注射用重组人生长激素无菌检查法验证方案(修订版)

审批及颁发：
会审：
分发：
一、目的
以确认供试品在实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计，为重组人生长激素无菌检查法提供依据，特进行本产品的无菌检查方法学的验证。

二、范围
注射用重组人生长激素无菌检查方法学验证方案
三、职责
验证组织及人员职责
四、术语
无
五、内容
1概述：注射用重组人生长激素是我公司的主打产品，其属于注射剂类里面的注射用无菌粉末。

根据《中国药典》2010年版的要求，本产品需对无菌检查方法学进行验证，以确认供试品在实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计，所采用的方法适合于本产品的无菌检查。

2验证项目
3 验证时间安排
3.1 2012年10月20日至 2012 年11月05日制订、审核及批准验证方案；
3.2 2012年11月06日至 2012 年12月 10日实施验证
3.3 2012年12月11日至 2012年12月 20日写出验证报告
4 验证前提条件确认
4.1 相关文件及人员培训确认
4.1.1 相关文件确认
结论: 检查人/日期：复核人/日期：
4.1.2 验证人员确认
结论: 检查人/日期：复核人/日期：
4.2 验证用仪器仪表和物品有效性确认
结论: 检查人/日期：复核人/日期：
4.3培养基的适用性检查
培养基的检查包括无菌检查和灵敏度检查，符合规定者方可用于供试品的无菌检查和无菌检查方法验证。

培养基的无菌检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行，但是，一旦所用培养基不符合无菌要求，供试品的无菌检查结果应视为无效。

培养基的灵敏度检查应对购进的每个批号的脱水培养基进行灵敏度检查，检查合格后方可使用，但当培养基的配制方法与灭菌程序发生变更时，应再次对培养基的灵敏度进行检查。

4.3.1 培养基的无菌检查
该项目与同样品检验同时进行。

每批培养基随机取不少于5支，将灭菌后的培养基按规定的温度培养14天应无菌生长。

4.3.2 培养基灵敏度检查的操作及结果判定
取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，每支接种菌量为1ml(含菌小于100cfu)，另一支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种白色念珠菌、黑曲霉各2支，每支接种菌量为1ml(含菌小于100cfu)，另1支不接种作为空白对照，培养5天。

逐日观察结果。

空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。

4.3.2.1菌液制备：
(1)接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10mL营养肉汤培养基中,置30～35℃培养18～24小时，分别取上述培养物1mL加9mL0.9％的无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至(10-5、10-7)每1mL含菌数小于100 CFU的菌悬液。

(2)接种生孢梭菌的新鲜培养物至12mL硫乙醇酸盐流体培养基中,30～35℃培养18～24小时，取上述培养物1mL加9mL 0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至(10-7)每1mL含菌数小于100 CFU的菌悬液。

(3) 接种白色念珠菌的新鲜培养物至10mL改良马丁培养基中，置23～28℃培养24～48小时，取上述培养物1mL加9mL 0.9％的无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至(10-7)每1mL含菌数小于100CFU的菌悬液。

(4) 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，经23～28℃培养5～7天，取黑曲霉斜面培养物，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，取析出孢子悬液1mL 加9mL 0.9％的无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至(10-7)每1mL含菌数小于100CFU的菌悬液。

4.3.2.2菌液计数：
（1.）金黄色葡萄球菌
（2.）铜绿假单胞菌
（3.）枯草芽孢杆菌
（4.）生孢梭菌
（5.）白色念珠菌
（5.）黑曲霉菌
检查结果：
检验人/时间：复核人/日期：
4.3.2.3培养基灵敏度检验记录
培养基灵敏度检验记录
检查结果：
检验人/时间：复核人/日期：
5 验证过程
5.1菌液制备：
5.1.1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10mL营养肉汤培养基中,置30～35℃培养18～24小时，分别取上述培养物1mL加9mL0.9％的无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至(10-5、10-7)每1mL含菌数小于100 CFU的菌悬液。

5.1.2接种生孢梭菌的新鲜培养物至12mL硫乙醇酸盐流体培养基中,30～35℃培养18～24小时，取上述培养物1mL加9mL 0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至(10-7)每1mL含菌数小于100 CFU的菌悬液。

5.1.3接种白色念珠菌的新鲜培养物至10mL改良马丁培养基中，置23～28℃培养24～48小时，取上述培养物1mL加9mL 0.9％的无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至(10-7)每1mL含菌数小于100CFU的菌悬液。

5.1.4接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，经23～28℃培养5～7天，取黑曲霉斜面培养物，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，取析出孢子悬液1mL 加9mL 0.9％的无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至(10-7)每1mL含菌数小于100CFU的菌悬液5.2样品试液的制备（薄膜过滤法）：样品（3批）用250ml的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶解制成250ml/30瓶的供试液备用。

5.2.1试验组：在无菌室中，取一次性全封闭集菌器（三联）一套，将本品30瓶用250ml
的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶解，按薄膜过滤法均匀滤至三管中，用1500ml的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液均匀冲洗三张滤膜，分5次冲洗，每桶每次100ml，冲洗后夹住其中一管，在剩下两管中泵入改良马丁培养基(100ml)后，松开管口，夹紧另两筒，泵入硫乙醇酸盐培养基（100ml）后，夹紧管口；另取一套一次性全封闭集菌器（三联），另取本品30瓶用250ml的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶解，按薄膜过滤法均匀滤至三管中，滤完后用1500ml的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液均匀冲洗三张滤膜，分5次冲洗，每桶每次100ml，再分别向每管中泵入硫乙醇酸盐培养基（100ml）并夹紧管口。

将上述两套一次性全封闭集菌器移至阳性检查室，于前两管分别中接入小于100cfu的白色念珠菌和黑曲霉菌，余下四管中分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌、生孢梭菌，作为试验组。

硫乙醇酸盐流体培养基集菌器置30~35℃培养3-5天，改良马丁培养基集菌器置23~28℃培养3-5天，逐日观察。

5.2.2阳性对照组：在无菌检查室中，取一次性全封闭集菌器（三联）两套，操作同前，向两管中泵入改良马丁培养基（100ml），并夹紧管口，向后四管中分别泵入硫乙醇酸盐培养基（100ml）。

将上述两套一次性全封闭集菌器移至阳性检查室，于前两管中分别接入小于100cfu 的白色念珠菌和黑曲霉菌，后四管中分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌、生孢梭菌，作为阳性对照组。

硫乙醇酸盐流体培养基集菌器置30~35℃培养3-5天，改良马丁培养基集菌器置23~28℃培养3-5天，逐日观察。

5.2.3阴性对照组：在无菌室中，取一次性全封闭集菌器（三联）向两个管中分别泵入硫乙醇酸盐培养基、改良马丁培养基（100ml）夹紧，作为阴性对照组。

5.2.4菌液计数：
（1.）金黄色葡萄球菌
（2.）大肠埃希菌
（3.）枯草芽孢杆菌
（4.）生孢梭菌
（5.）白色念珠菌
（6.）黑曲霉菌
检查结果：
检验人/时间：复核人/日期：5.2.5无菌验证检验记录
检查结果：
检验人/时间：复核人/日期：
检查结果：
检验人/时间：复核人/日期：
检查结果：
检验人/时间：复核人/日期：
6 偏差及漏项的处理
6.1 如果在验证过程中出现偏差，应做出合理解释或针对相应的偏差项目进行整改，并进行再验证。

6.2 如果在验证过程中出现漏项，应及时对遗漏项目进行补验证
7 验证结果及评定
评价人：日期：
8 验证周期
本检测方法是药典方法，一般只需确认一次，但在产品的生产工艺，原辅料组份或检验条件发生改变时，检查方法应进行重新验证以证明方法仍然适用于本实验室
六、附录
无
七、相关文件
SOP-ZL-032-02 无菌检查法标准操作规程
SMP-ZL-002-01 生物检测室标准管理规程
SMP-ZL-008-01 培养基及检定菌标准管理规程
SOP-SB-071-01 集菌仪标准操作规程
SOP-SB-043-01 生物安全柜标准操作规程
SOP-SB-042-01 超净工作台标准操作规程
八、参考文件
1、《中国药典》2010年版
2、《中国药品检验标准操作规程》2010年版
3、《药品GMP指南-质量控制实验室与物料系统》（2011）
九、变更历史。