表观基因组学研究技术现状与展望

表观基因组学研究技术现状与展望

表观基因组学研究技术现状与展望李升伟/编译真核基因组大多数由核小体组成，它们的结构是接近147bp的DNA包绕在基本的组蛋白十聚体周围，然后

异固缩成为染色质。包绕着DNA的核小体通过接近1万倍的固缩形成了中期染色体，这对有丝分裂时姐妹基因组的忠实分离至关重要。间期时，由

于核小体占了染色质结构的近70%，它们必须在以下需要DNA的过程中解旋开来：复制、转录、修复和与调控蛋白的结合。核小体的分布、定位

和构成，与组蛋白和DNA的化学修饰一起，构成了附加在基因组之上的复杂景观：表观基因组。与许多生物体的基因组序列现在本质上得到完全测

序不同的是，对它们的表观基因组的探询还很不完整，这归因于个体表观基因组结构的复杂性和动力学。在原核生物中，序列特异性DNA结合蛋白

质位于真核生物转录调控层级结构的最上层，而转录因子的分化表达导致了细胞类型特异性差异。许多其它关键的染色质元件在生物体的所有细胞中

都得到了发现，作为转录因子结合的结果，动态性地改变了它们的分布。组蛋白变异本的合并和组蛋白尾巴的共价修饰有助于介导某种基因的表达状

态的遗传，系通过调控对DNA的获得与否。另外，数百种染色质联会蛋白质――包括ATP依赖性染色质重构物类和组蛋白修饰酶类――与染色质

相互作用来调整其结构。值得注意的是，核小体重构物类和染色质组蛋白成分的突变已经与人体发育性疾病和癌症取得了联系。因此，染色质结构和

影响其的蛋白质的高分辨率基因组分析成为了生物学技术研发的

主要焦点，用来研究基本细胞过程和人体疾病的发病机理。许多方法已经被用来探查

表观基因组的各方面问题，但是到近期为止，表观基因组特征化的全基因组方法如ChIP-chip和MeDIP的分辨率只达到了数百碱基对的

数量级，使用的是基于杂交的读出技术和随机片断化基础上的染色质制备规程。但是，随着大规模并行短读出DNA测序方法的出现，以及其单碱基

对分辨水平的潜能，人们已经恢复了对染色质特征化传统方法的兴趣，这些方法包括使用亚硫酸氢盐测序法于DNA甲基化的作图，和使用非特异性

核酸酶如微球菌核酸酶（MNase）、脱氧核糖核酸酶I（DNaseI）和核酸外切酶。碱基对分辨水平的表观基因组作图技术微球菌核酸酶消解配合平铺式微阵列分析（MNase-seq）使用MNase来消解染色质长久以来都被用于研究以一种低通量方式研究染色质结构，最近已

经与平铺式微阵列分析（MNase-chip）和大规模并行DNA测序（MNase-seq）相结合，来研究核小体定位、分布、构成和全基因组修饰问题。MNase是一种单链特异性分泌性糖蛋白，被认为可以切断DNA的一条链从而解开螺旋，然后切断另一条链，从而产生一种双链

断裂。MNase明显地“一口一口地咬断”暴露的DNA末端，直到其达到一种阻碍物如某个核小体。尽管MNase已经初步用于了核小体研究

，其作用模式提示其将被任何阻碍物如DNA结合蛋白沿DNA进行了阻滞，从而可以确定被非组蛋白性蛋白质保护的基因组区域。通过将MNas

e消解与保护DNA的匹配端测序方法相结合来精确测定片断长度，特定大小的MNase保护颗粒可以得到恢复，不考虑提纯和作图亲和力的情况

。事实上，在果蝇细胞中，我们已经使用匹配端MNase-seq?技术来对两种核小体分布进行作图并中止RNA聚合酶II的活性。Kent 等人还应用匹配端MNase-seq技术于天然酵母染色质，来对两种核小体和序列特异性转录因子进行定位作图。Floer等人应用MNas e消解法联合匹配端交联染色质免疫沉淀法即(X-ChIP)-seq，来鉴定RSC复合体（染色质结构重塑物）的结合位点，正在鉴定部分解旋的核小体。重要的是，这些研究证明了短至50bp的DNA片断可以在MNase消解后得到恢复，提示MNase-seq技术不仅可以用于核小体分析还可以用于表观基因组作图。作为MNase消解的读出结果和表观基因组学业基本方法，匹配端测序技术的基本局限性在于，标准短读

出测序文库制备方法的最优化水平只达到了核小体大小（接近150bp）或更大一些的DNA片断，还涉及到DNA的大小选择问题，而由转录因

子保护的DNA区域经常达到更小的数量级规模。为了解决这种局限性，我们引入了一种修正了的文库构建方法来加速DNA片断的匹配端测序，小

到接近25bp。通过将调整MNase消解时间点与作图片断大小范围（从接近25bp到大于200bp）相结合，我们分析了核小体和非组蛋

白性蛋白质的分布和动力学。值得注意的是，亚核小体颗粒和核小体颗粒可以分布于细胞群体内的同一基因组位点上，提示在核小体和其它染色质相

关因子之间存在着高度动态性的相互作用。匹配端测序可以提供片断位置和长度数据，这两个参数可以显示为一种二维的“散点图”。每个点的X轴

位置代表着片断中点到基因组特征如转录因子结合位点（TFBS）中心的距离，而Y轴位置则代表着片断的长度。得到的图形呈“V形图”，因为

转录因子保护的最小DNA区域位于V形曲线的顶点，X轴值指示

片断中点、Y轴值为其长度。基于对多于100个转录因子的V形图的计算，已知

参与了核小体定位的转录因子的结合位点如Abf1和Reb1，显示了定位良好的侧翼核小体，其上面布满了亚核小体颗粒。V形图还被用于Ch

IP数据，证明了接近125bp的功能着丝粒序列的三联体结构精确地对应于含Cse4着丝粒核小体的分布，由于Cbf1转录因子和着丝粒特

异性Cbf3复合体的作用而立即分枝生长。MNase-seq方法组合匹配端测序方法为表观基因组学表达谱分析提供了几种优势。使用一种测

序了的样品对不同大小的基因组片断进行作图，可以对核小体和大量非组蛋白性蛋白质的基因组分布进行评估，此方法的性价比非常优秀。该方法并

不需要表位标签或抗体，因此很容易地适用于一系列细胞类型，尤其是那些没有亲和性试剂的细胞。对大至果蝇和小鼠的基因组上片断进行精确作图

需要对每个片断末端进行少至25个循环的测序，而使用更少的循环可以减少测序的机时和成本。尽管MNase拥有一种众所周知的AT 切割优先

性，在实际应用中它会导致一种微小的作图偏倚，在有必要时可以减轻计算压力。用于对非核小体颗粒进行MNase-seq测序的基本缺陷是，

这样的颗粒的身份鉴定在单独使用这种方法的情况下是无法正式建立的，因为许多蛋白质可能与相同序列相结合。但是，非核小体颗粒从可溶性天然

染色质中的恢复提示这种材料适用于高分辨率ChIP-seq测序；事实上，它已经被成功地应用于对果蝇使用间断性RNA聚合酶II进行Ch

IP-seq作图。天然染色质ChIP-seq测序（N-ChIP）的应用还为