氨基酸及蛋白质的分离
氨基酸的分离鉴定 纸层析法实验报告
氨基酸的分离鉴定纸层析法实验报告氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。
而氨基酸的分离鉴定则是研究蛋白质的前提和基础。
本次实验使用纸层析法对氨基酸进行了分离鉴定。
首先，我们需要了解一下纸层析法的原理。
纸层析法是一种基于分子大小和亲水性的分离技术，常用于生化分析中。
其原理是通过纸张上固定的固定相（通常是硅胶或纤维素）与待分离物质之间的相互作用来实现分离。
待分离物质在移动相（溶液）的推动下，根据其与固定相的亲水性和大小的差异，以不同的速度在纸上移动，从而实现分离。
在实验中，我们使用了两种氨基酸溶液进行分离鉴定。
首先，我们需要准备好实验所需的材料和试剂，包括纸层析纸、氨基酸溶液、显色剂等。
然后，将纸层析纸剪成适当大小的条状，用铅笔在纸上标记出起点线和终点线。
接下来，我们将纸层析纸的一端浸入移动相（溶液）中，使其吸满溶液后取出，待溶液在纸上上升到起点线时立即停止。
然后，将氨基酸溶液滴在起点线上，待其渗透进纸层析纸后将纸张平放在容器中，盖上盖子，保持相对湿润的环境。
随着时间的推移，溶液将在纸上上升，并逐渐分离成不同的组分。
不同的氨基酸在纸上的迁移速度受到其亲水性和分子大小的影响。
亲水性较强的氨基酸会更容易被纸上的固定相吸附，从而迁移速度较慢，而亲水性较弱的氨基酸则会迁移得更快。
当溶液上升到终点线时，我们将纸张取出，用显色剂处理。
显色剂可以与氨基酸发生反应，产生可见的色带。
通过比较色带的位置和颜色，我们可以确定不同氨基酸的迁移速度和存在量。
实验结果显示，我们成功地将两种氨基酸分离开来，并且确定了它们的相对迁移速度。
这为进一步的氨基酸分析和蛋白质研究提供了基础数据。
同时，我们还发现，在纸层析过程中，一些氨基酸可能会发生相互作用，导致它们的迁移速度发生变化。
这提示我们在进行氨基酸分析时需要考虑到可能的相互作用因素。
总结起来，纸层析法是一种简单、经济且有效的氨基酸分离鉴定方法。
通过该方法，我们可以快速地分离出不同的氨基酸，并确定它们的相对迁移速度。
第四章蛋白质化学第六节蛋白质及氨基酸分离纯化与测定
一、一般原则及基本步骤
材料的预处理及细胞破碎 蛋白质的抽提
蛋白质的粗分级
等电点沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法
蛋白质的细分级
凝胶层析法 离子交换层析法 亲和层析
1
二、蛋白质的分离纯化方法
◇（一）根据分子大小不同的纯化方法 ◇（二）利用溶解度差别的纯化方法 ◇（三）根据电荷不同的纯化方法 ◇（四）利用选择性吸附的纯化方法 ◇（五）利用配体的特异性亲和力的纯化方法
磷酸基
SE-纤维素（强弱酸型）
磺乙基
SP-纤维素（强弱酸型）
磺丙基
常用的阴离子交换剂
离子交换剂
可电离基团
可电离基团结构
AE-纤维素（弱减型）
氨基乙基
PAB-纤维素（弱减型） 对氨基苯甲酸
DEAE-纤维素 （中弱减型）
DEAE -Sephadex （中弱减型）
二乙基氨基乙基 二乙基氨基乙基
DEAE -纤维素（强减型） 二乙基氨基乙基
（3）有分级分离现象 （4）要求对有机溶剂低温预冷。
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4.温度对蛋白质溶解度的影响
• 在一定温度范围内，约0-40℃之间，大部分球状 蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外， 例如人的血红蛋白从0到25℃，溶解度随温度上升 而降低。
• 在40-50℃以上开始变性，一般在中性pH介质中即 失去溶解力。
⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell)，保护了 蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白质形成稳定 的胶体溶液。
⑵蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作用。（存在 双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的 原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。 蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电 层。
蛋白质与氨基酸测定
人体可以自行合成，不必从食物中摄取的氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸等。
氨基酸的功能
合成蛋白质
合成其他生物活性物质
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，通 过脱水缩合形成肽链，进而形成蛋白 质。
氨基酸可以作为合成其他生物活性物 质的原料，如嘌呤、嘧啶等。
代谢调节
氨基酸参与多种代谢反应，如糖代谢、 脂肪代谢和氮代谢等，对维持人体正 常生理功能具有重要作用。
生物能源研究
蛋白质和氨基酸在生物能源领域也有应用，如通过测定蛋 白质的分解产物来评估生物燃料的生产效率和可持续性。
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蛋白质含量。
分光光度法
利用特定波长下的吸光度来测 定蛋白质含量，如双缩脲法、 酚试剂法等。
色谱法
利用色谱技术分离蛋白质，通 过测定各组分的含量来计算蛋 白质含量。
质谱法
通过测定蛋白质的质荷比来鉴 定蛋白质，常用于蛋白质组学
研究。
02
氨基酸测定
氨基酸的种类
必需氨基酸
人体无法自行合成，必须从食物中摄取的氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬 氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和组氨酸。
蛋白质在生物体内可以水解成氨基酸， 氨基酸通过合成反应形成蛋白质。
蛋白质与氨基酸在生物体内的代谢过程
蛋白质的合成与分解
在生物体内，蛋白质的合成和分解是 一个动态平衡的过程。合成主要发生 在细胞内的核糖体上，而分解则通过 蛋白酶的催化作用进行。
氨基酸的代谢
氨基酸在生物体内经过一系列的代谢 反应，可以转化为其他有机物质，如 葡萄糖、脂肪等。同时，氨基酸也可 以作为合成核苷酸、激素等物质的原 料。
植物组织中可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质的系列测定
实验四植物组织中可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质的系列测定一、目的从一份植物样品中系统分离和测定可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质等多种成分，不仅对研究植物体内碳、氮代谢，了解植物的生长发育状况有重要意义，亦可以作为鉴定其品质的重要指标，而且也有助于训练基本操作技能。
二、原理（一）分离提取原理在80-85%的乙醇中，植物组织中的还原糖、蔗糖以及游离氨基酸和叶绿素等溶解，而淀粉及蛋白质沉淀，再用9.2 mol/L高氯酸溶解淀粉（蛋白质沉淀），最后用0.1 mol/L氢氧化钠溶解蛋白质，然后选用适当的方法测定各个提取液中相应物质的含量。
（二）测定原理1.蒽酮比色法——可溶性糖含量测定碳水化合物及其衍生物经浓硫酸处理，生成糠醛，再与蒽酮脱水缩合而生成蓝绿色化合物，在一定范围内其颜色深浅与碳水化合物含量成线性关系。
蒽酮反应的颜色深浅，随温度条件和加热时间而变化，葡萄糖显色高峰在100℃时，加热10 min后出现，而核糖在相同温度下，加热3 min后出现。
此法灵敏度高，糖含量达30 μg即可测定。
2.茚三酮比色法——氨基酸含量测定氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，产生二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，在570 nm下有最大光吸收。
在一定范围内，其颜色深浅与氨基酸的含量呈正比。
3.考马斯亮蓝G-250结合法——蛋白质含量测定考马斯亮蓝在游离状态时呈红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，后者最大光吸收在595 nm，在一定范围内（0-1000 μg /mL），其颜色深浅与蛋白质的含量呈正比。
此法快速灵敏，反应在2 min内即达到平衡，室温1h内颜色稳定，而且干扰物也少。
三、实验用品（一）实验材料：植物样品。
（二）器皿：1. 25 mL刻度试管⨯8 ，15 mL试管⨯20；2. 10 mL离心管⨯2；3. 容量瓶：50 mL⨯1 ，25 mL⨯1；4. 移液管：5 mL⨯2，2 mL⨯4，1 mL⨯2，0.1 mL⨯2；5. 恒温水浴锅；6. 离心机；7. 电子天平；8. 分光光度计。
蛋白质氨基酸测定
三聚氰胺(melamine)
是一种有机含氮杂环化合物，学名1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺， 或称为2,4,6-三氨基－1,3,5-三嗪，简称三胺、蜜胺、氰尿 酰胺，是一种重要的化工原料，主要用途是与醛缩合，生 成三聚氰胺-甲醛树脂，生产塑料，这种塑料不易着火，耐 水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀，有良好的绝缘 性能和机械强度，是木材、涂料、造纸、纺织、皮革、电 器等不可缺少的原料。它还可以用来做胶水和阻燃剂，部 分亚洲国家，也被用来制造化肥。
①样品消化 : 准确称取一定量的样品至干燥洁净的 500mL凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.5g（1g）、硫酸钾10g （3g)和浓硫酸20mL、玻璃珠数粒→轻轻摇匀，以45º斜 支于石棉网上→用电炉以小火加热(或先烧瓶放在距电 炉较远处)，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后→加 大火力(或将烧瓶放在电炉上)，保持瓶内液体微沸→至 液体变蓝绿色透明后→继续加热微沸30min→关闭电炉， 取下烧瓶、冷却→转移至100mL容量瓶中，加水定容。
❖ 加入硫酸铜的作用 催化作用：加速有机物的氧化分解 C＋ 2CuSO4 → Cu2SO4 ＋ SO2↑＋ CO2↑ Cu2SO4 ＋ 2H2SO4 → 2CuSO4 ＋ 2H2O ＋ SO2↑ 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫 酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。
消化完全指示：蓝绿色；
三聚氰胺的最大的特点是含氮量很高（66 ％），加之其生产工艺简单、成本很低， 给了掺假、造假者极大地利益驱动，有人 估算在植物蛋白粉和饲料中使蛋白质增加 一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实 蛋白原料的1/5。所以“增加”产品的表观 蛋白质含量是添加三聚氰胺的主要原因， 三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什 么气味和味道，掺杂后不易被发现等也成 了掺假、造假者心存侥幸的辅助原因。
食品中氨基酸及蛋白质的测定(实验报告)
测定食品中的蛋白质---2013.3.25组员：***实验目的：（1）会测定食品中粗蛋白的含量。
（2）明确常见的食品蛋白质含量，以及测定原理。
实验原理：将被检样品加入浓硫酸，以硫酸铜，硫酸钾为催化剂共同加热消化食品中蛋白质分解为氨，并与硫酸结合成硫酸铵，通过碱化蒸馏，使氨分离出来，用硼酸吸收形成硼酸按后，再用盐酸标准溶液滴定，根据消耗的标准盐酸的体积，通过换算系数，可测定食品中蛋白质的含量。
实验仪器：凯氏烧瓶、可调式电炉、定氮蒸馏装置试剂：①硫酸铜CuSO4.5H2O ②硫酸钾③硫酸（密度为1.8149g/L）④40g/L 硼酸溶液⑤混合试剂；1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L亚甲基蓝乙醇溶液，用时按2：1的比例混合。
实验步骤:数据处理：标定0.1000mol /L 盐酸标准溶液微量蒸馏按下式计算：X=⨯⨯⨯⨯-10010m c0.014)(0V V F 100⨯式中 X 食品中蛋白质质量分数，%;V 滴定试样时消耗盐酸标准滴定溶液的体积，mL;V 0 空白试验时消耗盐酸标准滴定溶液的体积mL ；C 盐酸标准滴定溶液的浓度； 0.014 氮的毫摩尔质量，g/mmol; m 试样的质量，g;F 氮换算蛋白质的系数。
注意事项：①本实验对蛋白质含量进行测定，因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故结果称为粗蛋白质含量。
②为减少实验误差，所有试剂溶液应用无氨蒸馏水配置。
③消化过程要不断转动凯氏烧瓶，以利于附着在烧瓶上的固体残渣被洗下，促进其消化；同时为防止造成氮损失，不要用强火，应保持缓和沸腾。
④样品中含脂肪或糖较多，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫外溢，在消化开始时用小火加热，并时时摇动，并可以加入少量辛醇、液体石蜡或硅油消泡剂，并控制热源强度。
⑤一般消化至呈透明后，继续消化30min即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，呈较深绿色。
蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离
实验六蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离一、目的1．学习水解蛋白质的方法。
2．掌握纸层析的基本技术。
3．学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方法。
二、原理1．蛋白质的水解蛋白质可以用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸。
实验室中常使用酸解法水解蛋白质。
当在6 mo叭。
盐酸溶液中将蛋白质在110t加热大约20 h，肽键断裂，此时蛋白质完全分解为氨基酸。
酸法水解蛋白质的优点是在水解过程中不发生外消旋作用，所得到的氨基酸均为L一氨基酸。
大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的，但色氨酸则完全被破坏。
丝氨酸和苏氨酸在酸解过程中或多或少地也有破坏。
色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质——腐黑质，因此，用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。
2．纸层析法分离氨基酸纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。
它利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数，经层析而达到分离的目的。
在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数，若以K表示分配系数层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。
滤纸纤维素与水有较强的亲和力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸重的22％左右（其中约有6％的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形成流动相。
层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。
随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点不断向前移动，溶质中各组分的分配系数不同，前进中出现了移动速率差异，通过一定时间的层析，不同组分便实现了分离。
物质的移动速率以R f值表示：各种化合物在恒定条件下，层析后都有其一定的R f值，借此可以达到定性、鉴别的目的。
氨基酸分离的主要技术及原理
氨基酸分离的主要技术及原理林锦池董越范雪雪摘要：本文对氨基酸分离提纯常用的沉淀法、离子交换法、萃取法、吸附法、毛细电渗析法、膜分离法以及结晶法等方法的技术原理及研究进行较全面的总结。
1 沉淀法沉淀法是最古老的分离、纯化方法，目前仍广泛应用在工业上和实验室中。
它是利用某种沉淀剂使所需要提取的物质在溶液中的溶解度降低而形成沉淀的过程。
该方法具有简单、方便、经济和浓缩倍数高的优点。
氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法，特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。
1．1 利用氨基酸的溶解度分离或等电点沉淀法在生产中常利用各种氨基酸在水和乙醇等溶剂中溶解度的差异，将氨基酸彼此分离。
如胱氨酸和酪氨酸在水中极难溶解，而其它氨基酸则比较易溶；酪氨酸在热水中溶解度大，而胱氨酸则无大差别。
根据此性质，即可把它们分离出来，并且互相分开。
另外，可以利用氨基酸的两性解离有等电点的性质。
由于氨基酸在等电点时溶解度最小，最容易析出沉淀，所以利用溶解度法分离氨基酸时，也常结合等电点沉淀法。
1．2特殊试剂沉淀法某些氨基酸可以与一些有机或无机化合物结合，形成结晶性衍生物沉淀，利用这种性质向混合氨基酸溶液中加入特定的沉淀剂，使目标氨基酸与沉淀剂沉淀下来，达到与其它氨基酸分离的目的。
较为成熟的工艺有：缬氨酸与苯甲醛在碱性和低温条件下，可缩合成溶解度很小的苯亚甲基精氨酸，分离这种沉淀，用盐酸水解除去苯甲醛，即可得精氨酸盐酸盐；亮氨酸与邻一二甲苯一4一磺酸反应，生成亮氨酸的磺酸盐，后者与氨水反应得到亮氨酸；组氨酸与氯化汞作用生成组氨酸汞盐的沉淀，再经处理就可得到组氨酸。
特殊试剂沉淀法虽然操作简单、选择性强，但是由于沉淀剂回收困难，废液排放污染严重，残留沉淀剂的毒性等原因已逐渐被它方法取代。
工业应用举例：选择性沉淀分离亮氨酸、精氨酸的方法该方法包括下述步骤：将二氯苯磺酸加入到毛发酸水解液中，所述二氯苯磺酸和所述水解液之间的重量/体积比为二氯苯磺酸∶水解液＝1∶5～20；搅拌所述毛发酸水解液；将生成的亮氨酸沉淀物进行分离以获取亮氨酸。
蛋白质及氨基酸分析
② 蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓 氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放 出氨气，反应方程式如下： 2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3↓＋ Na2SO4 ＋ 2H2O
③ 吸收与滴定：加热蒸馏所放出的氨，可用 硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用 盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k ＝5.8×10-10），用酸滴定不影响指示剂 的变色反应，但它有吸收氨的作用，吸收 及滴定的反应方程式如下： 2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H30ml离心管→加 1mlClC4→混合→加50ml酒石酸钾钠稳定 剂→盖上盖子离心10min（4000转/分）→ 放置1小时→吸混合液15ml→于20ml离心 管中→离心到完全透明→取上清夜5ml于 →10ml容量瓶→加水定容→于560nm处测 定吸光度，从标准曲线上查出蛋白质含量。
1.蛋白质分析的重要性 (1)生物活性测定 一些蛋白质包括酶或酶抑制因 子和食品科学与营养有关，例如肉类嫩化中的蛋 白酶、水果成熟中的果胶酶以及豆类中的胰蛋白 酶抑制因子都是蛋白质。 (2)功能性质调查 不同种类食品中的蛋白质都有 其独特的食品功能性质，例如小麦面粉中的麦醇 溶蛋白和麦谷蛋白具有成面团性，牛乳中的酪蛋 白在干酪制作中具有凝结作用，而鸡蛋卵清蛋白 具有起泡能力。
二蛋白质的含量测定凯氏定氮法凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确操作较为简单的方法之一可用于所有动植物食品的分析及各种加工食品的分析可同时测定多个样品故国内外应用较为普遍是个经典分析方法至今仍被作为标准检验方法样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化使蛋白质分解其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵
蛋白质的提取、分离纯化及定量
实验一氨基酸的分离鉴定——纸层析法实验目的1.学习氨基酸纸层析的基本原理。
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。
实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
将样品点在滤纸上（原点），进行展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进行分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA分离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用比移（rate of flow ,R f）来表示R f= 原点到层析点中心的距离（X）/原点到溶剂前沿的距离(Y) 只要条件（如温度、展层剂的组成）不变，某种物质的R f值是常数。
可根据R f作为定性依据。
R f值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
样品中如有多种AA，其中有些AA的R f值相同或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而达到分离的目的，这种方法叫双向层析。
仪器、试剂1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进行混合得混合液。
将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。
取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
2、氨基酸溶液⑴.已知单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。
3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
4、层析缸、滤纸（14*17）、喷雾器、电吹风实验步骤1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。
2.准备滤纸：取层析滤纸（长17㎝、宽14㎝）一张。
在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。
氨基酸及蛋白质的分离
在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、
硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等， 其中以硫酸铵最为常用。
因为硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小
(在25℃ 时，溶解度为767g／L；0℃时，溶解度 为697g／L)不影响酶的活性，分离效果好，而且 价廉易得。
然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且
铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也 用其他中性盐进行盐析。
（二）有机溶剂沉淀法
常用的是乙醇、丙酮。能使蛋白质在水中溶 解度降低： 改变介质的介电常数 与蛋白质争夺水化水 聚乙二醇：脱去蛋白质的水化层
（三）等电点沉淀法
利用两性电解质在等电点时溶解度最低, 以及不 同的两性电解质有不同的等电点这一特性, 通过 调节溶液的pH值, 使蛋白质或酶或杂质沉淀析 出，从而使酶与杂质分离的方法。 当溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电 点时, 该两性电解质分子的净电荷为零, 分子间 的静电斥力消除, 使分子能聚集在一起而沉淀。
蛋 白 质 沉 淀
3. 蛋白质分离纯化的方法依据性质
蛋白质分子的大小 蛋白质溶解度
蛋白质电荷状况
蛋白质吸附性质 蛋白质生物学亲和性
依据分子大小不同的纯化方法
(一) 透析和超滤
透析：利用蛋白质不能
透过半透膜的性质,分离
无机盐、单糖等小分子。
超滤：利用压力或 离心
力分离无机盐、单糖等 小分子。
μR =
样品迁移距离
前沿(染料)迁移距离
3. 蛋白质的胶体性质
具有胶体的一切特性（布朗运动、丁达尔现象、
不能透过半透膜、具有吸附能力）
亲水胶体稳定性 ：
（1）直径1-100nm;
蛋白质和氨基酸的代谢试验
蛋白质和氨基酸的代谢试验蛋白质和氨基酸代谢试验是一种用于研究蛋白质与氨基酸在生物体内代谢及运输过程的实验方法。
通过该实验可以了解生物体对蛋白质和氨基酸的吸收、运输、分解及合成等过程，对研究生物体的营养代谢、健康状况等具有一定的意义。
实验原理蛋白质和氨基酸是构成生物体的重要分子，参与许多重要的生物过程。
在蛋白质和氨基酸代谢过程中，包括蛋白质的降解成氨基酸、氨基酸的运输和重组成蛋白质等步骤。
通过蛋白质和氨基酸的代谢试验，可以研究这些过程的细节和机制。
实验步骤1.标记试验物质：使用稳定同位素标记蛋白质或氨基酸，以便在代谢过程中跟踪。
2.给予试验动物：将标记的蛋白质或氨基酸给予实验动物。
3.收集样本：在一定时间间隔内，收集动物的血液、尿液等样本，用于分析标记物质的代谢产物。
4.分析数据：使用质谱或放射自显影等技术，分析样本中标记物质及其代谢产物的含量、浓度等信息。
5.数据处理：对实验数据进行统计分析和处理，得出蛋白质和氨基酸的代谢速率、清除率等参数。
实验应用1.生物学研究：通过蛋白质和氨基酸的代谢试验，可以研究生物体内蛋白质的合成、降解等过程，从而深入了解细胞的代谢机制。
2.营养学研究：通过监测氨基酸的代谢，可以评估膳食蛋白质的质量和消化吸收情况，为合理的膳食建议提供依据。
3.药物研发：在新药研发过程中，蛋白质和氨基酸代谢试验可用于评价药物对蛋白质代谢的影响，从而为药效评价提供参考。
结论蛋白质和氨基酸的代谢试验是一种重要的生物学研究方法，通过该实验可以深入了解蛋白质和氨基酸在生物体内的代谢机制。
该实验在生物学、营养学以及药物研发领域具有广泛的应用前景，有助于揭示生物体内复杂的代谢网络，为健康推动研究提供重要数据支持。
蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离
实验六蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离一、目的1．学习水解蛋白质的方法。
2．掌握纸层析的基本技术。
3．学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方法。
二、原理1．蛋白质的水解蛋白质可以用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸。
实验室中常使用酸解法水解蛋白质。
当在6 mo叭。
盐酸溶液中将蛋白质在110t加热大约20 h，肽键断裂，此时蛋白质完全分解为氨基酸。
酸法水解蛋白质的优点是在水解过程中不发生外消旋作用，所得到的氨基酸均为L一氨基酸。
大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的，但色氨酸则完全被破坏。
丝氨酸和苏氨酸在酸解过程中或多或少地也有破坏。
色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质——腐黑质，因此，用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。
2．纸层析法分离氨基酸纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。
它利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数，经层析而达到分离的目的。
在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数，若以K表示分配系数层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。
滤纸纤维素与水有较强的亲和力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸重的22％左右（其中约有6％的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形成流动相。
层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。
随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点不断向前移动，溶质中各组分的分配系数不同，前进中出现了移动速率差异，通过一定时间的层析，不同组分便实现了分离。
蛋白质溶解度不同的分离纯化方法
蛋白质溶解度不同的分离纯化方法
1. 氨基酸交换色谱：适用于具有较低等电点的蛋白质，包括许多细胞因子和酶类。
这种方法基于氨基酸的pH依赖性电荷，通过控制溶液的pH值来实现蛋白质的分离纯化。
2. 凝胶过滤层析：适用于具有较高分子量的蛋白质，其分离基于蛋白质分子大小和形状的差异。
它可以将具有相似分子量但不同形状的蛋白质分离开来。
3. 离子交换层析：适用于具有不同电荷的蛋白质，该方法主要是通过控制盐浓度和pH值来实现蛋白质的分离。
4. 亲和层析：适用于特异性相对较高的蛋白质分离，通过将蛋白质与一种特异性结合剂结合，并通过洗脱来实现纯化。
5. 逆相层析：适用于脂溶性蛋白质分离，该方法基于蛋白质和逆相柱填料之间的亲疏水性相互作用来实现分离纯化。
6. 碘化钾加速沉淀：适用于大多数蛋白质，特别是对于极性蛋白质具有优异的效果。
它通过加入碘化钾使蛋白质缓慢地沉淀下来，然后可以通过离心来分离纯化。
蛋白质测序中的氨基酸分离与定量
蛋白质测序中的氨基酸分离与定量蛋白质测序是确定全部或部分蛋白质或肽的氨基酸序列的实际操作程序。
蛋白质测序也可以用来鉴定蛋白质或表征其翻译后修饰。
通常情况下，蛋白质的部分测序就可以提供足够的鉴定信息（一个或多个序列标签）。
蛋白质测序的两种主要直接方法是质谱法和使用蛋白质测序仪（测序仪）进行的Edman降解法测序。
目前使用最广的蛋白质测序和鉴定方法是质谱法，而Edman降解则是表征蛋白质N 端最重要的方法之一。
确定蛋白质的氨基酸组成通常我们希望能在找到有序序列之前先知道蛋白质的氨基酸组成，这有助于我们发现测序过程中的错误并修正最终结果。
了解蛋白样品中氨基酸的组成，可协助判断哪种蛋白酶才适用于该蛋白质的水解，此外还可以确定蛋白质中低水平非标准氨基酸（例如正亮氨酸）的掺入错误。
确定氨基酸组成的通用方法通常被称为氨基酸分析：1. 将已知数量的蛋白质水解成其组成成分氨基酸；2. 以合适的方式分离并定量氨基酸。
蛋白质水解通过将蛋白质样品在6 M盐酸中加热到100–110 °C，并保持该温度 24小时或更长时间来完成水解，有许多庞大的疏水基团的蛋白质可能需要更长的加热时间。
但是，因为这些反应条件非常剧烈，以至于某些氨基酸（丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，色氨酸，谷氨酰胺和半胱氨酸）会发生降解。
为解决此问题，Biochemistry Online建议可以通过给不同的样品加热不同的时间，分析每种生成的溶液，并推测零水解时间。
Rastall建议使用各种能够防止或减少降解的试剂，例如硫醇试剂或苯酚，以保护色氨酸和酪氨酸不受氯的侵蚀，并预氧化半胱氨酸。
他还建议通过测量氨的释放量来确定酰胺水解的程度。
氨基酸分离与定量可以通过离子交换色谱法分离氨基酸，然后进行衍生化来帮助检测。
更常见的方法是将氨基酸进行衍生，然后通过反相HPLC来解决。
以NTRC提供的离子交换色谱法为例：使用磺化聚苯乙烯作为基质，将氨基酸加入酸溶液中，用逐渐增加pH的缓冲液冲洗柱子。
纸层析法分离氨基酸原理
纸层析法分离氨基酸原理纸层析法是一种常用的生物化学分离技术，它基于氨基酸在不同溶剂中的分配系数不同而进行分离。
在进行纸层析法分离氨基酸时，我们需要了解氨基酸分子结构的特点以及纸层析法的原理和操作步骤。
首先，让我们来了解一下氨基酸的结构。
氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，它由氨基（NH2）、羧基（COOH）、一个氢原子和一个侧链基团组成。
氨基酸的侧链基团决定了不同氨基酸的特性，使它们在纸层析法中表现出不同的行为。
纸层析法的原理是基于氨基酸在纸质吸附剂上的吸附和移动性差异。
当样品溶液在纸上进行展开时，氨基酸会根据其在溶剂中的分配系数在纸上形成不同的斑点。
这些斑点会随着溶剂的上升而移动，最终形成不同的色带，从而实现氨基酸的分离。
在进行纸层析法分离氨基酸时，我们首先需要准备好实验所需的设备和试剂，包括纸层析板、样品溶液、吸附剂、上升溶剂等。
然后，我们将样品溶液加载到纸层析板上，待样品展开后，将其放入上升溶剂中进行分离。
分离完成后，我们可以通过各种检测方法对氨基酸进行定量或定性分析。
纸层析法分离氨基酸的原理简单易懂，操作也相对简便，因此被广泛应用于生物化学和分析化学领域。
它不仅可以用于氨基酸的分离和检测，还可以用于其他有机分子的分离和纯化。
通过对纸层析法的理解和掌握，我们可以更好地开展相关实验和研究工作，为生物化学领域的发展贡献力量。
总之，纸层析法分离氨基酸的原理是基于氨基酸在纸质吸附剂上的吸附和移动性差异，通过这一原理，我们可以实现对氨基酸的分离和定量分析。
掌握纸层析法的原理和操作方法对于开展生物化学和分析化学方面的研究具有重要意义，希望本文能对您有所帮助。
纸层析法分离氨基酸原理
纸层析法分离氨基酸原理纸层析法是一种常用的生物化学实验方法，它通过溶液在纸上的上升作用，利用毛细管作用和分子间相互作用的差异，使混合物中的成分在纸上移动并分离开来。
而氨基酸是生物体内重要的有机化合物，它们是蛋白质的组成部分，对生命活动起着重要的作用。
那么，纸层析法是如何分离氨基酸的呢？下面我们就来探讨一下纸层析法分离氨基酸的原理。
首先，我们需要准备一张纸层析板，将其放入含有氨基酸的溶液中，待纸层析板吸收足够的溶液后，将其取出并晾干。
接下来，将纸层析板立起来，放入一个密闭容器中，加入适量的移动相溶液，使纸层析板底部浸泡在溶液中，然后封闭容器，让溶液上升至纸层析板的顶部。
在这个过程中，溶液会在纸上上升，而不同的氨基酸成分会因为其在纸上的吸附、毛细管作用和分子间相互作用的差异而在纸上移动的速度不同，从而实现氨基酸的分离。
纸层析法分离氨基酸的原理主要涉及到两个方面的因素，一是氨基酸与纸层析板之间的吸附作用，二是溶液在纸上的上升作用。
首先，不同氨基酸的分子结构和性质不同，它们与纸层析板之间的吸附作用也会有所差异。
一些氨基酸分子与纸层析板之间的吸附作用较强，会使其在纸上停留更久，而另一些氨基酸分子的吸附作用较弱，会使其在纸上停留的时间较短。
其次，溶液在纸上的上升作用也会影响氨基酸的分离。
溶液在纸上上升的速度与纸的毛细管作用和分子间相互作用有关，而不同氨基酸分子与溶液之间的相互作用也不同，因此它们在纸上上升的速度也会有所不同。
通过以上原理，我们可以利用纸层析法来分离混合氨基酸溶液中的不同成分。
在实际操作中，我们可以根据氨基酸的特性和纸层析板的选择，调整溶液的成分和上升速度，从而实现对氨基酸的有效分离。
纸层析法分离氨基酸的原理简单易行，成本低廉，因此在生物化学实验中得到了广泛的应用。
总的来说，纸层析法分离氨基酸的原理主要涉及到氨基酸与纸层析板之间的吸附作用和溶液在纸上的上升作用。
通过调整实验条件，我们可以有效地利用纸层析法来分离氨基酸混合物中的不同成分，为生物化学研究提供了重要的实验手段。
蛋白质、氨基酸理化性质和提取
加热变性沉淀法
利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的 亲和力，使生物分子分离纯化
将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特 性结合在一起，实现组分分离
3.离心分离
• 离心分离是借助离心机旋转所产生的离心力，根据物质 颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物 质分离的技术。
常用的离心方法：
✓密度梯度离心：样品在密度梯度介质中进行离心，使沉 降系数比较接近的组分得以分离
✓差速离心采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度 不同的颗粒分批分离
离心分离的条件
1. 离心力-由离心速度决定，用转子每分钟的转数表示。
2. 离心时间-指颗粒从样品液的液面完全沉降到离心管底的时间
3．温度和pH值
• 离心温度一般控制在4℃左右，对于某些热稳定性较好的蛋白质等， 也可在室温下进行离心。但在超速或高速离心时，转子高速旋转会 发热，从而引起温度升高。故必须采用冷冻系统，使温度保持在一 定范围内。
蛋白质的理化性质 和提取工艺
目录
一、两性性质及等电点 二、胶体性质 三、变性与复性作用 四、蛋白质的沉淀作用和沉降作用 五、蛋白质的颜色反应 六、蛋白质的紫外吸收性质
七、蛋白质的提取工艺特性
一、两性性质及等电点
蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游 离的氨基和羧基，因此蛋白质与氨基酸一样 具有两性解离性质，具有特定的等电点（pI）。
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Kd=CA / CB
其中: Kd---------分配系数 CA--------某物质在A相(动相)中的浓度 CB--------某物质在B相(静相)中的浓度
一般混合物中各成分的分配系数差异越大, 越容易分离。
A. 逆流分溶（逆流分配）
– 化学组成法 – 渗透压法 – 超离心法（沉降分析法） – 凝胶过滤法 – 聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
(一) 化学组成法测定最低Mr
元素(分子)分子量
•
最低Mr =
元素(分子)百分含量
例如: Mb Fe原子量(55.8 )
最低Mr = Fe元素百分含量 (0.335%)
=16700
(二) 沉降速度法测定蛋白质Mr
内部具有很细微的多孔网状结构。
❖凝胶层析的机理是分子筛效应, 即可以把物质
按分子大小不同进行分离, 但这种“过筛”与 普通的过筛不一样。
❖在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而
沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分 子可以进人凝胶颗粒内部的多孔网状结构， 流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品 中分子大小不同的物质得到分离。
茚三酮
反应螺旋管 光源
波长440和540nm
氨基酸分析仪图解
在pH3左右，氨基酸与阳离子交换树脂之间静电吸引大小次序为： 碱性氨基酸(A2+) > 中性氨基酸(A+) > 酸性氨基酸(A°)
氨基酸的洗脱顺序为：酸性氨基酸、中性氨基酸、碱性氨基酸。
分离氨基酸混合物常用强酸型阳离子交换树脂。
F. 高效液相色谱 ( high performance liguid chromatography， HPLC )
氨基酸混合物的分析分离
❖氨基酸的分析分离工作是测定蛋白质结构的
基础，分离和定量测定蛋白质水解液中的各 种氨基酸是一项艰巨的任务。
❖层析是利用混合物中各组分的理化性质的差
别，使各组分以不同程度分配在两相（固定 相和流动相）中，并使各组分以不同速度移 动，从而达到分离。
分配层析的一般原理
❖ 层析即色层分析又称“色谱”(chromatograghy）。
度、渗透压、膨胀性及导电能力也降为最低 值。
蛋白质的两性解离和等电点
蛋白质在等电点的溶解度最小
❖等离子点：
指在没有其他盐类干扰时，蛋白质质 子供体基团解离出的质子数与质子受体基 团结合的质子数相等时的pH, 为蛋白质特 征常数。
2. 蛋白质分子的大小及其形状
❖蛋白质相对分子质量(Mr)在6000～1 000 000之间。 ❖测定蛋白质相对分子质量的主要方法
❖这种分离主要与各种离子所带电荷有关，在
电荷相同时，与极性，非极性有关。
阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基 SO3H（强酸型），羧基-COOH（弱酸型）
阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如季胺基 N+(CH3)3OH-
缓冲液泵 洗脱剂
样品注入口 离子交换柱
已分开的 氨基酸
记录仪
茚三酮泵
光电倍增管
➢1.研究蛋白质的分子结构； ➢2.研究蛋白质的生物功能； ➢3.蛋白质的应用。
❖蛋白质分离纯化的方法
➢利用各种蛋白质的性质差别。
蛋白质的性质
1. 蛋白质的酸碱性质
❖蛋白质为两性电解质 ❖蛋白质等电点(pI)
➢pH﹤pI, 蛋白质带正电荷; pH﹥pI 带负电荷;
pH = pI时为两性离子。
➢蛋白质溶液处于等电点时，溶解度最小；粘
分子筛层析的工作原理
凝胶过滤层析 (分子排阻)
logMr = k + cve Ve：为实际测得的洗 脱体积(即自加样至组 分洗脱峰出现时流出 的体积)
交联葡聚糖Sephadex G-50 ( 1 500 ~ 30 000 ) G-75 ( 3 000 ~ 80 000 ) G-100 ( 4 000~150 000 )
数，用s 表示。
s=(dx/dt)/ω2χ= mp(1-υρ)/f 沉降系数只与分子的大小和形状有关，当分 子形状相似时，s与Mr成正比。因此s常用作生 物大分子的大小表示方法。
❖由于s值较小，因此用1×10-13秒表示1个沉降系
数单位（ Svedberg unit）。S值与温度和溶剂 有关，故一个分子的沉降系数定义为20℃，水 溶液条件下的s值为标准。
Kd=1
Kd=3
B
分
纤维素、淀 粉、硅胶等
配
柱
层
析
茚三酮 显色定量
单向纸层析图
Rf值
C. 纸层析：常用于氨基酸混合物的分离、鉴定
双向纸层析图
纤维素粉、
D
硅胶、氧化 铝等
薄 层 层 析
E. 离子交换层析
❖原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为
支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与 溶液中的离子进行交换反应。由于各种离子 交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不 同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度 移动，从而达到分离的目的。
❖蛋白质在离心场中沉降时:
➢Fc(离心力) = mpω2χ ➢Fb(浮力) = Vpρω2 χ= mpυρω2χ ➢Ff(摩擦力) = fv = f(dχ/dt) ❖通过测定沉降界面的移动速度测定Mr.
dx/dt 为常数时:
Fc - Fb = Ff
(dχ/dt)
mp（1-υρ）
=
ω2χ
f
❖沉降系数：单位离心力场的沉降速度叫沉降系
1S = 1×10-13（s）
由于蛋白质分子的沉降速度同时受到分子的 大小和形状的影响，大小与质量有关、而形状与 其扩散系数有关：
mp = Mr/N f = RT/ND
s = mp(1-υρ)/f
RTs Mr = ——————
D（1－ υρ）
(三) 凝胶过滤法测定蛋白质Mr
❖凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质。其
(四) SDS-PAGE测定蛋白质Mr
❖SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，
可破坏蛋白质氢键和疏水作用使蛋白质变性。
❖SDS带有很多负电荷，与蛋白质结合（1.4克
SDS/1克蛋白质）后，SDS的负电荷远远超过了蛋 白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就 变得无足轻重了，所以在电场上移动的速度完全 取决于蛋白质分子的大小。
分 辨 率 高
洗 脱 速 度 快
蛋白质的性质和分离纯化
❖蛋白质的性质
❖蛋白质的分离纯化及含
– 蛋白质的酸碱性质 量测定
– 蛋白质分子的大小
与形状
➢蛋白质分离纯化的一般
原则
– 蛋白质的胶体性质 ➢蛋白质分离纯化的步骤
与蛋白质的沉淀
➢蛋白质分离纯化的方法
– 蛋白质的颜色反应 ➢蛋白质含量的测定
❖蛋白质分离纯化的目的