胆固醇氧化酶分离纯化及应用的研究进展

・综述与专论・生物技术通报ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ２００９年第４期胆固醇氧化酶分离纯化及应用的研究进展钟学敏孙艳张玲杨海麟王武（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡２１４１２２）摘要：综述了不同微生物所产胆固醇氧化酶的分离纯化方法及应用研究情况，重点介绍了破除乳化体系的方法，血清中胆固醇含量的检测，并针对分离纯化与应用中存在的问题提出了今后的研究方向。

关键词：胆固醇氧化酶分离纯化乳化体系应用ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｏｒＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＯｘｉｄａｓｅＺｈｏｎｇＸｕｅｍｉｎＳｕｎＹａｎＺｈａｎｇＬｉｎｇＹａｎｇＨａｉｌｉｎＷａｎｇＷｕ（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｍｔｒｙＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＭｉｎ西ｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＪｉａｎｇｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ２１４１２２）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｒｅｖｉｅｗｅｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓａｎｄａｐｐｌｉｅｄｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｏｘｉｄａｓｅｆｒｏｍｖａｒｉｏｕｓｍｉｃｒｏｂｅ，ａｎｄｆｏｃｕｓｅｄｏｎｈｏｗｔｏｇｅｔｒｉｄｏｆｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｉｎｓｅｒｕｍ．Ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｆｕｔｕｒｅｗｅｒｅｐｒｏｐｏｓｅｄａ‘ｇａｉｎｓｔｔｈｅｅｘｉｓｔｅｎｃｅｄｐｒｏｂｌｅｍｓｏｆｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｏｘｉｄａｓｅＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＥｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ胆固醇氧化酶（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｏｘｉｄａｓｅ，ＥＣ１．１．３．６）是胆固醇降解代谢过程中的关键酶，依赖辅酶ＦＡＤ，能专一性地催化胆固醇转化为胆甾．４一烯・３一酮（４－ｃｈｏｌｅｓｔｅｒ０１．３－ｏｎｅ）（图１），在食品开发、医疗保健、临床检测、生物农药等方面具有广泛应用价值¨ｏ。

胆固醇氧化酶有动物、植物和微生物３个来源，其中动植物来源的研究较少，微生物来源较多，主要包括诺卡氏菌属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、链霉菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、短杆菌属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、裂殖菌属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、红球菌属（ＲｈｏｄｏＣＯＣＣ淞）、芽胞杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、棒状杆菌属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等不同来源的胆固醇氧化酶的性质不同，因此分离纯化的方法也不同。

目前，日本已经实现胆固醇氧化酶的工业化，而国内胆固醇氧化酶尚处于研究阶段。

随着胆固醇氧化酶的应用日益广泛和人们对酶纯度的需求日益增加，分离纯化的成本已成为胆固醇氧化酶的生产总成本的决定性因素。

因此，如何更好的分离纯化胆固醇氧化酶已是工业化生产胆固醇氧化酶的关键技术。

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×－晒岛图１胆固醇氧化酶的作用机理１胆固醇氧化酶的分离纯化现状胆固醇是脂溶性物质，难溶于水，所以胆固醇在培养基中的分散效果成为影响产酶的重要因素。

目前，大部分研究者利用表面活性剂促进胆固醇的分散，但表面活性剂，胆固醇和胆固醇氧化酶会形成乳化体系，对分离纯化带来很大的困难。

如何破除乳化体系是分离纯化需要解决的关键问题。

胆固醇氧化酶的分离方法很多，不同微生物来源的胆固醇氧化酶，其分布及其酶学性质各有差异，如有的吸附在收稿日期：２００８－１０—１６基金项目：国家“８６３”计划课题资助项目（２００６ＡＡＩＯＺ３０５），工业生物技术教育部重点实验室基金资助项目（ＫＬＩ—ＫＦ２００５０５）作者简介：钟学敏（１９８５一），男，硕士研究生，研究方向：酶工程技术与应用；Ｅ－ｍａｉｌ：ａｚｈｏｎｇｍｉｎ＠１２６．ｃｏｍ通讯作者：王武（１９５２一），女，教授，博士生导师，研究方向：发酵工程、遗传工程；Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｗｕ＠ｊｉｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ万方数据２００９年第４期钟学敏等：胆固醇氧化酶分离纯化及应用的研究进展４５细胞膜上，能够直接分泌到发酵液中（表１）。

胆固醇氧化酶的提取技术的选择主要取决于酶的分泌特性，因此，不同微生物产生的胆固醇氧化酶的分离方法也各有不同。

以下按微生物菌种分类，介绍不同菌种的分离纯化研究现状。

表１不同微生物来源的胆固醇氧化酶的部分酶学性质１．１短杆菌属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）短杆菌属野生菌产生的胆固醇氧化酶Ｋｍ值低，胞外分泌，而且在氧化胆固醇的过程中，降解产物单一，不产生其它胆甾类副产物。

目前，短杆菌产生的胆固醇氧化酶已成为该领域的研究热点，而且日本已将其成功应用到工业化中。

为了有效地破除乳化体系，可以用表面活性剂萃取法破除乳化体系。

本实验室做了大量这方面的研究，季文明¨３利用ＴｒｉｔｏｎＸ一１１４作为表面活性剂，与无机盐形成双水相，在一定温度以上，包含胆固醇氧化酶的表面活性剂就会从水相中分离出来，水相中留有少量的表面活性剂和胆固醇氧化酶。

该技术操作简单且成本低廉，所以大规模应用很有前景。

随着科学发展，三相分离技术逐渐被用来破除了乳化体系。

王龙刚…利用硫酸铵与叔丁醇混合后形成有机相、中间沉淀相和水相的三相，分离乳化体系中的胆固醇氧化酶，效果显著，比酶活提高了３．４９倍，收率９３％。

该法简单有效，易于放大，因此，可以用其对粗酶液进行预处理，破除乳化体系。

另外，亲和层析，离子交换与凝胶层析在该酶的分离中有一定应用。

例如，季文明等¨１利用胆固醇氧化酶和底物胆固醇之间的亲和力，以胆固醇为吸附剂构成底物亲和层析柱，从从短杆菌的发酵液中中分离得到胆固醇氧化酶，收率为６４％，纯度提高３４倍。

但该法专一性强，不适合大规模处理。

日本ＵｗａｊｉｍａＨｌ采用硫酸铵盐析，ＤＥＡＥ－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、Ｓｅｐｈａ－ｄｅｘＧ－７５层析方法，在硫酸铵溶液中制得胆固醇氧化酶结晶。

比较以上３种胆固醇氧化酶分离方法，双水相萃取简单有效，三相分离收率高，两者都能破除乳化体系，但只能针对粗酶液的处理，为获得纯度高的胆固醇氧化酶，还需进一步纯化。

层析方法能分离得到纯度高的胆固醇氧化酶，但不能破除乳化体系。

为此，应结合有机溶剂萃取法和层析法的优势，用前者处理粗酶液，用后者进一步提纯，利于获得纯度、收率均较高的胆固醇氧化酶。

１．２链霉菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）日本对Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．产生的胆固醇氧化酶的研究已经很成熟，成功将胆固醇氧化酶基因克隆到基因工程菌，并且实现规模生产，现在市场上应用到的胆固醇氧化酶大部分为这种酶。

多数链霉菌属产生的胆固醇氧化酶为胞外酶。

此类酶一般都用浓缩方法处理粗酶液。

酶的浓缩方法常用的有沉淀法，超滤等，沉淀法又包括机溶剂沉淀法和无机盐沉淀法。

由于有机溶剂易使酶失活，常用无机盐来处理粗酶液，如最常见的是用（ＮＨ。

）：ＳＯ。

使胆固醇氧化酶沉淀。

（ＮＨ。

）：ＳＯ。

盐析设备要求简单、成本低、便于小批量生产，但对盐浓度和酶浓度都有限制。

（ＮＨ。

）：ＳＯ。

浓度达到一定范围，会使部分胆固醇氧化酶活力降低，甚至失活；胆固醇氧化酶的浓度太低不易于分离。

超滤收率虽高，且不易引入其他杂质，但设备要求高。

因此，在应用中研究者应根据实际情况来选用。

Ｖａｒｍａ等ｐ１将Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌａｖｅｎ—ｄｕｌａｅＮＣＩＭ２４２１的胆固醇氧化酶分别用三醋酸纤维素膜超滤浓缩和８０％的（ＮＨ。

）：ＳＯ。

盐析，收率分别为９０％和８３％，此两种方法收率虽然都很高，但是它们都无法破除乳化体系，酶纯度很低，因而在酶的浓缩时也应该考虑到破除乳化体系的问题，以便于后期的纯化。

浓缩用于早期粗酶的处理，为了获得更高的纯度，还要可用离子交换层析等方法进行进一步提纯。

ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ同样也被应用来进一步分离胆固醇万方数据生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ２００９年第４期氧化酶的分离。

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仅用一步ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析分离来自Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｒａｄｉａｅ（ＰＴＣＣ１１２１）的胞外胆固醇氧化酶，用磷酸缓冲液（１０ｍＭ，ｐＨ８．５）平衡，０—０．５ＭＮａＣＩ＋醋酸缓冲液（１０ｍＭ，ｐＨ４．５）阶段洗脱，纯化得到的胆固醇氧化酶经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ得到单一条带。

当单一的层析方法难以达到理想的分离效果时，常采用几种层析联合的方法分离纯化胆固醇氧化酶，Ｌａｒｔｉｌｌｏｔ等¨ｏ报道用超滤，离子交换层析和凝胶层析纯化Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．产生的胆固醇氧化酶，收率达到４２％。

链霉菌安全性能高，已经广泛被应用到工业生产。

所产的胆固醇氧化酶分离操作相对简单，而且热稳定性强。

工业应用前景广阔。

１．３诺卡氏茵属（Ｎｏｃａｒｄｉａ８ｐ．）诺卡氏菌属是由Ｔｕｒｆｉｔｔ首次发现能产胆固醇氧化酶的菌株，国内对Ｎｏｃａｒｄｉａｓｐ．所产的胆固醇氧化酶研究较少，目前仅见国外报道。

常用非离子表面活性剂、去诟剂等萃取胆固醇氧化酶和破除乳化体系，如果纯度还没达到要求，还可将沉淀过后的胆固醇氧化酶通过各种层析方法分离。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ¨１用１％的ＴｒｉｔｏｎＸ．１００萃取胆固醇氧化酶，收率７０％，粗提后再把萃取得到的胆固醇氧化酶经过ＤＥＡＥ。

Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析，得到比活提高４倍的胆固醇氧化酶。

Ｋｕｌａ—ｏ用双水相非离子聚乙烯去垢剂直接从Ｎｏｃａｒｄｉａｓｐ．中萃取后用离子交换层析得到纯化倍数为１６０，总收率７５％一８０％，纯化后的酶可作为诊断用酶和食品用酶。

迄今为止，诺卡氏菌属的胆固醇氧化酶还未曾实现工业化。

可能是由于胆固醇氧化酶存在于细胞膜上，与其它蛋白，脂类物质结合在一起形成混合胶束集团，这种胶束集团无法分离，限制了其应用。

１．４红球菌属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）红球菌属是目前所知道的产胆固醇氧化酶活性比较高的菌株，有胞外酶和胞内酶两种类型。

胞外酶与胞内酶性质不同，胞内酶存在于细胞膜，分离难度大，因此为了降低分离难度，常只分离胞外酶，不考虑胞内酶。

Ｍａｃｈａｎｇｕ等¨叫通过硫酸铵盐析、离子交换层析、凝胶层析将Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉ的胆固醇氧化酶纯化了３２．８倍，收率０．３％，纯度很高，但收率低，可能乳化体系造成酶的大量损失。

为了提高收率，许多研究者也常借鉴诺卡氏属的分离方法，采用ＴｒｉｔｏｎＸ・１００萃取膜上的胆固醇氧化酶。

ＴｒｉｔｏｎＸ一１００是一种表面活性剂，不仅能够萃取胞内酶，而且破除乳化体系的效果显著。