SARS_CoV的分子生物学研究_叶湘漓

SARS-CoV的分子生物学研究¹叶湘漓1,夏立秋2(1.湖南师范大学医学院,中国湖南长沙410006; 2.湖南师范大学生命科学学院,中国湖南长沙410081)摘要:S ARS-CoV是引起严重急性呼吸道综合症(SARS)的病原体.更多地了解SARS-CoV的基因组、蛋白结构以及它与其它冠状病毒的关系,将有助于SARS疾病的防治.关键词:冠状病毒;严重急性呼吸道综合症;SARS冠状病毒中图分类号:R373文献标识码:A文章编号:1007-7847(2003)04-0293-05A Molecular Biological Study of SARS-CoVYE Xiang-li1,XIA L-i qiu2(1.Colle ge o f Me dicine,Hunan Norma l University,Changsha410006,Hunan,China;2.College of Li f e Science,H unan N ormal University,Changsha410081,Hunan,China)Abstract:SARS-C oV was identified as the causative agent of SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome).Know-ing more about the genome organization and protein structure of SARS-CoV and the relationship between SARS-C oV and other c oronaviruses will be useful for treatment of SARS.Key words:coronavirus;SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome);SARS-CoV(Life Science Research,2003,7(4):293~297)SARS)))严重急性呼吸道综合症(Severe A-cute Respira tory Syndrome,英文简称为SARS),是2003年2月底由意大利籍传染病专家Carlo Urbani 大夫命名的,正是因为这位大夫在研究这种疾病时不幸被感染而突然病逝,才使得国际社会猛然对SARS的危害性有了极高的警惕,因此2003年4月16日WHO将这种病毒正式命名为/SARS病毒0[1,2].SARS病毒(SARS-CoV)属于冠状病毒科(C oronavirus).冠状病毒因其在电子显微镜下外膜呈日冕状或皇冠状突起而得名;已知的冠状病毒分为3个群,其中第1群和第2群为哺乳动物病毒,第3群为禽类病毒;每一群又可根据病毒的宿主范围、抗原性、核苷酸序列以及基因组成等的不同进行进一步的分类.1冠状病毒的基本结构1.1冠状病毒的基因组冠状病毒为有包膜的单股正链RNA病毒,是所有RNA病毒中基因组最大的,长约29~31kb, 5c端有一个帽子结构,3c端有poly(A)尾.这个RNA分子包在一个螺旋形的套壳中,外围再由被膜包围而形成直径约120~160nm的不规则球形病毒颗粒[3].第7卷第4期2003年12月生命科学研究Life Science ResearchVol.7No.4Dec.2003¹收稿日期:2003-08-17;修回日期:2003-10-30基金项目:湖南省SARS重大专项课题资助(03SSY1016)作者简介:叶湘漓(1970-),男,湖南长沙人,湖南师范大学医学院讲师,微生物与酶工程实验室硕士研究生;夏立秋(1955-),男,湖南安乡人,湖南师范大学生命科学学院教授,微生物与酶工程实验室主任,主要从事微生物分子生物学研究,E-mail:xialq@.cn.冠状病毒具有独特的基因组结构以及RNA 转录策略.虽然不同的冠状病毒粒子在形态和基因组长度等方面各不相同,但它们都具有相似的基因顺序:5c -复制酶基因、S 蛋白基因、E 蛋白基因、M 蛋白基因、N 蛋白基因-3c ,且都能合成多个巢套(nested -set)的同3c -末端结构(coterminal struc -ture)亚基因组mRNAs[4].SARS -Co V 的基因组为聚腺苷酰化mRNA,长度为29727nt,GC 含量为41%(其它冠状病毒为37%~42%);从基因结构上看它是一种典型的冠状病毒,具有典型的基因顺序(图1);SARS -C oV的rep 基因占整个基因组的近2/3,它编码两种聚蛋白(分别由ORF1a 和ORF1b 编码),引导共翻译蛋白水解过程[5].图1 SARS -CoV 的基因组结构及mRNA 图谱(A)SAR S -CoV 的全基因组:引导序列位于基因组和亚基因组mR NA 的5c 端,后面是编码非结构聚蛋白的ORFs 1a 、1b 以及编码S 、E 、M 、N 等结构蛋白的ORFs;(B)放大图谱:S 、E 、M 、N 表示的是编码已知结构蛋白的ORFs;X1到X5表示的是编码可能的非结构蛋白(长度超过50个氨基酸)的ORFs;下面为一系列具有共同3c 端,但长度不同的巢套组mRN As,其前面均有一个引导序列.Fig.1 Genome organization and m RNA mapping of SA RS -CoV(A)Overall organization of SAR S -CoV genomic R NA:The leader s equence is represented at the 5.terminus of the genome and the s ubgenomic mR NAs (bel ow).OR Fs 1a and 1b,encoding the nonstructural polyproteins,and those encoding the S,E,M,and N s tructural protei ns are indicated.(B)Expanded vie w of the map.Known s truc tural protein coding regions and reading frames X1to X5,encoding potential nons truc tural proteins,are i n -dicated.Lengths and map locati ons of the 3c -cotermi nal mRNAs are below.在rep 的下游,有4个ORFs(开放阅读框),分别编码结构蛋白S(刺突糖蛋白)、E(小包膜蛋白)、M(膜糖蛋白)和N(核衣壳磷蛋白);在第2群和部分第3群冠状病毒中,ORF1b 和S 之间还有一个编码红血球凝聚素酯酶的基因,但这个基因在SARS -CoV 中还没有发现.此外,在S 和E 、M 和N 、以及N 的下游,还有一些编码非结构蛋白的基因,这些非结构蛋白在不同种类的冠状病毒间变化很大,它们对于复制是非必须的,其功能尚不清楚.在SARS -CoV 的基因间隔区,还包含5种可能的非结构蛋白(长度超过50个氨基酸)的ORFs.在S 和E 之间有两个重叠的ORFs,分别为X1和X2,编码含有274和154个氨基酸的蛋白质;其它3个可能的非结构基因X3、X4、X5位于M 和N 之间,分别编码有63、122、84个氨基酸的蛋白质.除了上述的5个编码非结构蛋白的ORFs 外,在M 和N 之间还有两个小的ORFs,分别编码长度不到50个氨基酸的蛋白质,但在图1中没有显示.冠状病毒基因组RNA 的转录是非连续的.首先由5c 端的复制酶基因直接翻译出病毒的多聚酶,然后在多聚酶的作用下转录出全长的负链RNA;再以这一负链RNA 为模板,转录出多个亚基因组mRNAs.这些亚基因组mRNAs 都带有一小段相同的引导序列(leader sequence,长约60~90294 生 命 科 学 研 究 2003年nt),都具有共同3c 端,只是长度不同,故又称为巢套组mRNAs.这种非连续转录的机制可能与转录调节序列(TRS)有关.冠状病毒的TRS 含有一个保守的核心序列5c -C UAAAC -3c ,在SARS -CoV 的基因组中有6个位置存在TRS,所以SARS -CoV 在复制中将会转录出6个亚基因组mRNAs,其分子质量分别为8.3kb 、4.5kb 、3.4kb 、2.5kb 、2.0kb 和1.7kb.但在感染细胞中很少能观察到完整的基因组RNA.1.2 冠状病毒的蛋白结构冠状病毒有4种结构蛋白:N 、S 、M 和E,它们分别在病毒进入宿主细胞、病毒粒子的形态发生以及病毒的释放过程中发挥作用(图2).图2 冠状病毒结构模式图N 蛋白,核衣壳磷蛋白;S 蛋白,突起糖蛋白;M 蛋白,膜糖蛋白;E 蛋白,小包膜蛋白.Fig.2 The model map of coronavirus .s structureN structural proteins,nucleocapsid protein;S structural proteins ,s pike glycoprotein;M s truc tural proteins ,membrane glycoprotein;E s truc tural proteins ,s mall membrane protein.1.2.1 N 蛋白结构和功能分析N 蛋白是冠状病毒的一种重要的结构蛋白,它有两个方面的作用:1)在病毒包装的过程中,N 蛋白先与病毒RNA 结合形成复合体,再通过与M 蛋白的相互作用被包裹进病毒的衣壳中;2)在病毒RNA 的转录和复制过程中,N 蛋白与mRNA 相互作用,可能影响到病毒RNA 的转录和复制.其中,在病毒的包装过程中,N 蛋白与病毒RNA 之间存在着两个相互识别作用:一个是N 蛋白并不会和任意大小的病毒RNA 结合,而只会和完整的病毒RNA 结合;另外一个是M 蛋白并不会单独和N 蛋白发生相互作用,而只会和N 蛋白与RNA 的结合产物产生作用.前一个识别作用与病毒RNA 中的包装信号序列(packaging signal sequence)有关;例如,在鼠肝炎病毒(MHV)中,N 蛋白就是通过识别病毒RNA 中的包装信号来区别完整的病毒RNA 和RNA 片断的,该序列位于ORF1b 的3c 端(位于病毒RNA 的20304~20364nt 之间),长度为69nt,其最短序列为AAUCYAAAC;MHV 的N 蛋白有3个保守的结构域,在第2个结构域中存在着SRXX 的特征性序列(位于177~231),该序列具有RNA 结合活性[6,7].后一个识别作用可能与某种辅助因子有关.SARS -C oV 的N 蛋白由422个氨基酸组成(其它冠状病毒为377~454),同其它冠状病毒的N 蛋白进行分析比对,发现它们虽然在全氨基酸序列上的同源性很低,但在氨基端都有两个保守的氨基酸集中区域;SARS -CoV 的N 蛋白在其第一个保守氨基酸集中区域的末尾(位于178~205),也存在一个SRXX 富集区,MHV 的相应区域正好是其RNA 结合区,所以推测这个区域有可能就是SARS -Co V N 蛋白的RNA 结合区的一部分.1.2.2 S 蛋白结构和功能分析S 蛋白为病毒的刺突糖蛋白,在病毒粒子表面形成大的花瓣样突起.它有3个结构域,其中胞外域又可进一步分为S1和S2两个亚结构域.S1亚结构域形成病毒突起的球形部分,它含有与易感细胞膜特定受体相结合的序列,该序列容易发生变异,在冠状病毒的不同株以及分离物中均有不同程度的缺失和替换,从而引起病毒的抗原性以及致病性的改变.S2亚结构域呈一种螺旋化螺旋(coiled -coil)结构,它可能组成了病毒突起的茎部;S2序列比较保守,很少发生变异;其内部的亲水序列可能与膜融合活性有关.在大多数MHV(鼠肝炎病毒)株以及BC oV (牛冠状病毒)中,S 蛋白在病毒成熟时或者成熟后先被细胞内的蛋白酶(如丝氨酸蛋白酶)酶切成S1和S2,然后S1和S2通过非共价方式相连接,共同构成病毒的突起.不同冠状病毒S 蛋白的酶切程度不同,这与感染细胞的类型有关.S 酶切成S1和S2可以促进病毒包膜与感染细胞膜之间或感染细胞之间的融合(S 蛋白可存在于感染细胞的细胞膜表面),并增强病毒的感染性.部分冠状病毒(如FIPV,猫传染性腹膜炎病毒)的S 蛋白不能被切割,虽然仍能介导细胞与细胞的融合,但效率大大降低[8].可见,S 蛋白的构象变化对病毒的295第4期 叶湘漓等:SARS -CoV 的分子生物学研究感染起着重要的作用.SARS -C oV 的S 蛋白缺少第2群和第3群冠状病毒的氨基酸酶切位点,所以它的S 蛋白很可能不能切割成S1和S2.S 蛋白还包含一种重要的病毒中和抗原,其氨基酸变化会明显改变病毒的毒力以及体外宿主细胞的病毒趋性.针对S 蛋白的抗体是一种重要的中和抗体(m Ab),它类似于抗呼吸道合胞病毒的mAb (该抗体可以防止婴儿出现下呼吸道感染并发症),能够中和病毒的感染性;利用S 蛋白的这个特点可以制备相应的疫苗或亚单位疫苗,通过计划免疫或预防接种,从根本上防止SARS 的发生.1.2.3 M 蛋白结构和功能分析M 蛋白专供细胞内膜结构的识别,M 、E 和核衣壳的相互作用导致病毒以出芽的方式释放.M 蛋白与冠状病毒的其它糖蛋白的区别在于M 蛋白仅短的N 末端结构域暴露于病毒包膜的表面,而其C 端还是插入病毒的包膜中.M 蛋白包含3~4个疏水的跨膜结构域,在第3个疏水结构域的后面紧接着一个高度保守的氨基酸序列SwWSFNPE(SARS -Co V 中的是SMWSFNPE),其作用尚不清楚[9].1.2.4 E 蛋白结构和功能分析E 蛋白为小包膜蛋白,在冠状病毒的包膜中,E 蛋白的数量远少于其它包膜蛋白;E 蛋白包含一个疏水的结构域,其侧面与一些带电荷的残基相连,后面跟着一个半胱氨酸的区域.E 蛋白与冠状病毒的装配有关.冠状病毒还有一些其它的结构蛋白和非结构蛋白,其功能尚在研究中.2 S ARS -CoV 与其它冠状病毒的比较2.1 比较方法将SARS -CoV 的4种结构蛋白序列与NCBI 数据库中已知冠状病毒的序列进行比对,结果见图3.图3 SARS -CoV 与其它冠状病毒的蛋白种系发生分析示意图G1(第1群):HCoV -229E(人冠状病毒-229E),af304460(Genbank 的进入号,后同);PED V(猪流行性腹泻病毒),af353511;TGEV(猪传染性胃肠炎病毒),aj271965;CCoV(犬冠状病毒),d13096;FCoV(猫冠状病毒),ay204704;PRCoV(猪呼吸道冠状病毒),z 24675.G2(第2群):BCoV(牛冠状病毒),af220295;MHV(鼠肝炎病毒),af201929;HCoV -OC43(人冠状病毒-OC43),m76373、l14643、m93390;PHEV (猪血凝性脑脊髓炎病毒),ay078417;RtCoV(鼠冠状病毒)af207551.G3(第3群):IBV(禽传染性支气管炎病毒),m95169.Fig.3 Phylogenetic analysis of SARS -CoV and other coronav irus proteinsGroup 1(G1):HCoV -229E (human coronavirus 229E),af304460(Access number in Genbank );PED V (porcine epide mic diarrhea virus),af353511;TGEV (trans mis sible gastroenteritis virus),aj271965;CCoV (canine coronavirus),d13096;FCoV (feline coronavirus ),ay204704;PR CoV (porcine respiratory coronavirus ),z24675.Group 2(G2):BCoV (bovine coronavi rus),af220295;MHV (murine hepatitis virus ),af201929;HCoV -OC43(human coronavirus OC43),m76373,l14643,m93390;HEV (porcine hemagglutinating encephalomyeli tis vi rus),ay078417;R tCoV (rat coronavi rus),af207551.Group 3(G3):IBV (infectious bronc hitis virus),m95169.296 生 命 科 学 研 究 2003年2.2结果分析4种结构蛋白基因比对后得到的系统发生树很相似:SARS-CoV形成了一个独立的分支,它不属于冠状病毒已知3个群中的任何一种,而是构成了一个新的群,即第4群.可见,SARS-CoV并非人类呼吸道冠状病毒的突变体,也不是已知冠状病毒之间简单重组的结果,相反,它可能来自于一种未知的动物或鸟类,并且在引发人类出现SARS以前就已经独立存在了一段时间.我国有SARS-CoV来自于果子狸的报道,日本的科学家则发现SARS-CoV与在鸟类身上发现的病毒非常相近,因而推测,引发SARS 的冠状病毒的第一次传播是从鸟类到哺乳动物,然后在哺乳动物(尤其是某些野生动物)体内,这种病毒变异成为一种对人类有致命危险的作用因子;SARS-CoV可能同艾滋病病毒、肝炎病毒和脑炎病毒一样,都属于4大类病毒中的第2类.关于SARS-CoV还有很多有趣的问题亟待研发和阐明:如它的原始宿主到底是什么?它从动物传播到人究竟是一种随机突变的结果还是存在着某种未知的、必然的联系?在人体内找到的SAR-S CoV能否再感染它的原始宿主?如果SARS-C oV是来源于某种动物病毒的突变,那么这种突变是否会反复发生、并再次引发人类的致死性疾病?虽然现在SARS得到了一定程度的控制,它的未来将会如何变化?是像普通肺炎一样感染一定人群后从此消失还是像流感一样年年出现或者是像麻疹一样每隔两三年暴发一次、并感染部分人群?对于这些问题的解答将有助于SARS疾病的防治,并为人类防治新的突发性病毒性疾病带来希望.参考文献(References):[1]PEIRIS,LAI 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