囊
胚体 卵黄囊
鸡胚结构模式图
（三）接种途径
尿囊腔接种
该途径一般用于病毒的（流感、新城鸡瘟病毒 和腮腺炎）适应和传代。
尿囊腔接种
源自文库
鸡胚接种方法
3、死胚蛋
头照可见血点、血线或血环紧贴内壳面， 血管色因氧化而比活胚深，有时散黄或有灰白 色凝块；中期死胚特征是气室界线模糊，胚胎 呈黑团状，常与壳粘连，不动，当手摇胚蛋时， 胚胎随之转动，停止摇晃时也随之停止。而活 胚时刻在活动；三照死胚的小头发亮，血管色 深，气室界线模糊，蛋体发凉；对尚未出壳的 也可用温水来判断将蛋放入40°C温水中，凡 是在水中轻微晃动的为活胚，反之则为死胚。
接wenku.baidu.com方法：
选 10 － 12 日龄鸡胚检卵后，标出气室边界和胚胎 位置。用碘酒消毒鸡卵钝端（气室上方）的蛋壳，在 气室上方靠近胚胎侧的卵壳上钻一孔，钻孔区再次用 碘酒消毒。用无菌眼科小剪子沿钻孔周围剪去少许， 开一小窗，勿损伤内层壳膜，经小窗向气室内滴入一 滴无菌液体石蜡。将卵置照卵灯上，可清楚地看到胚 胎的位置。将注射器瞄准胚胎的腭下胸前，刺入后注 入0.1－0.2ml接种物。用沾有碘酒通过火焰的小块胶 布将窗口封上。接种后的受精卵根据接种的病毒在 33℃、35℃或37℃的条件下孵育48－72小时。
第三天
胚长0.55cm，胚重20mg， 尿囊开始长出，胚的位 置与蛋的长轴垂直，开 始形成前后肢芽，出现5 个脑胞的原基，眼的色 素开始沉着，有35对体 节，照蛋时，可见胚和 伸展的卵黄囊血管形似 蚊子，俗称“蚊虫珠”；
第4天
胚长0.77cm，胚重50mg， 孵黄囊血管包围蛋黄达 1/3，肉眼明显看到尿囊， 羊膜腔形成，胚和蛋黄 分离，由于中脑迅速生 长，胚胎头部明显增大， 舌开始形成，照蛋时蛋 黄不容易转动，胚与卵 黄囊血管形似蜘蛛，俗 称小蜘蛛；
病毒接种鸡胚步骤
流感病毒鸡胚接种
材料：9-11龄鸡胚、孵蛋箱、照蛋器、开卵钻、石蜡、注射器、碘酒、70%酒精、镊子、二级生物安全柜等。
方法：
1 照蛋：⑴避开鸡胚及主动脉，找寻两血管间隙划线（最佳点）⑵划线在血管之间⑶标记蛋时不要太靠近气室处，因后面去壳时可能敲掉，导致标记不见
2 开孔：⑴开孔前先用75%酒精擦一下，由下而上或由上至下一遍即可，不可反复擦⑵开孔勿太大（太大不易封住，且易染菌）
3 注射：⑴针头45度斜插入孔中，至针头尾部到达蛋壳⑵注射后不要用力过大，抽出时不要过快⑶一针插入鸡胚，不要在里面搅拌
注：⑴握病毒管时不要握底部，易使病毒失活，融化时最好冰上融化，或流水冲洗⑵吸取液体时先混匀
尿囊腔接种：照检后画出气室边界和胎位，在胚胎面与气室交界处边缘约1mm处并避开血管做一标记，此即为注射点。在点及周围用75%酒精消毒，并用钻蛋机钻开一个约2mm长小口，勿损伤壳膜。用注射器注入流感病毒0.1-0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33-35度孵箱培养。每日照检鸡胚一次，于接种后24h 内死亡者为非特异性死亡应弃去。
甲型流感一般培养44-48h收获，而乙型流感病毒培养72h后进行收获。如病毒用冷冻干燥标本进行传代，无论甲型还是乙型均培养72h后才进行收获
收获前鸡胚须置4度冰箱6h或过夜，但不能置时间过长，过长会引起散黄。如急于收获亦可置-20度冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。预冷的目的是：将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。
(动物传染病学实验课件)7 实验七 鸡的解剖,病料处理和接种
分子生物学诊断技术是20 世纪七、八十年代发展起来 的诊断方法，具有特异性强、 敏感性和快速等优点，例如 PCR 、 RFLP 、 核 酸 探 针 技 术和基因序列分析等。
可根据需要和条件选择合适 的方法进行诊断。
实时荧光定量PCR （Real-time PCR）
三、方法与步骤
3.1 细菌分离 无菌操作切取病变组织1-2g，涂于平皿的1/4
☺ 受精卵的选择
1、最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响
2、受精卵的壳最好是白色的 3、受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天， 保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。
☺ 孵育
1、孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃ 2、相对湿度：50%-60% 3、必须保证具有充分的新鲜空气流通，特别是在 孵化5-6天以后 4、从孵育后第3天开始，每天翻卵一次
附：
☺ 鸡胚的结构与功能
1、卵壳 上有细孔，进行气体交换 2、壳膜 使气体和液体分子在内外两方面进行交换。 3、气室 呼吸和调节压力 4、绒毛尿囊膜 起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交 换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。
5、尿囊腔 胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为 透明液体，以后尿囊液中尿酸盐迅速增加，胚胎发 育到第12-13天后，尿囊液开始变得混浊。 6、羊膜与羊膜腔 其中盛有羊水，胎体浸泡于其中 7、卵黄 在胚胎发育早期供给鸡胚营养。 8、卵白 在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。
鸡胚接种方法
病毒分离培养
方法
应
用
价
值
存 在 问 题
自身带病毒； 有的接种后不敏感； 动物饲养问题 敏感病毒谱窄 设备技术要求条件高
应用最早； 动物 方法简便； 接种 结果易于观察 鸡胚 来源客观，易于管理，带 培养 病毒机会少；多途径接种 细胞 应用广泛，敏感病毒谱广 培养
鸡胚培养法的优点：
1. 它的组织分化程度低，可选择适当途径 接种，病毒易复制，感染病毒的膜和液体 含大量病毒。 2. 是个整体，有神经血管的分布及脏器的 构造。 3. 来源充足，操作简单，通常是无菌的， 对接种的病毒不产生抗体。
2.羊膜腔接种
羊膜腔接种主要用于从临床或现场材料 （如患者咽漱液等）中分离病毒。接种到 羊膜腔中的接种物能够被胚胎吞咽和进入 呼吸管，可遍及各种组织和细胞，使具有 特定细胞亲嗜性的病毒被充分利用，从而 提高病毒繁殖的可能性。由于可收获的羊 膜组织或羊水较少，为了使病毒适应在尿 囊内胚层生长，从而获得大量的病毒，可 将经羊膜腔接种分离到的病毒再经尿囊腔 传代。
接种：去除卵膜，于绒毛尿囊膜上 滴上病毒0.1~0.2ml。
封口：用胶布封口，胶布事先用碘 酒消毒，并通过火焰烧去余碘。
培养：放入温箱培育4天，然后收 获病毒。
收获：
收获前检卵，看人工气室是否仍然存在， 如果不存在，轻轻地吸气室上的孔。用 碘酒消毒人工气室上的卵壳，去掉壳和 壳膜至人工气室的边缘，尽量最大范围 地暴露绒毛尿囊膜，用无菌剪子沿人工 气室的边缘将接种病毒的绒毛尿囊膜剪 下，低温保存。同时做无菌培养。
鸡胚培养和细胞培养
第一节
鸡胚接种
一、鸡胚的结构
鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非SPF鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用SPF鸡胚。
一般说来，孵育至8-14天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒，14天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至21天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。鸡胚的钝头（俗称“大头”），是气室，其功能是呼吸和调节胚内压力。壳膜之下为血管丰富的绒毛尿囊膜，其外层为绒毛膜，系外胚层形成，内层为尿囊膜，系内胚层形成，两膜所夹为中胚层。由于胚胎的肺发育不完善，此时绒毛尿囊膜代行胚胎呼吸器官的作用，气体的交换是在绒毛尿囊膜的血管内通过卵壳进行的。尿囊腔是胚胎的排泄器官，内含的尿囊液初为透明液体，成分极类似于生理盐水溶液，以后则尿酸盐含量增高。尿囊液量在11-13日龄时最高，平均达6毫升左右。
病毒的鸡胚接种
病毒的鸡胚接种
教学目标
使学生掌握病毒的鸡胚接种方法和收获方法。
材料准备
1.器材温箱、照蛋器、蛋架、超净工作台、1 mL注射器、20～27 号针头、镊子、酒精灯、灭菌吸管、灭菌滴管、灭菌青霉素瓶、铅笔、透明胶纸等。
2.种毒新城疫病毒悬液。
3.受精卵健康鸡群的受精卵，无母源抗体，产后10 d之内5 d最佳。
4.其他石蜡，质量分数为2.5%的碘酊及质量分数为75%的酒精棉球。
方法步骤
（一）鸡卵的保存、孵育及检卵
1.保存孵育前，保存在4.5～20 ℃的室温内，以10 ℃左右最佳，最多不能超过10 d。
2.孵育先将温箱调节温度为37.3～37.8 ℃，湿度45%～60%。将鸡卵孵入后，每日翻卵2～3次。
3.检卵孵后第4~6 d，用照蛋器检查发育情况，检出未受精及死亡鸡胚。鸡胚的生长情况分为以下几类：
（1）未受精 4 ~6d后仅见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。
（2）生活鸡胚 4~6 d后可见到清晰的血管小团，内有鸡胚暗影，较大的鸡胚可见胚动。
（3）濒死或死亡鸡胚鸡胚活动呆滞或不能主动运动，血管昏暗或断折沉落。
（4）作标记将待接种的鸡胚取出，在照蛋器上照视，划出气室范围，并在鸡胚黑影，或绒毛尿囊膜发育中心等处，按接种途径要求标出记号。
（二）各种途径的鸡胚接种方法
1.尿囊腔接种
（1）接种方法孵育9～11日龄的鸡胚（实图6-20），经照视后，划出气室及胚胎位置，标明胚龄及日期，气室朝上立于卵架上。在气室中心或远离胚胎侧
气室边缘先后用碘酊棉球及酒精棉球消毒。以钢锥在气室的中央或侧边打一小孔，针头沿孔垂直或稍斜插入气室，进入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3 mL
鸡胚接种技术
尿囊增长迅速，尿囊血管系统迅速发育，已经覆盖
羊膜与部分卵黄。 卵黄囊血管分布在卵黄面积达2/3以上。
可见头部和躯干部两个小圆团。
鸡胚接种技术
——鸡胚的结构与生理 ✪ 鸡胚的发育过程：Day 7
卵黄体积达到最大程度，胎儿的外形已具备禽类的特点。 头和眼所占的比例相当大，前后肢分化明显。 照蛋时胚胎在羊水中不容易看清楚。
接种到羊膜囊中的病毒可遍及胚胎各种组织和细胞，
使具有特定细胞亲嗜性的病毒被充分利用，从而提高 病毒繁殖的可能性。 分离病毒时，可同时收获羊水和尿囊液
病毒也可被排泄到尿囊腔，使尿囊液中含有大量病毒。
鸡胚接种技术
——鸡胚的接种途径和方法
✪
绒毛尿囊膜接种：
疱状的病毒，如牛痘、天花、单纯疱疹和鸟痘病毒。
主要用于分离和繁殖在绒毛尿囊膜上产生斑点状和痘 可在绒毛尿囊膜上滴定这些病毒，通过产生斑和痘的 数目来计算感染性病毒颗粒的数目。 还可用于抗体滴定，因为斑和痘数目减少的程度与抗 体浓度有关。
鸡胚接种技术
——鸡胚的接种途径和方法
✪
尿囊腔接种：
应和传代培养。
用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适
鸡胚接种技术
——鸡胚的结构与生理 ✪ 鸡胚的发育过程：Day 1
心脏、血管、消化道、脊 柱、神经系统、头、眼开 始形成。
鸡胚1、尿囊腔接种2、绒毛尿囊膜接种 3、卵黄囊等接种方式
从孵育后第3天开始，每天翻卵一次。
检卵
自孵育后的第4天开始检卵，每天一次。
孵育4-5日于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育
情况。
未受精卵：只见模糊的卵黄阴影，不见血管和
鸡胚痕迹 活胚：具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚 还可见到胚动，但孵育14、15天以后胚动不明 显，甚至无胚动。 死胚：血管昏暗模糊，没有胚动。
育，24h内死亡者废弃
（二）绒毛尿囊膜接种 主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。 方法一： 1）取10-12日龄鸡胚，画出气室部，消毒 2）在气室端的卵壳上开一1.5×1.5cm的口 3）用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜 4）滴入接种物 5）用胶布或透明胶纸封闭切口
方法二：（要做人工气室） 1、在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用 电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤焦圈。
7、用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗 中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小
孔用石蜡密封。
8、胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
（三） 尿囊腔接种
主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感
病毒、新城疫病毒的分离和增殖。 1、选用10-11日龄的鸡胚，画出气室和胚位 2、在气室接近胚体处用碘酊和酒精进行消毒 3、用钢锥穿一小孔
2、用碘酊和酒精消毒后，
小心用刀尖撬起卵壳，造
成卵窗。
3、在气室端中央钻一个 小孔。
实验一-鸡新城疫疫苗一
（2）绒毛尿囊膜接种
该方法主要用于痘病毒、喉气管炎病毒和马立克氏 病毒等的分离培养。将卵壳消毒后，先在气室上打一小 孔，再于胚胎侧靠近气室处避开大血管用钢锯条将蛋壳 打开一个4ｍm见方的小口，用刀尖小心撬开蛋壳，不 能损伤卵壳膜，形成卵窗。用针尖轻轻挑破卵窗中心的 卵壳膜，但不能损伤卵壳膜下的绒毛尿囊膜。
（2）根据接种部位，病毒种类或需要，收获相 应的鸡胚材料如尿囊液、羊水、绒毛尿囊膜、 胎儿、卵黄囊等，有时需要收获全胚（除去卵 黄和蛋白），如新城疫病毒、马脑炎病毒等。
尿囊液：气室打开后，用无菌眼科镊子慢慢撕去卵壳 膜，然后夹住绒毛尿囊膜轻轻提起，用巴氏吸管刺破 绒毛尿膜直接吸取尿囊液。为防止羊膜堵住吸管口， 可用镊子轻轻压下羊膜及胎儿，然后再吸。每个鸡胚 一般可收8mL左右尿囊液。
目的和要求：
1.掌握鸡胚的孵化过程和鸡胚的接种途径、接 种方法； 2.掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔的增殖过程， 掌握接毒和收毒的方法。
实验材料 ：
白壳鸡胚、孵化箱、１mL注射器、蛋托、新 城疫Ⅳ系弱毒苗、源自文库射用生理盐水、青霉素、 链霉素等
实验内容：
1.鸡胚的选择和孵化：孵育前的鸡胚先用清水以 布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育 （37℃，相对湿度45%～60%），孵育三日后， 鸡卵每日翻动1～2次。孵至第4日，用检卵灯观 察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑 影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。
实训四病毒的鸡胚接种技术.ppt
实训四 病毒的鸡胚接种技术
主Байду номын сангаас内容
• 目的要求 • 仪器及材料 • 方法与步骤 • 病毒的收获 • 注意事项
实训四 病毒的鸡胚接种技术
一、目的要求
掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法， 明确鸡胚培养病毒的应用。
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二、仪器及材料
9-12日龄鸡胚、恒温箱、照蛋器、蛋架、胶头滴管、一 次性注射器（1ml）、中号镊子、眼科镊（或眼科剪）、 酒精灯、蜡、锥子、高压蒸汽灭菌器、生理盐水、5%碘酊 棉球、75%酒精棉球、5%石炭酸或3%来苏儿、新城疫Ⅳ系 疫苗、青霉素瓶、水盘等。
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四、病毒的收获
然后破羊膜收获羊水，收获的尿囊液和羊水应清亮，浑浊 说明有细菌污染。收获的病毒经无菌检验合格者冷冻保存。 用具消毒处理，鸡胚置消毒液中浸泡过夜或高压灭菌，然 后弃掉。
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五、注意事项
• 鸡胚接种需严格的无菌操作，以减少污染。 • 操作时应细心，以免引起鸡胚的损伤。 • 病毒培养时应保持恒定的适宜条件，收毒结束，注
意用具、环境的消毒处理。
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六、布置作业
将试验结果正确写入试验报告中，完成试验 报告内容。
• 封孔
接种病毒完成后，用熔化的石蜡将小孔封闭。
鸡胚接种的方法与步骤
鸡胚接种的方法与步骤
鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法，其基本步骤如下：1. 选择合适的鸡胚：通常选择9-12 日龄的鸡胚，此时鸡胚的免疫系统尚未完全发育，适合病毒的生长和繁殖。
2. 准备接种材料：将待接种的病毒样品稀释到适当的浓度，并准备好接种工具，如吸管、针头、注射器等。
3. 接种鸡胚：将稀释后的病毒样品接种到鸡胚的尿囊腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜等部位。接种时要注意操作规范，避免污染和损伤鸡胚。
4. 孵化鸡胚：将接种后的鸡胚放入孵化箱中，在适当的温度和湿度条件下孵化，让病毒在鸡胚中生长和繁殖。
5. 观察和检测：在孵化过程中，定期观察鸡胚的生长情况和病变特征，如鸡胚是否死亡、是否出现出血点、是否出现痘斑等。同时，可以进行病毒的分离和鉴定，以确定病毒的种类和特性。
6. 收获病毒：当病毒在鸡胚中生长和繁殖到一定程度时，可以收获病毒。收获病毒的方法包括离心、过滤、沉淀等，具体方法取决于病毒的种类和特性。
7. 保存病毒：收获的病毒可以保存在适当的温度和湿度条件下，以备后续的实验和研究使用。
需要注意的是，鸡胚接种是一项技术性较强的操作，需要严格遵守实验操作规范和安全注意事项，以确保实验的准确性和安全性。同
时，在进行鸡胚接种实验时，应该遵循相关的法律法规和伦理规范，确保实验的合法性和道德性。
鸡胚接种技术
鸡胚接种技术
第一节 鸡胚的结构与生理
鸡胚是由三个胚层发育起来的， 即外胚层、中胚层和内胚层， 它们构成胚胎的组织与器官。
（约10日龄鸡胚的结构见图）
鸡胚接种技术
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卵壳与壳膜
卵壳位于最外层的坚硬壳层； 壳膜位于卵壳的下层，允许气体和液体分子 交换，因此培养鸡胚需一定的湿度和气体。
第二节 鸡胚的孵育和检查
受精鸡卵的供给
— 没有受到病毒和细菌的污染如新城鸡瘟病 毒、布氏杆菌等；
— 培养立克次体和衣原体，不能来自食用抗 生素的鸡群。
鸡胚接种技术
鸡胚的孵育
— 温度为38～39℃； — 湿度为40％-70％； — 翻蛋：防止蛋白粘连，促进羊膜运动和空
气流通； — 通风：排出CO2和吸入O2。
鸡胚接种技术
接种步骤与方法
取9~11日龄的鸡胚，标记气室与胚胎位置，并在胚胎面 与气室交界之边缘上约1mm处避开血管作一标记，此即为 注射点。
将鸡胚竖放在卵杯上，钝端向上。消毒气室的蛋壳，用 开孔器钻开一长约2mm小口。
再次消毒钻孔区，接种病毒液0.1～0.2ml，将针头刺入 孔内，经尿囊膜入尿囊腔，注入病毒液。
消毒后用石蜡溶化封孔，于33～35℃孵卵器孵育48～ 72h，；于接种后24h内死亡者为非特异性死胚应弃去。
鸡胚接种技术