肠道病原菌分离与鉴定二
病原菌分离培养与鉴定
细 菌 专性厌氧菌
纯
培
养 兼性厌氧菌 物
鉴 定
的
鉴
需氧菌
定
形态和染色 菌落特征 生化试验 药物敏感试验 毒力试验 病原菌抗原 生物芯片检测
（四）生物芯片技术
将核酸片段、蛋白质或酶、抗原或抗体、细胞及组织 等生物样品有序地固定于硅片、尼龙膜等固相支持物上 在一定的条件下进行生化反应。 用化学荧光法、酶标法或同位素法显示反应结果， 通过特定的仪器读取与收集数据，并用软件进行数据 分析，从而判断样品中靶分子的种类和数量。
1929 – Penicillin discovered
1930s– Sulfa drugs discovered
1969 – US surgeon Gen, claims end infectious diseases
Today – Bacteria with multi-drug resistance
Fleming Domagk
一、抗菌药物的杀菌机制
• 抑制细菌细胞壁的合成：青霉素、溶菌酶等 • 影响细菌胞浆膜通透性：多粘菌素等抗生素 • 抑制细菌蛋白质的合成：红霉素、链霉素等 • 抑制细菌的核酸代谢：利福平等抗生素 • 抑制细菌的叶酸代谢：磺胺类等抗生素
Cell wall synthesis
collection and transportation of specimen
避免杂菌污染
标本的采集和送检六原则
不同期不同标本 用抗生素以前
采集病变明显部位
标本必须新鲜
运送注意保存
细菌感
（二）病原菌分离培养与鉴定：形态学检查
不染色检查法 压滴法 悬滴法 暗视野显微镜法
检查用仪器 普通光学显微镜 light microscope 暗视野显微镜 dark-field microscope 荧光显微镜 fluorescence microscope ……
肠道病原菌的分离与鉴定
原理
该培养基中只加少量的葡萄糖与较多量的乳糖。细菌分解 糖类产酸可使培养基局部指示剂改变颜色。当分解葡萄糖 的细菌在斜面上生长时,产生的酸少,又在有O2的情况下氧 化,生成CO2和H2O,失去改变局部酸碱度的作用,所以培养 基斜面部分不变色。但当细菌分解乳糖时产生酸量较多, 故培养基斜面部分可变色。细菌在高层中生长时,因处于 无O2状态,产生的酸不分解,故使高层部分培养基指示剂变 色。硫酸亚铁可与产生的H2S作用,生成FeS使培养基变黑。 硫代硫酸钠是一种还原剂,防止培养基中氧化物与H2S作用 而影响FeS的生成。
血清学鉴定
(1)沙门氏菌属 取一载玻片与沙门氏菌属、群、型血清做玻片凝
集试验。 ①取可疑培养物,先与A--E群沙门氏菌多价O血清
做凝集试验,阳性者认为该菌属于沙门氏菌属。 ②用沙门氏菌属各群特有的单价O因子血清做凝
集反应,可判定其属于沙门氏菌属何群。 ③用该群内各菌所特有的H因子血清作玻片凝集
反应,可最后判定为何种菌。
肠道病原菌的分离与鉴 定
肠道病原菌的分离鉴定(3) 细菌的药敏实验结果观察 厌氧菌培养法及厌氧菌生长状态 小白鼠感染肺炎球菌实验结果观察 细菌致病性试验
双糖铁培养基的制备
成分:脲 胨、乳 糖、蛋白胨、葡萄糖、硫酸亚 铁、氯化钠、硫代硫酸钠、琼脂、蒸馏水、酚红 水溶液
制法:加热溶解校正pH为7.2,然后加入0.4％酚红 水溶液,分装试管,高压灭菌,使成为底层较深的斜 面。
生化反应结果观察
菌名
阿
葡 萄 糖
乳 糖
麦 芽 糖
甘 露 醇
蔗 糖
靛 基 质尿 素Βιβλιοθήκη 硫 化 氢拉 伯 胶
肠道菌的分离培养与鉴定PPT课件
3．结果 产酸产气时，可使培养基的指示 剂变色，并可在发酵管内顶端出现气泡； 只产酸时仅见发酵管内培养基颜色改变， 不见气泡；不分解者无反应。如大肠杆菌 分解乳糖产酸产气；用“㈩”表示，金黄 色葡萄球菌虽能分解乳糖，但产酸不产气， 用“+”表示；马流产沙门氏杆菌不能分解 乳糖，用“一”表示。
22
实验三 肠道菌的分离培养与鉴定
目的要求： 1．熟悉选择和鉴别培养基的原理； 2．了解大肠杆菌的主要培养特性； 3．熟悉大肠杆菌和沙门氏菌的常规鉴定方
法；
1
基本原理
肠道菌大多为革兰氏阴性小杆菌，
采用一般染色和分离培养难以鉴别，故须
采用鉴别和生化试验培养方能鉴定。不同
种类的肠道菌，产生的酶类及活性不同。
培养方法，其原则在于使被检材料充分分 散，以便经过培养后得到单个菌落，并可 对菌落的形态、颜色、溶血与否等进行观 察。
5
术式
右手似持毛笔的姿势持接种棒的塑料柄处， 将接种环伸人酒精灯火焰中烧至通红，再 缓慢将接种棒其余金属部分均加以烧灼， 准备蘸取材料；左手取琼脂平板，琼脂面 与水平面成45°角，接种环同培养基平面 也成45°角。靠近酒精灯火焰操作。
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2．方法
将需要鉴别的肠道菌（大肠杆菌和沙门氏 菌）或含肠道菌的病料，在康凯琼脂培养 基上划线分离，37℃培养24h观察。使之得 到单个菌落。
3．结果 大肠杆菌在此培养基上形成红色 菌落，沙门氏菌形成无色或浅黄色菌落。
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（二）SS琼脂培养基分离培养
1．原理 此培养以中性红作批示剂，其中 还有胆盐硫代硫酸钠，构椽酸钠，煌绿等 等抑制G+的生长，对大肠杆菌了有一定的 抑制作用，只有少数生长。培养基中含有 乳糖，在大肠杆菌能分解乳糖，产酸，指 示剂显红色（5.0-7.4 红—黄），故大肠杆 菌呈红色菌落，而沙门氏菌不能分解乳糖， 没能使培养基变酸呈黄色菌落。
肠道病原菌的分离与鉴定
高压蒸汽灭菌器
(二)普通琼脂培养基
材料:肉水、蛋白胨、氯化钠、琼脂、无菌平皿、 灭菌试管、三角烧瓶等。
方法
1．按上记数量把肉水、蛋白胨、氯化钠和琼脂 放到三角烧瓶中,加热溶化。
2．用纸测酸碱度,用10％碳酸氢钠校正pH 为7.2左右。
3．15磅高压蒸气灭菌20～30min。
4．趁热将溶化的培养基倒入灭菌平皿内,每个平 皿倒入约15ml,凝固后即成普通琼脂平板培养基; 如趁热将培养基倒入灭菌试管内,再将试管斜放试 验台上,凝固后即成普通琼脂斜面培养基。
(三)血液琼脂培养基
有些细菌其营养要求较高,在普通琼脂培养基上生长 不良,可用血液琼脂培养基进行培养。 材料
① 普通琼脂培养基
② 血液(脱纤维羊血或兔血) 方法
1．加热溶化普通琼脂培养基。 2．待冷至50℃左右时,加入无菌的脱纤维血液,混匀(注 意勿使产生泡沫)。 3．分注于灭菌试管或平皿中制成血斜面和血平板培养 基。
方法
本实验四人一组,每人取6只小试管,排成一列,计四列为一 完整试验。分别标明每列管号和诊断菌液如“O”、 “OH”、“PA”、“PB”。按下表先向每管加生理盐水 0.5ml,再加10倍稀释病人血清0.5ml于第l管,做顺序的等 倍稀释,最后加入等量的诊断菌液,充分混匀,置37℃ 2~4h, 再放室温24小时后观察结果。
肠道病原菌的分离与鉴 定
培养基的制备及常用培养基 细菌的培养法
EMB培养基的制备 肠道病原菌的分离与鉴定(一) 血清学检测-肥达氏反应
培养基的制备
(一)肉汤培养基 材料:鲜牛肉、蛋白胨、氯化钠、pH试纸、10％碳酸氢钠、试
管、三角烧瓶、蒸馏水等。 方法
1．将新鲜牛肉500g切碎或搅碎,加水1000ml,放4℃冰箱或冷处 浸泡过夜,然后煮沸30min,放凉,使残余的脂肪凝固,再用绒布或 滤纸过滤,将滤液补足为原量。 2．1000ml肉水中加入蛋白胨 10g、氯化钠5g,加热溶解。 3．用精密pH试纸测酸碱度,用10％碳酸氢钠校正pH为7.2左右。 过碱时,可用10％醋酸校正之。 4．分装于试管中或三角烧瓶中,15磅(121℃)高压蒸气灭菌20～ 30min。
微生物实验 肠道病原菌的分离与鉴定
【目的要求】
1.熟悉粪便中肠道杆菌的分离与鉴定程序。 2.了解肠道杆菌生化反应、免疫学检测原理、结果和意义。 3.掌握肠道杆菌的生物学性状。
粪便标本中致病性肠道杆菌的分离与鉴定程序
粪便标本
涂片，染色，镜检 （意义不大）
双糖铁培养基
SS培养基
生化反应： IMViC
药敏试 验
伤寒沙门菌
三、肠道杆菌的生物学性状--志贺菌
志贺菌
【实验报告】
记录粪便标本病原菌的分离与鉴定的步骤及结果。
大肠埃希菌
Rod-Shaped Bacterium, E. coli (division) (SEM x22,245) E. coli (0157:H7) a rod prokaryote. Hemorrhagic type
E. coli with fimbriae
三、肠道杆菌的生物学性状--伤寒沙门菌
血清学 试验
PCR试 验
一、上节课实验结果
1.SS琼脂平板结果及初步推断
结果： 平板上有几种菌？
ห้องสมุดไป่ตู้
二、本节课实验内容
1.双糖铁培养基结果观察 细菌动力，对葡萄糖和乳糖发酵的情况，是否产生硫化氢？
原始管
反应管
双糖铁培养基结果
菌名 大肠埃希菌
葡萄糖 （底层）
⊕
痢疾杆菌
+
伤寒沙门菌
+
肖氏沙门菌
⊕
乳糖 （斜面）
氨苄西林
氨苄西林
敏感 中介 耐药 10ug >=17 13--16 <=14
复方新诺明
>=16 9--15 <=10
复方新诺明
粪便标本中肠道病原菌的分离与初步鉴定
实验指导教师：李波清 副教授
一、实验目的
掌握粪便标本中肠道致病菌分离的基本 程序与方法 掌握肠道致病菌的初步鉴定 熟悉粪便标本中肠道致病菌分离与初步 鉴定的操作
二、实验原理
选择性或（和）鉴别性的培养基：此类培 养基中除含有细菌所需的营养物质外，还 含有抑菌剂和指示剂。可选择性抑制肠道 致病菌以外其他细菌的生长，指示剂则可 用以鉴别细菌的生化特性。
四、实验结果
IMViC实验结果
I
大肠杆菌 +
沙门菌
-
志贺菌
+/-
M
V-P
C
+
-
-
+
-
+/-
+
-
-
四、实验结果
双糖铁发酵实验结果
乳糖 葡萄糖 动力
大肠杆菌 黄色
+
痢疾杆菌 红色 +
-
伤寒杆菌 红色 +
+
副伤寒杆菌 红色
+
变形杆菌 红色
+
硫化氢 +/+ +
五、结果及讨论
IMViC实验主要用于哪种肠道菌的初步 鉴定？ 双糖铁发酵实验主要用于哪些肠道菌的 区别？ 标本采集中应注意的问题有哪些？
SS平板－分离肠道致病菌的强选择培养基
成分和作用：
1. 基础培养基：提供氮源和碳源 2. 胆盐、枸橼酸钠、煌绿：可抑制肠道非致病
菌的生长，而对肠道致病菌抑制作用弱。 3. 乳糖，中性红（pH6.8-8.0，红→橙黄） ：
致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨产生碱性 物质→菌落淡黄色；大肠杆菌分解乳糖产酸， 菌落呈红色
常见肠道致病菌的分离与鉴定
6.副溶血弧菌
将粪便标本接种于弧菌增菌液中，6~8小时接种 TCBS平板，同时接种TCBS平板，35°C培养18~24 小时，检查有无呈绿色或蓝色中心，圆形，直径 2~3mm的菌落，挑取可疑菌落接种克氏双糖铁和尿 素动力靛基质培养基进行初步生化鉴定，最后采用 商品化鉴定系统鉴定至种。
7.艰难梭菌
二、培养与鉴定
医院中引起的腹泻一般不会是感染了食源性病原 菌引起，故对于住院超过3天的患者的粪便标本不 进行常规培养，除非是为了分离艰难梭菌和测定毒 素以诊断抗生素相关性腹泻。
1．沙门、志贺菌属菌培养
黏液、脓血便接种于SS琼脂平板或XLD琼脂平板和麦 康凯（MAC）琼脂平板（或中国蓝琼脂平板）以及血平板， 35℃孵育18～24小时，挑取不发酵乳糖菌落，至三糖铁琼 脂初步观察生化反应并进行血清学凝集试验。可根据生化反 应结果初步判断细菌菌属，再根据血清学鉴定结果鉴定至种
不染色标本
1．霍乱弧菌感染 标本呈米泔样或洗肉水样，镜检发现逗点状或弯曲 状的弧菌，呈流星样穿梭，运动活泼。加入O1群或O139群霍乱弧菌 多价诊断血清，大于80%的细菌停止运动或运动明显减弱 2．弯曲菌感染 呈S形、螺旋形并快速、拧塞样或投镖样运动的细菌 3．酵母样真菌感染 高倍镜发现光亮的卵圆形孢子或假菌丝
标本的运送
1．标本采集后应尽快送检 室温保存≤2小时 2．特殊细菌 艰难梭菌培养标本在4℃环境≤ 24小
时；弯曲菌与弧菌的标本需加入CaCl2(100mg/L) 3．置于运送培养基中的直肠拭子保存时间室温≤
24小时
标本验收
检查申请单信息填写是否完整、正确，包括标 本采集时间、采集方式、抗生素使用情况、标本 量是否足够、标本容器有无渗漏等
标本拒收
1．粪便标本放置时间超过2小时 2．成形粪便或粪便标本混有尿液 3．粪便标本量过少、干涸或保存不当 4．直肠拭子未置于运送培养基中应及时与临床医师联系， 说明原因，要求重新留取标本送检
病原体分离与鉴定实验技术
病原体分离与鉴定实验技术病原体分离与鉴定是微生物学研究中的重要环节，其结果对于疾病的诊断、预防和治疗具有重要意义。
本文将介绍一些常用的病原体分离与鉴定实验技术。
一、细菌的分离与鉴定1. 样本采集与处理首先，我们需要从患者的体液、组织或病灶中采集样本。
常见的样本包括血液、尿液、痰液、伤口分泌物等。
采集后，样本需要进行适当的处理，如离心沉淀、过滤等，以获取纯净的菌种。
2. 培养与分离将经过处理的样本接种于含有适宜营养物质的培养基上，并进行适当的培养条件，如温度、湿度等控制。
通过观察培养的菌落形态、色素、气味等特点，选择单个菌落进行分离。
3. 形态学鉴定通过显微镜观察菌体的形态特点，如形状、大小、结构等，可以初步判断细菌的分类。
4. 生理生化鉴定细菌具有各种代谢特点，可通过测定其对营养物质的利用能力、产酶能力、产气或产酸能力等特性，进行病原菌的初步鉴定。
5. 血清学鉴定血清学鉴定是通过观察病原菌与抗血清或其他特定蛋白质结合反应，来确定病原菌的种属或亚种属。
该方法常用于鉴定沙门菌、流感嗜血杆菌等。
二、病毒的分离与鉴定1. 细胞培养法病毒的分离最常用的方法之一是细胞培养法。
将待测样本接种于合适的细胞系，并观察细胞的形态变化、细胞的病变以及病毒是否复制等现象，可以初步判断是否存在病毒感染。
2. 核酸扩增技术核酸扩增技术是近年来病毒鉴定的重要方法之一。
通过PCR、实时荧光定量PCR等技术可以快速、准确地检测病毒的核酸序列，从而进行病毒的鉴定。
3. 血清学检测病毒感染后，机体会产生特异性的抗体。
通过血清学检测，可以检测患者血清中是否存在特定病毒的抗体，从而进行病毒鉴定。
三、真菌与寄生虫的分离与鉴定1. 样本采集与处理对于真菌和寄生虫的分离与鉴定同样需要采集患者的组织、分泌物等样本，样本的处理与细菌类似，需要消毒、离心等步骤。
2. 培养与分离将样本接种于含有适宜营养物质的培养基上，并进行适当的培养条件控制，如温度、湿度等。
肠道致病菌分离与鉴定虚拟仿真实验教学系统建设与实践
基金项目： 安徽省高等学校质量工程项目（２０１５ｘｎｚｘ０３０）作者简介： 王晓楠，女，１９８２－０６生，硕士，实验师，Ｅ ｍａｉｌ：ａｙｄｗｘｎ＠１２６．ｃｏｍ收稿日期： ２０１８－０５－１０肠道致病菌分离与鉴定虚拟仿真实验教学系统建设与实践王晓楠，李京培，唐媛媛，刘莉茵，杨 晨，李 群△ （安徽医科大学基础医学院病原与免疫学实验室， 合肥 ２３００３２； △通讯作者）摘要： 将微生物学专业实验体系和现代化的虚拟仿真技术相结合，开展虚拟仿真实验教学是信息化教学的必然趋势。
文章分析了微生物学中肠道致病菌传统实验教学的不足，阐述了肠道致病菌分离与鉴定虚拟仿真实验教学系统的建设和教学模式。
系统涵盖肠道感染理论知识、实验操作视频和虚拟临床病例实训，将经典的微生物学实验与临床病例紧密结合。
该系统应用于实践教学后，培养了学生的实验操作技能及科研创新能力，拓宽了以课堂为中心的教学模式，是传统实验的有效补充。
关键词： 微生物学； 实验教学； 虚拟仿真中图分类号： Ｒ３７ 文献标志码： Ａ 文章编号： ２０９５－１４５０（２０１８）１０－０９０４－０４ ＤＯＩ：１０．１３７５４／ｊ．ｉｓｓｎ２０９５－１４５０．２０１８．１０．３１ 教育信息化已经成为当今教学改革发展的趋势，以网络为基础的各种学习也逐渐进入国内的各个高校。
虚拟仿真实验利用虚拟现实、多媒体、数据库和网络等技术，可以突破传统实验教学时间、空间以及生物安全问题等实验条件的限制，构建高度仿真的实验环境［１］，通过人机交互及网络通讯等技术模拟实验操作的流程和场景。
微生物学是一门实践性很强的科学，其理论是建立在实验基础之上的，实验操作也是医学生必须学习并加深掌握医学知识的重要途径［２］。
微生物学的实验是技术和经验性质的，往往需要反复操作实践才能收到满意的效果［３］。
虚拟仿真实验在有限的学时、经费内为学生教授普通实验教学无法进行的又十分常用、重要的微生物学实验项目，对于实践操作很强的微生物学的学习将起到越来越重要的作用［４］。
肠道病原菌的分离与鉴定实验报告
肠道病原菌的分离与鉴定实验报告摘要本实验旨在分离、鉴定肠道病原菌，并深入了解肠道病原菌对人们健康的影响。
本实验采用选择性培养基和生化试剂对样品进行处理和鉴定，最终成功分离出大肠杆菌、沙门菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等肠道病原菌。
引言肠道病原菌是导致肠胃疾病的主要病因之一。
一些细菌和病毒都可引起肠道感染，导致腹泻、呕吐、腹痛等不适症状。
有些肠道病原菌很难通过常规的培养方法进行分离和鉴定，因此对于其鉴定至关重要。
在临床和实验室中，肠道病原菌的鉴定是非常重要的。
在本实验中，我们将通过选择性培养基和生化试剂来分离和鉴定肠道病原菌。
材料与方法实验所需材料：-食品样品（牛肉、猪肉、家禽产品等）-选择性培养基（MacConkey agar, SS agar, XLD agar）-氯霉素（50μg/ml）-β-半乳糖苷酶-生化试剂（甲基红、青田霉素、麦芽糖、尿素、甲酸氢钠、甲酸亚铁、碳酸氢铵、硫代硫酸钠、氧化亚铁、硫酸铜、氯化铵、硝酸钴、聚苯乙烯乳胶、过氧化氢）实验步骤：1. 食品样品的处理：将样品切成小块，加入100 ml的含氯霉素（50μg/ml)的生理盐水中，放在室温下搅动10分钟，再将悬浮液离心10分钟，取沉淀制备10倍连续稀释液备用。
2. 分离培养：取三个不同的选择性培养基MacConkey agar、SS agar和XLD agar，分别接种均匀悬浮液并用无菌环展开，然后使其在37℃恒温箱中孵化24小时。
3. 生化识别：观察菌落的形态、颜色和表面涂膜，并用生化试剂行革兰染色、甲基红反应、青田霉素试验、尿素酶试验、甲酸氢钠氧化试验、甲酸亚铁还原试验、碳酸氢铵水解试验、硫代硫酸钠还原试验、氧化亚铁试验、硫酸铜凝集试验、氯化铵水解试验、硝酸钴试验、聚苯乙烯乳胶凝聚试验和过氧化氢试验，根据结果进行分类鉴定。
结果经过实验分离和鉴定，本实验成功分离出大肠杆菌和沙门菌等常见的肠道病原菌，并且还分离出一株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
粪便标本中肠道致病菌的的分离鉴定
实验十粪便标本中肠道致病菌的的分离鉴定实验目的和要求1、掌握脓汁标本中常见病原菌分离和鉴定方法2、掌握药物敏感试验3、掌握肠道杆菌分离和鉴定的一般步骤4、熟悉肠道杆菌鉴定生化反应和血清学反应实验内容一、脓汁标本中未知病原菌的分离和鉴定二、粪便标本中肠道致病菌的分离和鉴定一、标本中未知病原性球菌的分离鉴定程序直接涂片染色镜检：观察细菌形态、排列、染色性观察菌落性状、溶血性、色素血琼脂平板涂片、染色、镜检挑取可疑菌落生化反应测定纯培养致病性测定（甘露醇、凝固酶等）标本血液脑脊液肉汤增菌培养涂片染色镜检二、标本中未知肠道感染细菌的分离鉴定程序标本脓血便、肛拭子选择/鉴别培基生化反应血清学鉴定克氏双糖铁培养基,动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基玻片凝集试验SS平板,EMB平板设计性实验临床标本中病原菌的分离与鉴定设计性实验1.脓汁标本：脓拭子培养基：血琼脂平板其他：3%H2O2、（兔血浆）、生理盐水、革兰染液、玻片等2.痰标本：咽拭子培养基：血琼脂平板其他：生理盐水、10%胆盐、革兰染液、玻片等3.尿标本：尿液培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基其他：革兰染液、靛基质试剂、玻片等4.粪便标本：肛门拭子培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血清、志贺菌多价血清、玻片等脓拭子分离培养革兰染色（血平板）革兰染色触酶实验甘露醇实验方法：•1、分离培养、观察菌落特征：浓汁标本，用分离划线方法接种血平板，37℃培养18-24h以后观察结果。
重点：色素和溶血现象•2、革兰染色、观察形态学特征：取可疑菌落少许涂片，革兰染色、镜检。
结果观察•1、菌落观察•2、形态学观察（二）生化反应•触酶试验：(-) (+)H 2o 2H 2o o 2氧化氢酶+菌种：可疑菌落试剂：3%过氧化氢方法：见右图结果：见右图甘露醇实验•甘露醇生化反应管药敏实验浓汁标本可疑菌生长现象及生化反应结果观察形态学特征血平板生长现象触酶试验甘露醇试验结论：现象与论点、论据浓汁标本可疑菌药敏实验结果药品名称抑菌圈直径结论：咽拭子革兰染色革兰染色胆汁溶菌试验奥普托辛试验荚膜染色（石炭酸复红单染）分离培养（血平板）？粪便标本SS平板克氏双糖铁斜面培养基动力-半固体培养基生化反应管观察结果糖发酵试验玻片凝集试验革兰染色H2S试验尿液离心沉淀1500转，10分钟分离培养（EMB平板）革兰染色革兰染色克氏双糖铁斜面培养基动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基观察结果观察结果观察结果完成靛基质试验方法：•1、分离培养、观察菌落特征：粪便标本，用分离划线方法接种SS平板培养基37℃培养18-24h以后观察结果。
实验肠道致病菌分离鉴定
镜检：球阳杆阴 阳紫阴红
第9页，本讲稿共22页
葡 萄 球 菌
链 球 菌
第10页，本讲稿共22页
（2）触酶实验
原理：产生过氧化氢酶的细菌，能催化过O2
2H2O+O2
操作步骤：
在洁净玻片上滴一滴生理盐水，用接种环取少许细菌培养物与
生理盐水中乳磨均匀，然后加3％过氧化氢数滴；或直接滴加3 ％过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。
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观察上次实验结果、进行分析
紫外线杀菌实验
第4页，本讲稿共22页
抗生素敏感试验
抑菌圈直径
第5页，本讲稿共22页
如果细菌对药物敏感，则在药片周围有抑菌圈形成， 敏感度越高抑菌圈直径越大：
>20mm：极度敏感 5-20mm：中度敏感
10-15mm：轻度敏感
<10mm: 不敏感 无抑菌圈: 耐药
本次试验以粪便为标本进行肠道菌的分离鉴定。粪便标 本中含有伤寒杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌以及大肠杆菌 等肠道菌，要求从标本中分离出单一的致病菌，并通过后 续的试验鉴定出致病菌。
第17页，本讲稿共22页
S.S琼脂培养基
S.S琼脂培养基中含有胆盐、煌绿和枸橼酸钠等成分 ，不仅能抑制G+菌的生长，也能抑制肠道非致病菌的 生长。
第13页，本讲稿共22页
2）操作：玻片法
▪ 取干净玻片一块
▪ 血浆及生理盐水各一滴，分别置于玻片两端
▪ 用接种环取细菌少许，分别与生理盐水及血浆充 分混匀
▪ 结果观察：30秒钟内盐水中的细菌呈均匀浑浊，而 兔血浆则呈块状或颗粒状者为阳性。
第14页，本讲稿共22页
（4）甘露醇试验或血清肉汤接种
1）甘露醇发酵试验：
微生物实验 肠道病原菌的分离与鉴定
一、粪便标本致病性肠道杆菌的分离和鉴定程序
二、粪便标本致病性肠道杆菌的分离和鉴定
1.粪便接种SS（ Salmonella Shigella agar ）培养基
粪便四分区划线接种SS琼脂平板，37℃培养18-24小时。
大肠杆菌 痢疾杆菌 伤寒杆菌
SS平板 粉红色大菌落 无色细小 半透明菌落 无色细小 半透明菌落
实验九 粪便中病原菌的分离鉴定-1
【目的要求】
1.掌握肠道杆菌的生物学性状。 2.熟悉粪便中病原菌的分离鉴定程序。
病例回顾
某患者，女，45岁。于前日参加聚餐，昨日感觉腹部不适，今晨起有 发热、腹痛、水样腹泻，至下午就诊已腹泻5次，最后两次量不多，但有 黏液样物质带有血色。实验室检测：粪便检查发现有脓细胞5个，红细胞8 个；血液检测WBC14.5×109/L（4-10x109/L）。
2.可疑菌落穿刺接种双糖铁培养基 第2天观察SS培养基的培养结果并记录，挑取较小、无色、半
透明的可疑菌落穿刺接种双糖铁培养基，37℃培养18-24小时。 第3天取出双糖铁培养基放入冰箱，下次课备用。
原始管
反应管
三、肠道杆菌的生物学性状--大肠埃希菌
大肠埃希菌
Rod-Shaped Bacterium, 45) E. coli (0157:H7) a rod prokaryote. Hemorrhagic type
E. coli with fimbriae
三、肠道杆菌的生物学性状--伤寒沙门菌
伤寒沙门菌
三、肠道杆菌的生物学性状--志贺菌
志贺菌
【实验报告】
记录粪便标本接种SS培养基和双糖铁培养的结果，并对其进行初步判 断。
肠道病原菌分离与鉴定课件
样品保存：低温保存，防 止微生物生长
样品处理：稀释、离心、 过滤等
样品检测：使用微生物培 养基进行培养，观察菌落 形态和颜色，进行鉴定。
培养基的选择与制备
培养基类型：选择适合肠道病原菌生长的培养基，如 LB培养基、MH培养基等
培养基成分：根据肠道病原菌的生长需求，选择合适 的营养成分，如蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖等
培养基制备：按照一定的比例和顺序，将培养基成分 混合，并加入适量的水，搅拌均匀
灭菌处理：将制备好的培养基进行灭菌处理，如高压 蒸汽灭菌、紫外灯照射等，确保培养基无菌
培养条件的控制
02
03
04
气体环境：提供适当的气体 环境，如厌氧、微需氧等， 以满足不同细菌的需求
培养基：选择合适的培养基， 如LB培养基、MRS培养基 等
5
基因测序：通过基因测 序技术，确定细菌的基 因序列和特性
生化鉴定
生化反应：通过 酶促反应、氧化
还原反应等生化 1
反应进行鉴定
核酸分析：通过 4
核酸序列分析、 基因芯片等方法
进行鉴定
代谢产物：通过 分析代谢产物的
2 种类和含量进行
鉴定
3 蛋白质分析：通
过蛋白质电泳、 质谱分析等方法 进行鉴定
血清学鉴定
01
原理：利用抗原抗体反应进行鉴定
02
方法：ELISA、免疫荧光法、免疫沉淀法等
03
优点：快速、准确、灵敏度高
04
局限性：需要制备特异性抗体，成本较高
4
临床诊断
肠道病原菌的分离与鉴 定在临床诊断中的应用
肠道病原菌的分离与鉴 定在疾病诊断中的作用
肠道病原菌的分离与鉴 定在疾病治疗中的作用
肠道益生菌分离鉴定及应用研究
肠道益生菌分离鉴定及应用研究一、引言肠道微生物群落对人体健康的重要性日益受到关注，其中益生菌在维持肠道平衡、促进营养吸收和增强免疫功能等方面发挥着关键作用。
肠道益生菌的分离鉴定及应用研究成为了当前微生物学和医学领域的热门课题。
二、肠道益生菌的分离方法（一）样本采集要分离肠道益生菌，首先需要从健康个体的粪便样本中获取。
在采集过程中，需要确保样本的新鲜度和无污染，通常使用无菌容器进行收集。
（二）选择性培养利用特定的培养基来培养肠道微生物。
例如，一些益生菌如双歧杆菌和乳酸菌在特定的营养条件和环境下能够生长，而其他杂菌则受到抑制。
（三）稀释涂布法将样本进行一系列稀释，然后将稀释液均匀涂布在培养基上，以获得单个菌落。
（一）形态学鉴定观察菌落的形态、大小、颜色和边缘特征，以及菌体的形态、大小和排列方式等。
（二）生理生化鉴定检测微生物的代谢产物、酶活性、对不同物质的利用能力等生理生化特性。
（三）分子生物学鉴定通过 PCR 技术扩增特定的基因片段，如 16S rRNA 基因，然后进行测序和比对分析，以确定其种属。
四、常见的肠道益生菌及其功能（一）双歧杆菌能改善肠道微生态平衡，抑制有害菌生长，增强免疫力，还参与维生素的合成和营养物质的吸收。
（二）乳酸菌产生乳酸降低肠道 pH 值，抑制病原菌生长，促进钙、铁等矿物质的吸收。
（三）芽孢杆菌具有较强的抗逆性，能够调节肠道菌群结构，提高机体抗氧化能力。
（一）食品工业广泛应用于酸奶、奶酪、发酵乳等乳制品，以及饮料、保健品等产品中，为消费者提供营养和健康益处。
（二）医药领域用于治疗肠道疾病，如腹泻、便秘、炎症性肠病等。
还可作为辅助治疗手段，增强药物的疗效，减轻药物的副作用。
（三）畜牧业添加到动物饲料中，提高动物的生长性能、免疫力和饲料利用率，减少疾病的发生。
六、肠道益生菌应用的挑战与展望（一）挑战1、益生菌的存活和定植能力在经过胃肠道的复杂环境后，益生菌的存活数量和在肠道内的定植能力是影响其效果的关键因素。
粪便标本中肠道病原菌鉴别流程
粪便标本中肠道病原菌鉴别流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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在进行粪便标本中肠道病原菌鉴别之前，需要做好充分的准备工作。
肠道致病菌的分离与鉴定
肠道致病菌的分离与鉴定肠道致病菌的分离与鉴定一、实验目的（1）掌握肠道致病菌的分离、鉴定的主要步骤（2）掌握平板划线分离法（3）掌握玻片凝集试验的操作方法以及实际意义二、实验材料（1）实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、（2）实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基（EMB）、克氏双糖铁培养基（KIA）、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基三、实验流程（1）肠道致病菌的分离①待测标本的制作：把接种环放置于点燃的酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌的接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水的试管中，混匀。
②细菌的分离接种：用接种环取适量配置好的细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMB培养基。
将培养基置于37℃培养18~24小时。
（2）肠道致病菌的纯化①单菌落接种：从已培养待测细菌的EMB培养基上用已灭菌的接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37℃培养18~24小时。
②待测细菌的初步判断：取出已纯化培养待测细菌的KIA培养基，观察现象，初步断定该细菌是致病菌或是非致病菌。
（3）肠道致病菌的鉴定①生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管内的小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌的接种针取已培养的KIA培养基上的培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37℃培养18~24小时。
取出并观察记录现象。
（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌）②动力检查：用已灭菌的接种针取KIA培养基上的培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37℃培养18~24小时。
取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基中，并观察记录现象。
（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌）③血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌的接种环分别取KIA培养基上的培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。
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肺炎球菌对小白鼠的传染试验
实验动物的接种 1．首先将两种菌悬液做涂片，革兰色染色和镜检，以便与后 述死亡动物尸体的细菌学检查结果对比。 2．用消毒好的注射器，按无菌操作法抽取菌悬液后，再用无 菌镊子夹一灭菌棉花纸包，将针头刺入棉花纸包内，排出注射 器内的气体，然后将注射器平置于试管架上。 3．固定小白鼠：用右手轻拖鼠尾，使其爬行于金属网盖上， 再突然用左手拇食两指抓紧小白鼠颈项部及两耳，将鼠体搜入 手掌中，再用左手无名指和手掌夹住小白鼠尾根，以无名指和 小指夹住其左腿。
肠道病原菌分离与鉴定二
肥达氏反应结果观察
试验管自第1管看起，如有凝集(阳性反应)时则于管底呈圆片状、边缘 不整齐的凝集物，轻轻摇动，可见凝块或颗粒浮起，上清透明或有不同 程度的混浊。其凝集的强弱可用“+~++++”号表示如下： “++++” 细菌全部凝集，液体澄清，有大片状，边缘不整齐的凝集块。 “+++” 细菌绝大部分凝集，液体有轻度混浊，凝集块较小些。 “++” 细菌部分沉淀于管底，液体半澄清，凝集块呈颗粒状。 “+” 细菌仅少量凝集，液体混浊。 “-” 不凝集，液体混浊与对照管相似。
记录结果并判定凝集效价。通常以能产生明显凝集(++)的血清最大稀释 倍数做为该血清的凝集效价。
结果分析
首先应了解当地正常人效价，一般凝集价超过正常凝集价才有诊断意 义。
真正的伤寒病人O凝集素出现常较H凝集素为早，存在于血清内时间 较短；H凝集素产生较慢但效价较高，存在时间较长，可达数年。
过去曾接种过伤寒菌苗或患过伤寒病，近期又感染流感或布鲁氏菌病 时，可产生高效价的H凝集素及较低的O凝集素，此种反应称为非特 异回忆反应，其他如结核病、败血症、斑疹伤寒、肝炎等也可出现类 似反应。
确诊为伤寒的患者中，约有10％肥达氏反应始终为阴性，故阴性结果 不能完全排除伤寒的诊断。
采血时间不同，肥达氏反应的阳性率也不同，发病第一周50％，第二 周80％，第四周90％以上。恢复期凝集价最高，以后逐渐下降。一 般以双份血清(急性期和恢复期)对比，凝集价有明显培养平板上已选好的菌 落沾取细菌，反复交叉密涂于平板培养基上，以便生长出 均匀的菌苔(注意不要划破培养基)。 2．用沾酒精点燃灭菌的小镊子取药物纸片按下图贴于平 板培养基上，并轻轻按压贴紧。
3．做好标记，放37℃温箱培养过夜(不超过17h)。
结果观察
观察纸片周围有无抑菌环，并测其直径大小。最 终判断细菌对每种抗菌药物的敏感程度，记录和 报告结果。