PCR和实时荧光定量PCR简介

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实时荧光定量PCR技术

千里之行，始于足下。

Real-time PCR for mRNA quantitation一、原理实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量PCR产物的目的，目前该技术已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。

实时定量PCR 包括探针法和染料法两种，探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增强，特异性高，如Taq Man TM技术；染料法则是利用染料来指示扩增的增强，特异性相对较低，但简便易行。

染料法的原理是在PCR 反应体系中，参加过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增强与PCR产物的增强彻低同步。

荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA 产量成正比，检测PCR 过程中的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，从而达到定量目的。

目前染料法实时荧光定量PCR主要使用的是美国Molecular Probes 公司的SYBR Green 1 和SYBR Gold 染料。

二、实验步骤一）、单链cDNA 摸板的合成（参照相关资料）二）、Real-time PCR操作主意(TIANGEN 公司RealMasterMix(SYBR Green) PCR Kit)1、20×SYBR Green solution 在室温下平衡并彻底混匀。

2、将125μL 20×SYBR Green solution 参加至1.0 ml 2.5×ReaMasterMix 中并轻轻混匀。

3、照表1决定多个PCR反应混合物并分装到各个PCR管中。

4、将PCR管放入热循环仪并启动循环程序（表2）。

三、计算在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才干够被检测到。

荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。

在实际操作中普通以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。

荧光定量PCR中一个关键的数据是“Ct（threshold cycle）值”，其中“t”是Threshold ，即PCR管内荧光超过本底（达到可检测水平）时的临界数值；第 1 页/共 3 页朽木易折，金石可镂。

实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用

实时荧光定量PCR技术的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义
二、RT-PCR技术的原理及试验流程三、RT-PCR技术的数据分析四、RT-PCR技术的应用
实时荧光定量PCR的定义
RT-PCR技术的数据分析
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ)
病原体检测转基因食品检测基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究
RT-PCR技术的数据分析相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control）通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
变性
退火
延伸
RT-PCR技术的原理及试验流程
SYBR Green法优缺点
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan法
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan探针法优缺点

实时荧光定量pcr检测核酸的原理

实时荧光定量pcr检测核酸的原理实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，RT-qPCR）是一种基于聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的技术，能够快速、准确地定量检测核酸。

RT-qPCR的原理基于PCR的扩增和荧光信号的监测。

PCR是一种通过反复复制DNA片段的方法，它由DNA模板、引物和DNA聚合酶组成。

引物是专门设计的短链DNA片段，它们能够在目标DNA序列的两端精确结合并指导DNA聚合酶的复制。

PCR的循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。

在变性步骤中，双链DNA被加热至94-98℃，使其解离成两条单链DNA。

在退火步骤中，引物与单链DNA特异性结合。

在延伸步骤中，DNA聚合酶沿着单链DNA模板合成新的DNA链。

每一个PCR循环会使目标DNA的数量翻倍，经过多个循环，目标DNA的数量会大幅增加。

RT-qPCR通过引入荧光探针实现对PCR扩增产物的实时检测。

荧光探针也是一种短链DNA片段，其中包含一个荧光染料和一个荧光信号抑制器。

荧光信号抑制器通过与荧光染料的近距离接触，抑制了荧光信号的发射。

当荧光探针与PCR扩增产物结合时，荧光信号抑制器与荧光染料分离，荧光信号得以释放。

通过荧光信号的增加可以判断PCR扩增产物的数量。

RT-qPCR的步骤包括样品处理、反转录、PCR扩增和荧光信号检测。

首先，需要从待检测样品中提取出核酸。

然后，通过反转录酶将RNA转录成cDNA，以便后续PCR扩增。

接下来，将引物、荧光探针和PCR反应液与样品一起加入PCR扩增管中。

PCR扩增过程中，荧光探针与PCR产物结合，并释放荧光信号。

PCR扩增和荧光信号检测是在同一反应管中进行的，所以可以实现实时监测。

最后，根据荧光信号的强度，可以计算出PCR扩增产物的初始数量。

RT-qPCR具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点。

它可以在短时间内检测到低浓度的核酸，并且能够区分不同的核酸序列。

实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR原理1.PCR基本原理PCR通过在不断循环的体系中复制和放大特定DNA片段，从而实现DNA的快速扩增。

PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。

在变性步骤中，DNA的双链结构被解开，形成两条单链DNA。

在退火步骤中，引物与目标DNA的互补序列结合，形成引物-目标DNA结合复合物。

在延伸步骤中，DNA聚合酶通过追加互补碱基，并使用引物作为起始点，在目标DNA的基础上合成新的DNA链。

实时荧光PCR是对传统PCR技术的改进，它通过添加荧光探针（也称为探针引物）来实时监测PCR反应的进程。

荧光探针通常由两部分组成：一个荧光标记物和一个定向增效子。

在PCR反应的延伸步骤中，荧光探针与目标DNA的互补序列结合，并被PCR酶切割，导致荧光信号被释放。

3.原理图解实时荧光PCR通常需要使用一个双喷嘴热循环仪（Thermal Cycler），其中一个喷嘴用于控制样品的温度，另一个喷嘴用于实时监测PCR反应的进程。

具体的PCR反应流程如下：-备制PCR试剂：将PCR反应所需的试剂混合均匀，包括DNA模板、引物、荧光探针和内参物。

-生成PCR产物：通过一系列的循环反应，将DNA模板放大成大量的PCR产物。

-荧光信号监测：PCR反应过程中，荧光探针与PCR产物的结合会释放荧光信号。

实时荧光PCR系统通过探测和记录PCR反应体系中的荧光信号，并在每个循环结束时测定信号强度。

4.数据解读和PCR效率计算实时荧光PCR的结果通常以荧光信号的周期阈值（Ct值）表示，Ct值是荧光信号强度超过背景噪音的循环数。

Ct值越低，表示PCR产物浓度越高，反之亦然。

根据Ct值，可以计算PCR的效率。

效率（E）的计算公式为：E =10^(-1/slope) - 1，其中slope为荧光曲线的斜率。

效率越接近1，表示PCR反应越有效。

5.RT-qPCR的应用RT-qPCR可应用于多个领域，包括基因表达分析、病原体检测和药物开发等。

实时荧光定量PCR简介

实时荧光定量PCR简介荧光定量PCR检测技术从诞生到现在已经有8 年了，但是其应用在近四年才迅猛增长。

在Medline 数据庫中，用“ Taqman” 或”real time PCR” 作为关键词检索，在1996 年仅有19 篇，在1997 年仅有28 篇，在98 、99 、2000 年分别达到了52 、157 、409 篇，2003 年已经达到2984 篇，相信在不久的将来会有更多的文章发表。

针对实时PCR 这一热点领域，闪晶公司对它进行了深入细致的研究，并且及时地为广大科研人员推出这项技术服务。

荧光定量PCR基本原理•Taqman 技术：该技术以美国ABI 公司为代表。

PCR 扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。

该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号；PCR 扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的5' －3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。

•Beacon 技术：该技术以美国人Tagyi 为代表。

也是加入了荧光探针，但它是环状的寡核苷酸探针，分别由茎部和环部组成，两端分别标记荧光报告基团和荧光猝灭基团，在无靶序列的情况下，探针始终是环状，报告基团的荧光被猝灭基团猝灭，使荧光检测仪检测不到荧光信号；而在有靶序列时，即在PCR 的退火阶段探针与靶序列结合，使荧光报告基团和猝灭基团分开，这样荧光仪可以检测到荧光，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。

•FRET 技术：该技术以Roche( 罗氏公司) 为代表。

它的基本原理是：两条直线型寡核苷酸探针，其中一条的3 …端标记荧光激发基团，另一条的 5 ' 端标记荧光检测基团，在无靶序列的情况下，两条探针分开，无法进行能量的传递，这样荧光仪不能检测到荧光信号；而当有靶序列时，即在PCR 的退火阶段两条探针与靶序列结合，使得两条探针上的荧光基团可以进行能量的传递，这样荧光仪就可以检测到荧光信号，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。

PCR和实时荧光定量PCR简要介绍

PCR产物的检测
三、限制性内切酶酶切分析
若知道PCR扩增片段的序列或限制性内切酶酶切图谱，则可选择合适的限制酶消化PCR产物，再进行电泳分析，根据PCR酶切产物的电泳图谱，可判定PCR产物的特异性及是否存在突变。
四、分子杂交
五、层析技术
荧光定量PCR
荧光定量PCR(FQ-PCR)是一种新的PCR检测方法，是基于荧光能量转移(FRET)的原理建立的。 FRET是指通过供受体发色团之间偶极-偶极相互作用，能量从供体发色团转移至受体发色团，使受体发光。
八、模板：0.1~0.5 μmol/L
在一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显著升高，但模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。为保证反应特异性，一般采用微克水平的基因组DNA或102105拷贝的待扩增片段作为模板。
PCR产物的检测
一、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是PCR扩增产物的分离、纯化和鉴定最常用的方法。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用溴化乙锭(EB)染色，在紫外灯下便可以直接确定DNA片段在凝胶板中的位置。其分辨率很高，可测出1ngDNA。首先根据PCR扩增片段的大小选择琼脂糖凝胶浓度，一般800bp以上的片段用0.8%的胶，800bp以下的片段用1.0%～ 2.0%的胶。成功的PCR扩增应可见到分子质量均一的一条区带，对照分子质量标准还可对扩增产物进行半定量。
多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。
PCR产物的积累规律示意图
PCR反应条件
一、反应体系
标准PCR反应体积为50~100μl,其中含有缓冲液，4 种底物，引物，DNA模板和耐热DNA聚合酶。
二、反应步骤
加入各种试剂，95C热变性5~10分钟，使模板DNA 充分变性，同时除去蛋白酶，氯仿对耐热DNA聚合酶的影响。然后加入2U TaqDNA聚合酶，加50μl液体石蜡封盖反应体系，防止液体挥发。进行PCR反应。(如有热盖设计的PCR仪则不需要加入液体石蜡)

实时荧光定量PCR技术详解和总结

实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。

它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。

二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。

实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。

根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。

实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。

三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。

（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。

实时荧光定量pcr原理

实时荧光定量pcr原理实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是一种用于检测和定量DNA或RNA的技术。

它结合了PCR技术和荧光探针技术，能够实时监测PCR反应过程中的荧光信号变化，从而实现对目标核酸的定量分析。

本文将介绍实时荧光定量PCR的原理及其在科研和临床中的应用。

实时荧光定量PCR的原理基于PCR技术，PCR是一种体外扩增DNA的方法，通过DNA聚合酶酶链反应（PCR）使目标DNA序列在体外得到扩增。

而实时荧光定量PCR则在PCR反应中引入了荧光探针，利用荧光信号的变化来监测PCR反应的过程。

在实时荧光定量PCR中，通常使用的荧光探针包括SYBR Green和TaqMan探针。

SYBR Green是一种DNA结合染料，它能够与PCR反应中产生的双链DNA结合并发出荧光信号，因此可以用来监测PCR反应的进程。

TaqMan探针则是一种双标记探针，包括一个荧光素和一个荧光淬灭器，它能够在PCR反应中特异性结合目标DNA序列并发出荧光信号，因此可以用来定量PCR反应中的目标DNA。

实时荧光定量PCR的原理可以简单概括为，首先，将待扩增的DNA样品与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中；然后，利用热循环装置对PCR反应体系进行多次循环加热和降温，使目标DNA序列得到扩增；在PCR反应过程中，荧光探针与目标DNA结合并发出荧光信号，这些信号会被实时监测和记录下来；最后，通过分析监测到的荧光信号的变化，可以计算出PCR反应体系中目标DNA的起始量，并进行定量分析。

实时荧光定量PCR在科研和临床中有着广泛的应用。

在科研领域，实时荧光定量PCR可以用于基因表达分析、病原微生物检测、基因型分析等方面，其高灵敏度和高特异性使其成为了研究人员进行生物学研究的重要工具。

在临床诊断中，实时荧光定量PCR可以用于疾病的早期诊断、疾病的病原体检测、药物代谢酶基因型分析等方面，其快速、准确和可靠的特点使其成为了临床诊断中不可或缺的手段。

实时荧光定量PCR(qPCR)技术简介

实时荧光定量 PCR 技术简介实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一项以PCR 反应为基础的DNA定量技术，通过对目标基因在扩增过程中产生的拷贝数进行实时的定量，从而达到对目的基因的定性和定量分析。

现有两种常用的方法对PCR 产物进行荧光定量：一种是利用荧光染料与双链DNA 结合，通过荧光强度进行定量；另一种是利用携带了荧光报告基团的特异DNA探针对目标基因进行定量。

一、利用荧光染料进行定量一种最为常用的定量方法就是在PCR 反应体系中加入荧光染料，此类荧光染料会与所有的双链DNA 结合，并产生荧光。

游离的荧光分子不会产生荧光信号，只有与双链DNA结合的荧光分子才会释放荧光，随着DNA 拷贝数的增加，测得的荧光强度也会增强。

利用荧光染料进行定量的优势就是成本低廉，只需要一对普通的引物就能完成定量。

然而，常用的诸如SYBR Green 染料会与所有的双链DNA 无差别地结合，包括引物二聚体，因此有可能会导致对目标基因的定量不精确，灵敏度偏低。

二、利用荧光探针进行定量荧光探针只能检测出与自身序列互补的DNA 片段，因此用探针法定量可以有效地避免引物二聚体的干扰，使定量结果更加精确。

此外，通过使用携带不同荧光信号的多种探针，我们可以同时对一个样品中的多个靶序列进行定量。

荧光探针的5’端携带有一个荧光报告基团，3’端则为淬灭基团，在正常情况下两个基团间的距离很近，淬灭基团会抑制报告基团使其无法发出荧光。

在PCR 反应过程中，引物和荧光探针在退火阶段都会与目的片段结合；在延伸阶段，Taq 酶因为具有5’-3’核酸外切酶活性，会将探针，使得报告基团和淬灭基团相互分开，从而释放出荧光。

每增加一条目的基因的拷贝，就会有一个探针被切开并释放荧光信号，因此随着PCR 反应的进行，荧光信号会逐渐增强。

使用探针进行荧光定量的优点就是精确度和灵敏度都要比荧光染料高，且可以做到同时对多个基因进行定量，但是相应的合成探针的成本也要比使用荧光染料高出许多。

实时荧光定量PCR技术详解和总结

实时荧光定量PCR技术详解和总结实时荧光定量PCR技术是一种用于测定DNA样本中特定序列的数量和表达水平的分子生物学技术。

它能够在PCR反应进行过程中实时监测PCR 产物的扩增情况，通过检测荧光信号的强度和PCR循环次数来确定起始模板的数量。

该技术具有高灵敏度、准确性和广泛的应用领域，被广泛用于基因表达分析、病原微生物的定量检测和分子诊断等领域。

在使用引物和探针系统进行实时荧光定量PCR时，引物通过与模板DNA序列的互补配对，在PCR扩增过程中结合并扩增目标序列，而探针是一种荧光标记的序列，通过与目标序列的特定区域配对来检测PCR产物的扩增。

当目标序列存在于DNA模板中时，引物与探针结合扩增会释放出荧光信号。

荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过监测荧光信号的强度和PCR循环数，可以推导出起始模板的数量。

SYBR Green是一种无标记引物的特殊荧光染料，可以与扩增产物的双链DNA结合并发出荧光信号。

在PCR扩增反应中，SYBR Green会通过与扩增产物结合形成复合物，并发出荧光信号。

由于SYBR Green能与任意DNA结合形成复合物，所以在使用SYBR Green进行实时荧光定量PCR 时，需要进行特异性验证和内参基因的设计，以确保准确测量目标序列的数量。

在实时荧光定量PCR技术中，还需要进行标准曲线法来定量PCR产物的数量。

标准曲线法是通过制备一系列已知浓度的标准DNA模板并进行PCR反应，测量荧光信号的强度和标准DNA模板的浓度之间的关系，建立一个标准曲线。

然后，通过测量待测样品PCR反应的荧光信号强度，根据标准曲线来计算待测样品中目标序列的起始模板数量。

总结来说，实时荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、准确度和广泛应用的分子生物学技术，可以实时监测PCR反应中荧光信号的强度来确定PCR产物的数量。

它的基本原理包括使用引物和探针系统或SYBR Green 染料来检测PCR反应产物的扩增，并通过荧光信号强度和PCR循环数来推导起始模板的数量。

实时荧光定量PCR技术

简述实时荧光定量PCR技术1.实时荧光定量PCR技术的原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

该技术结合了实时定量PCR仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。

实时PCR的设想是由Higuchi于1992年最早提出[1]。

荧光探针技术是根据标记基团的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)原理而实现的。

当某个荧光基团的发射光谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且2个基团距离足够近时，能量可以从短波长(高能量)的荧光基团传递到长波长(低能量)的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。

定量原理：实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团，使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系，从而得出产物的扩增曲线。

理想的扩增曲线应为J型，符合2N方程(其中N为PCR的循环次数)，但实际上扩增曲线为S型。

在PCR 反应早期，不能将产生荧光的水平与背景明显区别，之后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在指数期的某一点上检测PCR产物的量，并由此推断起始模板含量[2-3]。

实时荧光定量PCR的标准扩增曲线如图1。

其中Rn+表示每点测量的荧光强度，代表反应管含有模板DNA；Rn-表示荧光基线强度，代表反应管不含有模板DNA，其在理想情况下是一条平线，只具有背景荧光数值；△Rn的值表示PCR过程中，探针降解的量，也即PCR产物的量。

基线(baseline)是背景曲线的一段，范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定，到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。

图1 实时荧光定量PCR的标准扩增曲线荧光阈值(threshold)是以PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline)，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号标准差的10倍，即：Threshold=10SD(cycle 3-15)，一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。

qPCR实时荧光定量PCR

(1)特异性好。使用针对靶序列设计的特异性探针对定量分子进行识别,具有很高的准确性。同时,靶序列由引物和探针பைடு நூலகம்双重控制,特异性好、假阳性低。
(2)灵敏度高。荧光定量PCR检测技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显像技术为一体的技术, 因此大大提高了其检测灵敏度。
(3)线性关系好、线性范围宽。由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系,通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量。
域值 → ↑ Ct
如果检测到荧光信号超过域值则被认为是真正的信号 ,它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。
Ct(cyclethreshold)值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。
研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,Ct值随着起始模板量的增加而线性降低,利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线。其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
TaqMan 探针
1.3 特点
一般PCR产物都需要经过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭（EB）染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测,不仅需要多种仪器,而且费时费力,所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害处,在这繁杂的实验过程中会带来假阳性的污染。而荧光定量PCR克服了常规PCR的许多缺点,有着如下显著的优点:
(4)操作简单、安全、自动化程度高、防污染。扩增和检测在全封闭的同一管内检测,不需要开盖,降低了溴化乙锭的污染。同时扩增和检测一步完成,不需要后期处理,不再需要担心放射性污染。
(5)速度快、效率高。可在2-3小时完成多个样品的定量分析, 有效的减少了劳动量。

实时荧光定量聚合酶链反应技术

实时荧光定量聚合酶链反应技术实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是实时荧光PCR（real-time PCR）的一种。

实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入可以反映PCR扩增进程的荧光基团，并在PCR过程中实时监测荧光信号的变化。

实时荧光定量PCR技术则是将定量PCR的原理应用到实时荧光PCR，通过在实时荧光定量PCR的基础上引入已知浓度的参照基因，或者通过标准曲线来达到对目的基因初始浓度的定量，换句话说，实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团（如荧光染料、荧光基团标记的探针或引物），并在整个PCR进程中实时监测荧光信号的累积，最后通过参照基因或标准曲线对未知浓度的模板进行定量分析。

实时荧光定量PCR是20世纪90年代初期快速发展起来的可对起始DNA模板浓度精确定量的PCR方法。

在实时荧光定量PCR技术的发展进程中，两个重要的发现起着关键的作用：①在20世纪90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能；②此后，荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。

随着实时荧光定量PCR技术方法的成熟与稳定，以及配套仪器的不断完善，实时荧光定量PCR已经走向临床，如应用于各种病原体的检测。

一、定量PCR的原理与类别定量PCR是指以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数。

定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行。

根据PCR扩增过程中是否加入某种标记物、标记物的种类和最后检测的信号的不同可分为至少4种类型：直接定量检测法、放射性核素标记定量检测法、酶标记定量检测法和实时荧光定量PCR法。

根据反应体系是否设有参照物及其是否与标本在同一管中进行扩增，定量PCR可分为4种方法：（一）有限稀释法也叫倍比稀释法，其参照品的浓度是通过不断稀释直至靶基因不能再扩增为止，然后根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线，计算出待检标本中原始模板的分子数。

实时荧光定量PCR简介、结果分析及报告

示温度的不一致性等；
试剂问题：如Taq酶和（或）反转录酶的失活、探针的纯
度及标记效率和核酸提取试剂的效率等；
广西临床检验中心
失控的一般情况
阳性质控或样本失控的预防措施
纯化核酸：但不能完全避免来自标本核酸提取过程中所混入的去垢剂、有机溶剂的抑制作用；
重复性实验：对临床样本进行重复双份测定，避免由于操作的随机性
广西临床检验中心
对数曲线与线性曲线的转换
对数曲线
线性曲线
广西临床检验中心
数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
检测通道的选择：该步骤主要是由于多色
荧光检测在PCR检测中的应用越来越广泛，
比如含有内标的试剂，内标的检测通道与目的基因的检测通道不同，因此需根据需求选择不同的通道进行结果分析。
广西临床检验中心
标准曲线分析
斜率、截距、相关性
广西临床检验中心
数据分析一般流程
标准曲线分析（Standard Curve）
Slope（斜率）：理论值为-3.32。可以从两个方面来分析，首先是标准曲线的10倍梯度关系，如果梯度正确，斜率数值会比较接近理论值；其次是试剂
的扩增效率，当梯度正确的情况下，扩增效率越高越接近理论值。
• 定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对未知模板起始浓度进行定量分析的方法。
广西临床检验中心
TaqMan作用机理
1. 2. 3.
forward primer
5' 3'
每产生一条DNA链，就切断一条探针每切断一条探针，就产生一个单位信号信号强度与结合探针的DNA分子数成正比

实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR1.实时定量PCR的产生通过PCR扩增可以检测模板样品中目的DNA或RNA分子的含量，由于PCR扩增以指数方式进行，因此根据最后积累的产物似乎可以推算出起始模板分子的拷贝数。

但是实际操作中会有很多误差，因此产生了实时定量PCR.。

通过特定设计的PCR仪来实时检测PCR扩增过程每一轮循环产物的积累数量，可以很好地推算出模板的起始浓度。

这种工作方式就称为实时定量PCR（real-time PCR）。

由于在实时定量PCR检测过程中通过检测标记的荧光信号的累积来实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，所以亦称为实时荧光定量PCR。

定义：实时荧光定量PCR是指在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。

最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

2.原理在实时荧光定量PCR反应中，引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。

每经过一个循环，收集一个荧光强度信号。

这样我们就可以通过荧光强度变化检测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

SYBR荧光染料（SYBR Green I ）是一种结合于所有双链DNA小沟中的染料。

其与双链DNA结合后才发出荧光，不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号。

因此，通过荧光强度的变化，可探测产物增长的数量。

SYBR荧光优缺点优点：使用方便，不必设计复杂探针具有价格优势。

缺点：对DNA模板没有选择性，特异性不强。

3.应用环境监测：目前应用实时定量荧光PCR方法已对水资源及居家、办公环境中的大肠杆菌、藻青菌和一些寄生虫成功的进行了监测。

转基因生物中的应用：在转基因植物中，需要考查阳性植株中外源基因的拷贝数，因为拷贝数通常会影响基因的表达和后代性状的表现。

应用实时定量荧光PCR也可以对基因的拷贝数作测算，即用一个已知拷贝数的内源基因作为参照，同时对样品作内源基因和外源基因的实时荧光定量PCR，通过两者达到荧光阈值时的CT值便可得到外源基因的拷贝数。

实时荧光定量PCR技术详解及总结

实时荧光定量PCR技术详解及总结实时荧光定量PCR技术的原理是基于PCR扩增过程中的荧光信号变化。

在PCR过程中，当荧光标记的探针与待扩增模板的特定序列结合时，荧光信号增加。

通过实时监测PCR反应体系中荧光信号的强度变化，可以定量计算起始模板数量。

与传统PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术具有更高的灵敏度和准确性。

实时荧光定量PCR技术在现代生物学研究中有广泛的应用。

首先，它被广泛应用于基因表达分析。

通过检测特定基因的mRNA水平，可以揭示基因在生物体内的表达情况及其调控机制。

其次，实时荧光定量PCR技术在病原微生物的检测和分析中也发挥了重要作用。

例如，可以利用实时荧光定量PCR技术检测病毒、细菌等病原微生物的存在，并确定其数量，这对于疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。

此外，该技术还常用于遗传多态性的分析、基因突变的检测、DNA甲基化的检测等。

相对于传统PCR技术，实时荧光定量PCR技术具有多项优势。

首先，实时荧光定量PCR技术具有更高的灵敏度。

实时荧光定量PCR技术可以实时监测扩增反应的进程，不仅可以提供扩增过程中的荧光信号变化曲线，还可以精确计算起始模板数量，从而实现对少量模板的高灵敏度检测。

其次，实时荧光定量PCR技术具有更高的准确性。

实时荧光定量PCR技术通过测量荧光信号，可以排除PCR反应中的假阳性结果，并准确计算起始模板的数量，从而提高了实验结果的准确性。

此外，实时荧光定量PCR技术的操作流程简单、快速，并以其高通量特点被广泛应用于高通量筛查和生物信息学研究中。

总结而言，实时荧光定量PCR技术是一种重要的分子生物学技术，它通过结合PCR扩增和荧光探针技术，实时监测和定量DNA扩增过程中的荧光信号变化，以实现对目标DNA序列的高灵敏度、高准确性的定量分析。

该技术在基因表达分析、病原微生物检测、遗传多态性分析等领域具有广泛应用。

实时荧光定量PCR技术的发展和应用，为生物学研究和临床诊断提供了重要的工具和方法。

实时荧光定量PCR方法简介

实时荧光定量PCR方法简介一．实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。

但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。

因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性.如采用常规的终点检测法（利用EB 染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量),即使起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。

为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数-—Ct值,定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。

Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行,定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。

Ct值的定义Ct值中的“C”代表Cycle（循环）,“t”代表检测threshhold(阈值）,其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。

Ct值与样品中模板的对应关系Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系(y=ax+b,x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。

与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数,该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确,重复性也更好。

传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少,从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。

下图中是96个复孔的实时扩增曲线(完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度)，可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。

实时荧光定量PCR仪

实时荧光定量PCR仪仪器原理及应用实时荧光定量PCR仪是一种基于PCR技术的分子生物学仪器。

它可以实时监测PCR 反应过程中的荧光信号，从而实现对靶标DNA的定量分析。

该仪器的原理基于原始的聚合酶链式反应（PCR）技术，通过PCR产生的DNA序列与特定荧光探针的结合，释放出荧光信号进行定量测量。

实时荧光定量PCR仪在生物医学研究、基因表达分析、病原体检测等方面具有广泛的应用。

通过该仪器，科研人员可以快速、准确地检测靶标DNA的含量，并获得相应数据用于后续分析。

仪器特点实时荧光定量PCR仪具有以下几个特点：1. 高灵敏度实时荧光定量PCR仪可以检测非常低浓度的靶标DNA，甚至达到单个分子的级别。

这一特点使得该仪器在医学诊断和疾病早期检测中具有很大潜力。

2. 高准确性该仪器采用荧光定量技术，能够实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而避免了传统PCR反应后的测量误差。

同时，实时荧光定量PCR仪还具有内标校正功能，能够准确地计算出靶标DNA的含量。

3. 广泛应用实时荧光定量PCR仪在生物医学领域有着广泛的应用。

它可以用于基因表达分析、病原体检测、遗传疾病的检测等方面。

同时，该仪器还可以应用于农业科学、环境监测、食品安全等领域。

使用方法使用实时荧光定量PCR仪进行实验需要以下步骤：1. 样本制备首先需要从待测样品中提取目标DNA，并进行纯化和扩增。

这一步骤可以根据具体实验目的选择不同的提取方法。

2. 反应液的配置将所需的PCR反应药物配置出合适的反应液。

其中包括靶标DNA的引物和荧光探针，以及聚合酶和其他辅助物质。

3. 仪器设置将PCR反应液加入到实时荧光定量PCR仪的孔板或管条中，然后将样品放入仪器中。

根据实验需要设置合适的温度和时间条件。

4. 实时检测启动仪器后，开始进行PCR反应和实时荧光检测。

仪器会不断地记录PCR反应过程中的荧光信号，并将数据输出保存。

5. 数据分析使用相应的分析软件对实时荧光定量PCR仪的输出数据进行处理和分析。

实时荧光定量PCR概述

2、探针类（TaqMan探针法）
荧光定量 PCR
方法的确定
荧光曲线与标准曲线的
制作
方法
目的基因的查找和比对
引物、探针的设计
1.反应体系的配置 2.反应条件的设定 3.反应体系条件的
优化
标准品的制备
引物、探针的
合成
待测品的制备
通过标准曲线对数据进行分析
1、荧光定量PCR方法和荧光标记素的选择与确定
按荧光产生的原理有两种方法：荧光探针法和荧光染料法。
染料法利用SYBR Green分子产生的荧光信号来进行样品定量。与常规PCR 类似，唯一区别是在反应体系中加入了SYBR Green染料分子。
探针法：与常规PCR的不同之处在于：在上下游引物外还加入了让具有序列特异性的探针（探针本身具有荧光标记），该探针根据需要扩增的靶序列设计因此只能与待检测序列结合，与染料法相比，提高了实验的特异性。目前市场上探针多样，其中以TaqMan探针应用最为广泛。
72℃ 延伸 30s ↓
72℃ 终延伸 5min
扩增30-40个循环
(3)、反应体系和条件的优化
♦酶浓度 ♦Mg+浓度 ♦dNTP浓度 ♦上、下游引物浓度 ♦探针浓度 ♦退火温度、退火时间和循环数 ♦DNA模板浓度
6、荧光曲线与标准曲线的制作
通过原理可知：总的荧光信号=本底信号 + 分子数 × 单位信号强度
的技术仍有需要改进的地方。
优点
特异性高：荧光探针的使用相当于在PCR的过程中自动完成了
Southern印迹杂交，进一步提高目的基因检测的特异性。
灵敏度高：光谱技术与计算机技术的联合应用提高了灵度，有效的
减少了劳动量，荧光定量PCR使用氩激光来激发荧光的产生，利用荧光探测仪检测荧光信号，通过计算机进行数据分析灵敏度达到了极限，可以检测到单拷贝的基因这是传统的PCR难以做到的。其灵敏度可检测到 400 个分子的 mRNA。