干血片苯丙氨酸荧光测定及质控资料讲解
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在pH5.8土0.1条件下，L甲硫氨酸、L半胱氨酸、 L谷氨酸、L组氨酸、L亮氨酸和L—甘氨酸对L 苯丙氨酸含量的测定无影响。
然而在高pH，例如pH6.5条件下，其他氨基酸 均会产生干扰，荧光强度明显减低。
L甲硫氨酸L半胱氨酸 L谷氨酸L组氨酸 L亮氨酸L—甘氨酸
茚
三
无荧光反应
酮
PH5.8土0.1
激发光 波长390nm
荧光 化合物
发射光 波长485nm
2、特点
②荧光法测定苯丙氨酸含量结果可靠， 批内和批间变异系数(CV)均小于10％。
③商业试剂盒的苯丙氨酸检测低限为 0.5mg/dl (30umol/L)。
④血胆红素浓度小于200umol／L时对实 验结果无干扰。
2、特点
⑤通过严格控制pH值可最大程度地降低其他氨 基酸的干扰。
2、特点
各种改进后的荧光测定法（McCaman和 Robins法）已广泛用于血清和干血滤纸 标本中的苯丙氨酸定量测定。
由芬兰Labsystems公司首先推出基于现代 微量反应板的荧光测定法（McCaman和 Robins法）测定干血斑中苯丙氨酸含量 的方法，适用于大规模新生儿疾病筛查。
二．仪器和试剂
1、原 理
从干滤纸血片上先提取出的苯丙氨 酸，与茚三酮形成一种荧光化合物。
苯丙 氨酸
茚 三 酮
荧光 化合物
1、原 理
加入二肽L亮氨酸—L丙氨酸后可大大提 高此荧光反应。
荧光 化合物
L亮氨酸 L丙氨酸
荧光 化合物
用琥珀酸盐缓冲液严格控制反应条件pH 值在5.8土0.1，可保证理想的荧光值和最 大的特异性。
AAE
33399 90001 90009 90017 90025 90033 90041 90049 90057 90065
B A E 33399
C B C1 66666
D B C1 66666
E C C2 88888
F C C2 88889
G D 33366 89993
H D 33366 89998
1、仪器
荧光 电脑 读数仪 显示屏
孵育 八道 振荡仪 加样器
单道 加样器
3 mm 自 动 打孔器 洗板仪
1、仪器
①、荧光读数仪； ②、孵育／振荡仪； ③、3mm打孔器，或打孔钳； ④、加样器；八道加样器。 以上仪器均由芬兰Labsystems公司提供。 ⑤、3mm实验血片塑料支架； ⑥、电脑、打印机； ⑦、冰箱。
浓度mg/dl 0 2 4 10 20
质控血片 C1 C2
浓度mg/dl 3 7
2、试剂
标准品和质控物(品)具有批号特征性。确 切值需参照每一试剂盒中校正品的记录单。 校正品由血细胞比容为50％一54％的人血 液制备。
⑩80%分析纯无水乙醇（自配）
三、实验操作
3．实验操作步骤
(1)做好实验登记，包括检测日期、检测 区间、复查样本号等。
2、试剂
芬兰Lab—systems苯丙氨酸荧光测定法试剂盒，包含如下物品：
白色酶标板（7） 标准品（5） 质控品（6）
铜试剂（4）
酶标板覆盖物
（1）琥珀酸缓冲液
（2）
（3）水合茚三酮 L-亮氨酸L—丙氨酸溶液
2、试剂
①琥珀酸缓冲 液（1） ： pH5.8土0.1， 加入0.05％ Bronidoxe(作为 防腐剂)；
2、试剂
⑥质控品 （6） ：含有 2个质控品的l 张滤纸，存于 装有干燥剂的 铝箔袋中；
2、试剂
⑦白板（7） ： 白色板(12*8孔)。 平底，聚苯乙烯； ⑧酶标板覆盖物： 在保温和洗脱期 间均使用塑料薄 膜将板覆盖；
2、试剂
⑨质控品和标准品的苯丙氨酸浓度数值的 卡片及说明书；
标准血片
S1 S2 S3 S4 S5
90072
试剂批号：85ZE1B-1 质控批号：85ZE1B- 1
标准浓度：0.4、2.4、4.7、10.0、20.0。 范 围：①高值：4.7-8.7，中值6.7。②低值：1.5-2.8，中值2.1。
3．实验操作步骤
(2)对照实验操作卡用打孔器在滤纸上围绕 血斑园心与边缘的中点打下直径3mm的标 准品和质控物(双孔)、复查和标本(单孔)， 并依次放置到洁净的白色板孔内。 (3)每孔加入80ul的80％乙醇溶液，用塑料 粘胶盖密封酶标板孔，室温振荡(900转／ 分)30分钟。
2、试剂
②.L-亮氨酸L— 丙氨酸溶液（2）： 加入0.05％ Bronidoxe(作为防 腐剂)；
2、试剂
③.水合茚三酮 （3）：水合茚三 酮溶液；
2、试剂
④.铜试剂（4）： 无水硫酸铜、酒 石酸钠钾和碳酸 钠溶液；
2、试剂
⑤.标准品（5） ： 含5种不同苯丙氨 酸浓度(mg/d1)的 干滤纸标准血斑。 存于装有干燥剂 的铝箔袋中；
苯丙氨酸 荧光测定法
一wk.baidu.com原 理
1、原 理
苯丙氨酸的荧光测定法是McCaman和 Robins在1962年建立的测定法，故又称 McCaman和Robins法。 四十年来不断改正和完善，现已有专门的 荧光检测仪及相配套的试剂盒。
它比细菌抑制法更灵敏、更快速、操作更 方便。绝大多数国家和地区使用此方法， 并延续至今。
干血片苯丙氨酸荧光测定及质控
一、苯丙酮尿症筛查的实验方法
目前用于PKU筛查的方法主要有： 1. 细菌抑制法 2. 荧光分析法 3. 酶法 4. 高效液相色谱法 5. 氨基酸分析法 6. 高效毛细管电泳法 目前我国苯丙酮尿症筛查的实验方法主要是细 菌抑制法和荧光分析法。我们省大都使用荧光 分析法。
编写好实验操作卡；把本次实验要做的 标准、质控、复查标本、重查标本及常 规标本的卡片号用不同的颜色写在操作 卡，看上去一目了然，严防打孔时张冠 李戴。
佛山市新生儿疾病筛查中心实验操作卡 检测项目: PKU 检测时间: 2003年11月11日 操作者：
1 第一板 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1、原 理
加入铜试剂稳定荧光复合物并终止反应， 在485nm波长处测定荧光强度。激发光波 长390nm。
其苯丙氨酸含与荧光强度成正比，即苯 丙氨酸含量越高荧光强度则越强，通过 检测已知浓度的标准血斑的荧光值并绘 制曲线则可求得各样本的苯丙氨酸浓度。
2、特点
：①荧光物质苯丙氨酸—茚三酮复合物， 吸收特定波长（390nm）的光能后，发生 原子重排，同时发射出波长（485nm）更 长的光。
然而在高pH，例如pH6.5条件下，其他氨基酸 均会产生干扰，荧光强度明显减低。
L甲硫氨酸L半胱氨酸 L谷氨酸L组氨酸 L亮氨酸L—甘氨酸
茚
三
无荧光反应
酮
PH5.8土0.1
激发光 波长390nm
荧光 化合物
发射光 波长485nm
2、特点
②荧光法测定苯丙氨酸含量结果可靠， 批内和批间变异系数(CV)均小于10％。
③商业试剂盒的苯丙氨酸检测低限为 0.5mg/dl (30umol/L)。
④血胆红素浓度小于200umol／L时对实 验结果无干扰。
2、特点
⑤通过严格控制pH值可最大程度地降低其他氨 基酸的干扰。
2、特点
各种改进后的荧光测定法（McCaman和 Robins法）已广泛用于血清和干血滤纸 标本中的苯丙氨酸定量测定。
由芬兰Labsystems公司首先推出基于现代 微量反应板的荧光测定法（McCaman和 Robins法）测定干血斑中苯丙氨酸含量 的方法，适用于大规模新生儿疾病筛查。
二．仪器和试剂
1、原 理
从干滤纸血片上先提取出的苯丙氨 酸，与茚三酮形成一种荧光化合物。
苯丙 氨酸
茚 三 酮
荧光 化合物
1、原 理
加入二肽L亮氨酸—L丙氨酸后可大大提 高此荧光反应。
荧光 化合物
L亮氨酸 L丙氨酸
荧光 化合物
用琥珀酸盐缓冲液严格控制反应条件pH 值在5.8土0.1，可保证理想的荧光值和最 大的特异性。
AAE
33399 90001 90009 90017 90025 90033 90041 90049 90057 90065
B A E 33399
C B C1 66666
D B C1 66666
E C C2 88888
F C C2 88889
G D 33366 89993
H D 33366 89998
1、仪器
荧光 电脑 读数仪 显示屏
孵育 八道 振荡仪 加样器
单道 加样器
3 mm 自 动 打孔器 洗板仪
1、仪器
①、荧光读数仪； ②、孵育／振荡仪； ③、3mm打孔器，或打孔钳； ④、加样器；八道加样器。 以上仪器均由芬兰Labsystems公司提供。 ⑤、3mm实验血片塑料支架； ⑥、电脑、打印机； ⑦、冰箱。
浓度mg/dl 0 2 4 10 20
质控血片 C1 C2
浓度mg/dl 3 7
2、试剂
标准品和质控物(品)具有批号特征性。确 切值需参照每一试剂盒中校正品的记录单。 校正品由血细胞比容为50％一54％的人血 液制备。
⑩80%分析纯无水乙醇（自配）
三、实验操作
3．实验操作步骤
(1)做好实验登记，包括检测日期、检测 区间、复查样本号等。
2、试剂
芬兰Lab—systems苯丙氨酸荧光测定法试剂盒，包含如下物品：
白色酶标板（7） 标准品（5） 质控品（6）
铜试剂（4）
酶标板覆盖物
（1）琥珀酸缓冲液
（2）
（3）水合茚三酮 L-亮氨酸L—丙氨酸溶液
2、试剂
①琥珀酸缓冲 液（1） ： pH5.8土0.1， 加入0.05％ Bronidoxe(作为 防腐剂)；
2、试剂
⑥质控品 （6） ：含有 2个质控品的l 张滤纸，存于 装有干燥剂的 铝箔袋中；
2、试剂
⑦白板（7） ： 白色板(12*8孔)。 平底，聚苯乙烯； ⑧酶标板覆盖物： 在保温和洗脱期 间均使用塑料薄 膜将板覆盖；
2、试剂
⑨质控品和标准品的苯丙氨酸浓度数值的 卡片及说明书；
标准血片
S1 S2 S3 S4 S5
90072
试剂批号：85ZE1B-1 质控批号：85ZE1B- 1
标准浓度：0.4、2.4、4.7、10.0、20.0。 范 围：①高值：4.7-8.7，中值6.7。②低值：1.5-2.8，中值2.1。
3．实验操作步骤
(2)对照实验操作卡用打孔器在滤纸上围绕 血斑园心与边缘的中点打下直径3mm的标 准品和质控物(双孔)、复查和标本(单孔)， 并依次放置到洁净的白色板孔内。 (3)每孔加入80ul的80％乙醇溶液，用塑料 粘胶盖密封酶标板孔，室温振荡(900转／ 分)30分钟。
2、试剂
②.L-亮氨酸L— 丙氨酸溶液（2）： 加入0.05％ Bronidoxe(作为防 腐剂)；
2、试剂
③.水合茚三酮 （3）：水合茚三 酮溶液；
2、试剂
④.铜试剂（4）： 无水硫酸铜、酒 石酸钠钾和碳酸 钠溶液；
2、试剂
⑤.标准品（5） ： 含5种不同苯丙氨 酸浓度(mg/d1)的 干滤纸标准血斑。 存于装有干燥剂 的铝箔袋中；
苯丙氨酸 荧光测定法
一wk.baidu.com原 理
1、原 理
苯丙氨酸的荧光测定法是McCaman和 Robins在1962年建立的测定法，故又称 McCaman和Robins法。 四十年来不断改正和完善，现已有专门的 荧光检测仪及相配套的试剂盒。
它比细菌抑制法更灵敏、更快速、操作更 方便。绝大多数国家和地区使用此方法， 并延续至今。
干血片苯丙氨酸荧光测定及质控
一、苯丙酮尿症筛查的实验方法
目前用于PKU筛查的方法主要有： 1. 细菌抑制法 2. 荧光分析法 3. 酶法 4. 高效液相色谱法 5. 氨基酸分析法 6. 高效毛细管电泳法 目前我国苯丙酮尿症筛查的实验方法主要是细 菌抑制法和荧光分析法。我们省大都使用荧光 分析法。
编写好实验操作卡；把本次实验要做的 标准、质控、复查标本、重查标本及常 规标本的卡片号用不同的颜色写在操作 卡，看上去一目了然，严防打孔时张冠 李戴。
佛山市新生儿疾病筛查中心实验操作卡 检测项目: PKU 检测时间: 2003年11月11日 操作者：
1 第一板 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1、原 理
加入铜试剂稳定荧光复合物并终止反应， 在485nm波长处测定荧光强度。激发光波 长390nm。
其苯丙氨酸含与荧光强度成正比，即苯 丙氨酸含量越高荧光强度则越强，通过 检测已知浓度的标准血斑的荧光值并绘 制曲线则可求得各样本的苯丙氨酸浓度。
2、特点
：①荧光物质苯丙氨酸—茚三酮复合物， 吸收特定波长（390nm）的光能后，发生 原子重排，同时发射出波长（485nm）更 长的光。