质粒DNA的提取和鉴定-生物化学与分子生物学
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒dna的提取与鉴定实验报告质粒DNA的提取与鉴定实验报告引言：DNA是生物体内重要的遗传物质，其中质粒DNA作为细菌细胞外的环状DNA 分子，在基因工程、遗传学和生物技术研究中具有重要的应用价值。
本实验旨在通过提取和鉴定质粒DNA，探究其结构和功能。
材料与方法：1. 细菌培养液：含有质粒DNA的细菌培养物。
2. 离心管：用于离心细菌培养物。
3. 离心机：用于离心细菌培养物。
4. 细胞裂解液：用于破坏细菌细胞壁，释放质粒DNA。
5. 蛋白酶K：用于降解蛋白质，去除细胞核酸。
6. 高盐溶液：用于沉淀质粒DNA。
7. 乙酸：用于沉淀DNA。
8. 冷乙醇：用于沉淀DNA。
9. 紫外分光光度计：用于测定DNA的浓度和纯度。
10. 凝胶电泳仪：用于鉴定提取的质粒DNA。
实验步骤：1. 取适量细菌培养液，离心细菌培养物，收集菌体沉淀。
2. 加入适量细胞裂解液，充分混匀，使细菌细胞壁破裂，释放质粒DNA。
3. 加入适量蛋白酶K，降解蛋白质，去除细胞核酸。
4. 加入高盐溶液，使质粒DNA沉淀。
5. 离心沉淀，收集质粒DNA。
6. 加入适量乙酸和冷乙醇，沉淀DNA。
7. 离心沉淀，收集DNA。
8. 使用紫外分光光度计测定DNA的浓度和纯度。
9. 使用凝胶电泳仪鉴定提取的质粒DNA。
结果与讨论：通过实验，我们成功提取了质粒DNA，并进行了鉴定。
首先，通过紫外分光光度计测定，我们得到了DNA的浓度和纯度。
浓度的高低反映了提取的DNA量，纯度则表示DNA中杂质的含量。
高浓度和高纯度的DNA适合用于后续实验。
其次，通过凝胶电泳仪鉴定，我们观察到了DNA的迁移带，根据迁移带的大小和形状，可以判断DNA的大小和完整性。
此外，我们还可以通过与已知大小的DNA标准品对比，确定提取的质粒DNA的大小。
质粒DNA的提取与鉴定是基因工程和生物技术研究中的重要步骤。
通过提取质粒DNA，我们可以获取特定基因的DNA序列，用于进一步的分析和研究。
质粒DNA的提取及鉴定
实验1 质粒DNA提取及鉴定
1.含质粒DNA细菌于LB培养基中培养过夜，将菌液分装至EP
管中（1ml/支），离心去上清。
2.沉淀重悬浮100ul溶液Ⅰ（50 mmol/L葡萄糖、10mmol/L
EDTA、25mmol Tris-HCl pH8.0）中, 震荡混匀。
3.加入200ul新鲜配制的溶液Ⅱ（1mol/L NaOH 200ul、10%
SDS 100ul、H2O 700ul），颠倒混匀10次。
4.加入150ul溶液Ⅲ（29.4g KAc、11.5ml冰醋酸、加水至100ml）
颠倒混匀，冰浴5min，12000rpm离心10min。
5.上清移至另一干净EP管中，加入等体积饱和酚（约450ul）
充分颠倒混匀，12000rpm 离心10min。
6.上清移至另一干净EP管中，加入等体积酚/氯仿，颠倒混匀，
12000rpm离心10min。
7.上清移至另一干净EP管中，加入2倍体积冷无水乙醇混匀，
静置5min，12000rpm离心10min.
8.弃上清，用0.5ml 70% 乙醇洗涤DNA，弃上清，倒置干燥。
9.加入10ul TE，于1%琼脂糖凝胶电泳观察鉴定。
10.。
质粒DNA测定实验报告
质粒DNA测定实验报告⽣物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：⽣物化学与分⼦⽣物学实验教学中⼼实验名称质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定实验⽇期2014-12-11 实验地点第4实验室合作者指导⽼师评分教师签名批改⽇期⼀、实验⽬的1.掌握PCR基因扩增的原理和操作⽅法2.掌握碱裂解法提取质粒的⽅法3.了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、⽅法4.学习⽔平式琼脂糖凝胶电泳操作⼆、实验原理（⼀）、第⼀部分聚合酶链式反应1.PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退⽕、延伸等步骤，在体外复制DNA 的过程。
1)加热使模板DNA，在⾼温下90℃-95变性，双链解链；2)降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,⼀般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退⽕形成部分双链；3)溶液反应温度升⾄中温72℃，在Taq酶作⽤下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的⼀条单链在解链和退⽕之后延伸为⼀条双链。
（⼆）、第⼆部分质粒DNA提取与定量1.质粒（Plasmid）1)独⽴于细菌染⾊体外，能独⽴⾃主复制的闭合环状DNA分⼦；2)存在于细菌，放线菌，真菌以及⼀些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。
2.碱裂解法、1)基于染⾊体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异；2)⾼碱性条件下，染⾊体DNA和质粒DNA变性；3)当以⾼盐缓冲液调节其pH值⾄中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染⾊体DNA不能复性⽽形成缠连的⽹状结构，通过离⼼形成沉沉淀去除。
3.离⼼层析柱1)硅基质膜在⾼盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸附蛋⽩质、多糖等物质；2)通过去蛋⽩液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；3)低盐，⾼pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
4.紫外光吸收法1)物质在光的照射下会产⽣对光的吸收效应；2)⽽且物质对光的吸收是具有选择性的；3)各种不同的物质都具有其各⾃的吸收光谱。
实验七质粒DNA的提取和鉴定
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养 细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒 DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)
选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质 粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的 技术和实验要求
1. 1％Agrose gel的制备 2. 上样 3. 电泳 4. 紫外灯下观察和拍照
思考题
染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？
参考答案
纯化DNA的方法主要依据染色体DNA比质 粒DNA分子大得多，而且染色体DNA被断裂 成线状分子，但质粒DNA为共价闭环结构， 当加热或用酸、碱处理DNA溶液时，线状染 色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒 DNA在冷却和回到中性pH时即恢复其天然构 象
注意
EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应带 乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液 洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品， 必须进行清洗或弃去
3. 溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙 基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的 碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧 光。
为什么提取的质粒有三条带？
一 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（活化菌
种），37℃过夜培养。
2. 从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升液体培
10.50μL TE缓冲液，使DNA完全溶解（-20℃保存）
酶切鉴定
10μL溶液 + 10×内切酶缓冲液2μL + 5～10U酶到一Eppendorf
质粒DNA的提取和鉴定
质粒DNA的提取和鉴定背景资料如下：质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。
细菌质粒大小介于1～200Kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。
质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。
所以，SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。
释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境就会变性。
然后，用酸性乙酸钾中和溶液碱性使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性。
离心后，质粒DNA将留在上清中，染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。
通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。
测定DNA浓度的方法有两种：一是利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；一是利用溴化乙锭荧光强度法测定样品中溴化乙锭发射的荧光强度来计算核酸的含量。
（1）紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm处的吸收峰即可对DNA进行定量。
一般在中性pH环境条件下进行测定，此方法常用于测定比较纯净的DNA样品。
（2）溴化乙锭荧光强度法：溴化乙锭能与DNA结合并嵌入双链中，当受紫外光照射时会激发产生荧光，且荧光的强度与DNA含量成正比。
实验的准备：一、器材1.电泳仪（包括直流电源整流器和电泳槽两部分）2.台式离心机与高压灭菌锅3.超净工作台、摇床和各式加样枪二、试剂LB液体培养基（100ml），2个三角瓶√50ml离心管10ml离心管1.溶液Ⅰ√（右冰箱上层）50mmol/L葡萄糖10mmol/L EDTA，20mmol/L20mMTris-HCl pH8.0（50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与29.2 ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml）100mg/ml RNase A（抽质粒时现加）（右冰箱下层）溶液Ⅰ可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.859×104Pa）高压下蒸汽灭菌15分钟，40C冰箱贮存（注：不能将RNase A加入溶液Ⅰ中一起灭菌，RNase A用时现加）。
质粒dna的提取实验报告
质粒dna的提取实验报告引言：DNA是生命的基本遗传物质，研究DNA的结构和功能对于理解生命的本质具有重要意义。
在分子生物学实验中，质粒DNA的提取是一项关键步骤，它能够帮助我们获得足够纯度和数量的DNA样本，以便进行后续的实验分析。
本实验旨在提取质粒DNA，并验证提取效果和纯度。
材料和方法：1. 细菌培养：选择含有目标质粒的菌落进行预培养，接种至100ml含有适当抗生素的LB培养基中，37℃摇床培养过夜。
2. 提取质粒DNA：使用质粒DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作。
主要步骤包括细菌离心、细菌裂解、质粒DNA与蛋白质分离、质粒DNA沉淀和洗涤等。
3. DNA质量和浓度检测：使用紫外分光光度计检测提取得到的DNA样品的260nm吸光度值，计算DNA浓度。
结果和讨论：量和浓度的检测。
质检测结果显示，提取得到的质粒DNA纯度较高，吸光度比值（A260/A280）在1.8-2.0之间，说明DNA中没有明显的蛋白污染。
这对于后续实验如聚合酶链式反应（PCR）等有着重要的影响。
同时，我们还测定了DNA的浓度，得到了大致的目标值，为1μg/μl左右。
在实验过程中，我们需要注意一些关键点，例如细菌的培养条件、细菌离心和裂解的时间和速度、蛋白质分离的温度等。
这些因素都会对质粒DNA的提取效果产生影响，需要精确控制，保证实验结果的准确性。
质粒DNA的提取是分子生物学实验的常见步骤之一，其应用广泛。
例如，可以将提取得到的DNA用于质粒转染、DNA测序、基因克隆等研究中。
同时，提取得到的质粒DNA也可以用于分子诊断、疾病基因检测等临床应用。
结论：提取效果和纯度。
提取得到的DNA可以广泛应用于分子生物学及医学研究领域，为后续的实验工作提供了坚实的基础。
总结：质粒DNA的提取是分子生物学实验中不可或缺的一环。
本实验通过严谨的操作步骤和质量检测，成功地提取了高纯度、适量的质粒DNA。
在今后的实验工作中，我们将继续基于这些DNA 样本，进一步开展相关研究，推动科学的发展和创新。
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒dna的提取与鉴定实验报告一、实验目的本实验旨在了解质粒DNA的提取方法、鉴定方法及其应用，并掌握相应的实验操作技能。
二、实验原理质粒DNA是细胞内存在于细胞质中的一种环状双链DNA，通常具有自主复制和自主转录等特性。
提取质粒DNA主要采用碱裂解法，即通过加入碱性物质使细胞膜溶解，从而释放出细胞内的质粒DNA。
鉴定质粒DNA则需要使用凝胶电泳法，即将提取出的质粒DNA样品经过电泳分离，从而观察到不同大小和形态的质粒DNA带。
三、实验材料和设备1. 大肠杆菌菌株；2. 质粒抽提试剂盒；3. 1%琼脂糖凝胶；4. TAE缓冲液；5. DNA分子量标记物；6. UV透射仪；7. 手套、口罩等个人防护用品。
四、实验步骤1. 大肠杆菌培养：将大肠杆菌菌株接种于LB培养基中，在37℃下静置培养至菌液浑浊；2. 质粒DNA提取：按照试剂盒说明书进行操作，将培养好的大肠杆菌菌株经过离心分离出细胞沉淀，加入裂解缓冲液后进行碱裂解，最后使用洗涤缓冲液洗涤并提取质粒DNA；3. 凝胶电泳：将凝胶放置于电泳槽中，加入TAE缓冲液，将提取好的质粒DNA样品和分子量标记物混合后均匀加入凝胶孔中，进行电泳分离；4. 质粒DNA鉴定：在UV透射仪下观察凝胶板上的DNA带，并根据分子量标记物判断质粒DNA的大小。
五、实验结果通过实验我们成功地提取出了大肠杆菌中的质粒DNA，并通过凝胶电泳观察到了不同大小和形态的质粒DNA带。
根据分子量标记物我们可以初步估计出这些质粒DNA的大小范围。
六、实验总结本次实验掌握了质粒DNA的提取和鉴定方法，并成功地进行了实验操作。
同时也发现了实验中可能存在的问题和改进的空间，例如在质粒DNA提取过程中需要注意细胞沉淀的清洗和干燥等细节问题。
通过本次实验，我们对质粒DNA的应用和相关技术有了更深入的了解。
质粒DNA的提取和鉴定-生物化学与分子生物学
是否改变编码区的读框，是否发生两种性质差别较大的氨基酸替代，最好
的方法是测序。 现在有很多生物公司有此项服务，可将菌体或提取的质粒邮寄过去，一个 星期内就可获得测序结果。 可用生物软件Chromas查看测序结果，软件DNAMAN分析序列比对，观看 插入载体的外源片段是否与原基因序列一致。
观看测序结果的软件Chromas
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细 菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)选择哪一种方法主要 取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验 要求。
碱裂解法基本原理
葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部， EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金 属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制 DNase的活性，避免 质粒被酶降解。 NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化；但NaOH易和空气中的CO2发生反应，形
TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号；
HIS4为营养缺陷型筛选标志； 3‘AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因属同 源重组； 抗Amp 基因和pBR322能使空载体和构建的表 达载体在 E.coli 中筛选和复制。
根据实验的需要是否将片段进行表达，将载体分为表达载体和克隆载体。 克隆载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌内，使质粒在原核细 菌内大量复制，得到大量的重组质粒。
质粒有筛选标记，能提示质粒是否进入宿主细胞，可明显地区别于其它细胞，筛选标记
可为抗生素抗性基因或营养缺陷型基因，这样能改变宿主细胞的耐药性，使宿主细胞在
（完整版）质粒DNA的提取、纯化与鉴定
（完整版）质粒DNA的提取、纯化与鉴定分子生物学实验报告题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定姓名：学号：班级：时间：一、实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。
2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。
4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。
5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。
二、实验原理：1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard 法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。
少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
实验二十一 质粒DNA的提取、酶切与鉴定
实验二十一质粒DNA的提取、酶切与鉴定一、质粒DNA的提取[原理]分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
本实验采用碱变性法抽提质粒DNA，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。
当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
[试剂]1.溶液I：50mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA、25mmol/L Tris-HCl pH8.0;用前加溶菌酶4mg/ml。
2.溶液II：200mmol/L NaOH 、1% SDS。
3.溶液III：pH4.8醋酸钾缓冲液（60 ml 5mol/L 醋酸钾、11.5ml冰醋酸、28.5ml 蒸馏水）4.TE缓冲液pH8.05.含RNaseA的TE缓冲液：TE缓冲液含20μg/ml RNaseA。
6.苯酚：氯仿（1：1，v/v）：酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使体积分数为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。
氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇为24：1（v/v）。
7.1×LB溶液8.100μg/ml氨苄青霉素[器材]1.TGL-16型台式高速离心机2.1.5ml塑料离心管3.离心管架4.微量移液器5.常用玻璃器皿[操作步骤]1.培养细菌将带有质粒pUC19的大肠杆菌接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的1×LB中，37℃培养过夜。
2.取液体培养菌液1.5ml置塑料离心管中，10 000r/min离心lmin，去掉上清液。
质粒DNA的提取和鉴定
五、注意事项——材料准备
➢ 使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增 加）
➢ 培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失
➢ 尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加 大菌体用量
➢ 菌株不要频繁转接（质粒丢失）
五、注意事项——细胞裂解
➢ 菌体量适当。
➢ 培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。
1. 请涂布平板培养后，重新挑 选新菌落进行液体培养
2. 可减少菌体用量或增加溶液 的用量
对
3. 不要频繁转接，每次接种时 应接种单菌落。检查抗生素
策
使用浓度是否正确。
4. 溶液Ⅱ在温度较低时可能出 现浑浊，置于37℃保温片刻 直至溶解为清亮的溶液。
六、质粒DNA提取常见问题
问题二：质粒纯度不高，如何解决？
作用:酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉 淀， K＋可中和DNA
三、实验仪器、材料与试剂
▪ 平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机 相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机 相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇 有助于消除抽提过程中出现的泡沫）
（二）材料：含有质粒的大肠杆菌、LB液体培养基 （三）试剂： ▪ 溶液I 50mM 葡萄糖 25mMTris·HCl（pH8.0）10mM EDTA
作用:分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 ▪ 溶液II 0.2N NaOH 1%SDS（新鲜配制）
作用:细胞壁肽聚糖碱性下水解,核酸和蛋白质变性。 ▪ 溶液III 5M KAC
➢ 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
➢ 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质 的方法
质粒DNA的抽提纯化与检测
提
酶 切 后
取 的 质 粒
2.5Kb 0.9Kb
点样孔（如果纯化不好，就可 能有DNA-蛋白复合物残留） 开环构型 线性构型 超螺旋构型（希望得到最多）
RNA残留
小结
1．质粒的提取：碱裂解法分离纯化质粒DNA，利用质粒 DNA与染色质DNA变性与复性的差异。
2．质粒的酶切：限制性核酸内切酶可以识别特异 的DNA序
分子生物学实验（综合性）
真核细胞基因组DNA的分离、纯化与检测 质粒DNA的抽提、酶切及电泳鉴定 感受态细胞的制备及重组质粒的转化 常规PCR技术
YL-1
实验
质粒DNA的抽提、酶切及 电泳鉴定
YL-2
实验安排
上午：质粒DNA 的提取与纯化
中午：质粒DNA 的酶切 下午：电泳鉴定
质粒
❖ 质粒(plasmid)：是细菌、酵母菌和放线菌中自然存在 的独立于染色体外、具有复制能力的小分子共价闭合 环状双链DNA。
❖ 移液枪的正确使用
❖ 标记好自己的离心管
❖ 加不同溶液要换枪头
❖ 转移格平衡
注 意
（二）质粒DNA的酶切及 电泳鉴定
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
识别特异的DNA序列，并在识别位点或其周围切 割双链DNA的一类内切酶。
心5min，弃上清。 8. 加1mL冰预冷70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm离心5min。 9. 弃上清，室温放置5-10min，晾干沉淀。 10. 加20μL含RNase（无DNase）的TE溶解DNA，37℃水浴消化 15-30min以去
除RNA。
❖ 步骤5、6中吸取上清液时应避免将交界面的蛋白、染 色体DNA也吸走。
质量的DNA片段在凝胶 中泳动速度不一样，因 而可依据DNA分子的大 小或构型来使其分离。
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒DNA的提取与鉴定实验报告1. 实验目的本实验的目的是通过提取和鉴定质粒DNA，掌握质粒DNA的提取方法并验证提取的质粒DNA的纯度和完整性。
2. 实验原理质粒DNA提取是将质粒DNA从细菌细胞中分离出来的过程。
常用的提取方法包括碱裂解法和商业试剂盒法。
本实验使用商业试剂盒法进行质粒DNA的提取。
步骤如下： 1. 培养目标细菌，并收集细菌培养物。
2. 细菌培养物离心，收集细菌沉淀。
3. 加入细胞裂解缓冲液裂解细胞膜。
4. 加入溶解剂，使细胞溶解。
5. 加入酒精，沉淀出质粒DNA。
6. 分离质粒DNA，去除其他杂质。
7. 测定质粒DNA的纯度和完整性。
3. 实验步骤3.1 培养目标细菌1.取出目标细菌的冻存管，从-80°C的冷冻库中快速解冻。
2.取出琼脂平板，用无菌技术将细菌转接到琼脂平板上，利用无菌鹤嘴锄均匀涂抹。
3.将琼脂平板倒置放置在37°C恒温培养箱中，培养一夜。
3.2 收集细菌培养物1.取出含有细菌的琼脂平板，加入适量的无菌LB培养基。
2.用无菌移液管将培养基中的细菌转移到无菌离心管中。
3.将离心管放入低速离心机中，离心5分钟，将细菌沉淀收集。
3.3 细胞裂解1.向细菌沉淀中加入适量的细胞裂解缓冲液。
2.充分混合后，放置在冰上浸泡20分钟，使细菌细胞膜裂解。
3.4 细胞溶解1.加入等体积的溶解剂，充分混合。
2.将含有细胞裂解物的离心管放入冰上浸泡5分钟。
3.5 DNA沉淀1.向离心管中加入等体积的冷酒精。
2.轻轻倾斜离心管，使酒精与溶液充分混合。
3.放置在-20°C冷冻库中沉淀20分钟。
3.6 分离质粒DNA1.将离心管放入高速离心机中，离心10分钟。
2.将上清液倒出，保留下沉淀。
3.7 测定质粒DNA的纯度和完整性1.使用纳米比色计测定质粒DNA的浓度和纯度。
2.利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的完整性。
4. 结果与讨论根据实验结果，我们成功提取到了质粒DNA，并验证了其纯度和完整性。
质粒DNA的提取、鉴定与转化
质粒类型：
1. 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下 的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细 胞中只有一份或几份拷贝； 2. 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之 下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药 物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几 千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过 氯霉素处理才能达到更高拷贝数。
核酸的变性
在物理、化学因素影响下， DNA碱基对间的氢 键断裂，双螺旋解开， DNA的功能丧失。如高温、 pH值、变性剂(尿素、甲醛)等。
部分双螺旋解开
加热
无规则线团
链内碱基配对
DNA的变性过程
琼脂糖凝胶电泳
是一种非常简便、快速分离鉴定核酸的方法， 它是用琼脂糖或优质琼脂糖粉作为支持介质的一种 电泳分离方法。 它主要适用于≥1Kb的核酸的分离，样品DNA在 电泳过程中有电荷效应和分子筛效应，其迁移率大 小主要与DNA的分子大小和空间构象有关，另外，凝 胶浓度、电压、pH等也会影响迁移率。核酸区带观 察，是利用核酸与EB结合，在紫外光下可发出橙黄 色荧光的性质，借助于紫外观测仪来进行。
(4)低温高速离心机（20 (5)无菌工作台 (6)高压锅，
(7)常用玻璃仪器及滴管等。
（3）试剂：
(1) LB培养基成分如下：每升含有胰蛋白陈10g，酵母提取物5g，NaCI 10g，琼脂糖或琼脂（固体培养基时用）15g，用NaOH调pH至7.0。 (2) pH8.0 GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol／L EDTA，25 mmol／L Tris－HCl）； (3) 0.2mol／L NaOH(内含1%的SDS)，注：临用时配； (4) pH4．8乙酸钾溶液（60mL 5mol／L KAc，11.5mL冰醋酸，28.5mL H2O）：该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol／L。 (5) 异丙醇； (6) 70％乙醇； (7） pH8.0 TE缓冲液：10 mmol／LTris－HCI，lmmol／L EDTA，其中 含 RNA酶 20ug／mL。
质粒DNA的提取及鉴定
常用提取方法：水煮法（简单、及其便宜），碱 裂解法（简单、方便），试剂盒等
1.实验目的
1、碱裂解法提取质粒的原理。
2、DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
二、实验原理
利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差 异而达到分离的目的。在碱变性条件下，细菌 在NaOH和SDS溶液中裂解，蛋白质和DNA发生 变性，但是染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解 开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺 旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条 互补链不会完全分离。
四、实验操作
3、对提取的质粒DNA进行纯化及酶切鉴定： 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA，采用胶回收 试剂盒纯化质粒DNA；分析质粒DNA的限制 性酶切图谱，选择合适的限制性内切酶对质 粒DNA进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切 产物。
五、 结果处理
利用凝胶成像系统进行检测
闭环(螺旋) 闭环(超螺旋) 开环(部分解链 )
质粒DNA
六、 注意事项
1）实验菌种生长的好坏直接影响质粒DNA的提取，因此对存放时间较 长的菌种需要事先加以活化。有关细菌培养、保存的方法请查阅微生 物有关书籍。
2）细菌培养过程要求无菌操作。抗菌素等不能高温灭菌，应使用细菌 滤器过滤后使用。细菌培养液、配试剂用的蒸馏水、试管和离心管等 有关用具和某些试剂须经高压灭菌处理。接触过细菌的器具用后应消 毒灭菌再洗净。
水平电泳装置
四、实验操作
1、用碱裂解法提取质粒DNA：挑选单菌落小规模扩增后， 将2 mL含相应抗生素的 LB加入到容量为15 mL并通气良好的 试管中，然后接种入一单菌落，于37℃剧烈振摇下培养过夜， 收集细菌。
2、将细菌团块重悬于100μL用冰预冷的溶液Ⅰ（150 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris–HCl，pH8．0，10 mmol/L EDTA， pH8.0）中剧烈振荡。加200μL新配制的溶 液Ⅱ(0.2mol/L Na0H, 1%SDS)盖紧管口，快速颠倒离心管5 次，将离心管放置于冰上。
分子生物学实验1 质粒DNA的提取和检测
实验一质粒DNA的提取和检测实验原理：所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌扩增质粒；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，将质粒DNA释放到上清液中。
碱性溶剂使碱基配对完全被破坏，闭环质粒DNA双链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
当pH值恢复到中性时，重新形成完全天然地超螺旋结构。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，与PDS一起沉淀。
离心除去变性剂，从上清液中回收复性的质粒DNA。
在细菌的细胞内，质粒以超螺旋形式（cccDNA）存在。
在提取质粒的过程中，还有另外两种存在形式：线性（linear DNA）和松弛型(ocDNA)。
实验目的：掌握碱法小量提取质粒DNA和DNA的浓纯度检测方法。
实验内容：质粒DNA的小量提取和检测。
一.实验材料含质粒T+P（外源DNA片段）的JM109菌株。
二.主要仪器和设备微量移液器，微量离心管(eppendorf管)，离心管架、台式高速离心机、恒温振荡摇床、涡旋振荡器、电泳仪、琼脂糖平板电泳槽、恒温水浴锅、紫外分光光度计、DNA浓缩干燥仪三、试剂1、LB液体培养基：每升含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加入950ml去离子水溶解完全，用5mol/LNaOH调节pH值至7.0，后再加入去离子水至总体积为1升。
2、LB固体培养基：加入琼脂糖或琼脂15g，其他同液体培养基。
3、氨苄青霉素（Amp）母液：50mg/ml（溶于无菌水，-20℃保存，工作浓度为60μg/ml）4、3mol/L NaAc（pH5.2）5、溶液I（悬浮液）：50mmol/L 葡萄糖，25mmol/LTris·Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0），高压灭菌后，保存于4℃6、溶液II(临时配制) （裂解液）：0.2mol/L NaOH（从10mol/L贮存液中现用现稀释），1%SDS7、溶液III（中和液）：5 mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml8、pH8.0TE缓冲液：10mmol/LTris·Cl，1mmol/L EDTA，其中含RNA酶（RNaseA）20μg/ml。
质粒DNA的提取与鉴定
Expertimental Teaching Center of Biochemistry and Molecular Biology
质粒DNA的提取、定量 酶切鉴定
/sfzx/
实验内容
质粒DNA 质粒
定量
酶切
反应体系
在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次加入下述试剂
试剂名称
无菌水 10× 10×M酶切缓冲液 质粒DNA 质粒DNA
限制性内切酶
限制酶的切割点因酶而 异，有的在对称轴处切 割, 产生平末端的DNA片 段,如HaeIII,有的切割 位点在对称轴一侧，产 生带有单链突出末端的 DNA片段称粘性末端，如 EcoRⅠ.
限制性内切酶
★ 平末端 在识别顺序的中心对称轴处切割
5’ G-G-C-C 3’ 3’ C-C-G-G 5’
2.
菌体老化 碱裂解不充分 菌体中无质粒问题二：质粒纯度不高，如何解决？ 原因
1. 2. 3.
1.
混有蛋白 混有RNA 混有RNA 混有基因组DNA 混有基因组DNA
不要使用过多菌体。 不要使用过多菌体。重新纯化 DNA，去除蛋白、多糖、 DNA，去除蛋白、多糖、多酚 等杂质 加入RNaseA室温放置一段时间 加入RNaseA室温放置一段时间 RNaseA 加入溶液II III后 加入溶液II 和III后防止剧烈 振荡，可能把基因组DNA剪切 振荡，可能把基因组DNA剪切 DNA 成碎片从而混杂在质粒中。 成碎片从而混杂在质粒中。细 菌培养时间过长会导致细胞和 DNA的降解 的降解， DNA的降解，培养时间不要超 16小时 小时。 过16小时。
操作步骤
瞬时离心 加250μl 离心13000rpm,1min 离心13000rpm,1min 弃上清 （2） 彻底弃上清 （3） 溶液P1 菌液 溶液P1 （1） （4） 旋涡振荡 悬浮沉淀 （7） 加250μl 颠倒数次 加400μl 离心13000rpm,10min 离心13000rpm,10min 溶液P2 溶液P2 （5） 溶液P3 溶液P3 放置3-5min 放置3 取上700μl加 取上700μl加 700μl 到吸附柱中 离心（8） 弃滤液， 弃滤液，加入 13000rpm,1min 500μl去蛋白液 500μl去蛋白液 （ 离心 9） 13000rpm,1min （11） 11）离心 13000rpm,1min （6） 颠倒数次
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成碳酸钠，降低了NaOH的碱性，所以必须用新鲜的NaOH。SDS与NaOH联用，其目的是
为了增强NaOH的强碱性，同时SDS能很好地结合蛋白，产生沉淀。这一步要记住两点： 第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须 温柔混合，不然基因组DNA会断裂。 溶液III中的醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的纳离子而形成了PDS，因为十二烷基硫酸 钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠 离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。 2 M的醋酸是为了中和NaOH， 因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。 75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase。
输入DNA序列
得到的分析结果
启动子区的分析
http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/
/seq_tools/promoter.html
CpG岛分析
/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2943
第一部分，质粒载体的选择以及所插入的外源DNA片段 序列的生物信息学分析
质粒的基本知识
载体（vector）：能携带外源DNA进入细胞的运载DNA分子。载体按其行使的功 能分为克隆载体和表达载体，按组成元件的来源不同分为质粒载体、噬菌体载体、 病毒载体等。 质粒（plasmid）大小在1kb～200kb之间，结构简单，大多是具有双链闭合环状 结构的DNA分子，通常以超螺旋状态存在于许多细菌和酵母菌中。质粒具有不相 容性，两种不同的质粒不能共存在同一个宿主细胞中。质粒可在细胞间传递，其 在胞内的存在一般对宿主细胞的代谢活动无影响。
质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌，这个过程称转化。 转入的质粒DNA仍能进行复制，产生多个拷贝。
以应用于毕赤酵母表达系统的pPIC9载体为例解释载体的构件
5‘AOX1 启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇 的诱导下可启动外源蛋白的表达； α-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序 列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于 外源蛋白的纯化； 多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插 入提供位点；
综合性设计性实验-6
质粒载体的选择以及所插入的外源DNA 片段序列的生物信息学分析 质粒DNA的提取与鉴定 真核表达载体和RNA干扰载体的使用
此实验共包括如下三个部分
1. 第一部分，质粒载体的选择以及所插入的外源 DNA片段序列生物信息学分析部分 2. 3. 第二部分，质粒DNA的提取与鉴定实验操作部分 第三部分，真核表达载体和RNA干扰载体的使用
第二部分，质粒DNA的提取与鉴定
实验目的
掌握碱裂解法提取质粒的方法 了解质粒酶切鉴定原理
质粒DNA的提取方法
方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒 DNA释放法；酸酚法等。 碱裂 解法有操作简便、快速、得率高的优点。
概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理
TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号；
HIS4为营养缺陷型筛选标志； 3‘AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因属同 源重组； 抗Amp 基因和pBR322能使空载体和构建的表 达载体在 E.coli 中筛选和复制。
根据实验的需要是否将片段进行表达，将载体分为表达载体和克隆载体。 克隆载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌内，使质粒在原核细 菌内大量复制，得到大量的重组质粒。
质粒有筛选标记，能提示质粒是否进入宿主细胞，可明显地区别于其它细胞，筛选标记
可为抗生素抗性基因或营养缺陷型基因，这样能改变宿主细胞的耐药性，使宿主细胞在
含抗菌素环境中生存，或宿主细胞在缺乏某种营养组分时候还能生存。 质粒含有启动子序列，能够自我复制。不过质粒的复制和转录都依赖于宿主编码的蛋白 和酶，或能在胞质中进行自我复制，或整合到细胞染色体中作为细胞遗传物质的一部分 随染色体一起复制。 质粒的特点使其成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载 工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。
常用的克隆载体有： pGEM-T, pBR322, pUC18/19
表达载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌或真核细胞内，使目 的DNA片段在菌内或细胞内得到转录与翻译，得到目的蛋白。
常用的表达载体：
原核系统：pET系列，pQE系列，pGEX系列 酵母表达系统：pPIC9，pPIC9k，pPICZ 真核细胞系统：pCMVp-NEO-BAN，pEGFP， CMV4，pEGFT-Actin
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细 菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)选择哪一种方法主要 取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验 要求。
碱裂解法基本原理
葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部， EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金 属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制 DNase的活性，避免 质粒被酶降解。 NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化；但NaOH易和空气中的CO2发生反应，形
序列的查询与获得
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输入基因名称
选择查询项目
点击“Go”
注意选择人属物种的基因
mRNA序列 ar软件
点击“OK”
选取编码区序列
密码子使用分析 http://www.kazusa.or.jp/codon/countcodon.html