粘红酵母酪氨酸解氨酶在大肠杆菌中的异源表达

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芳香族氨基酸及其衍生物的研究进展

芳香族氨基酸及其衍生物的研究进展

2021年6月第21卷第2期廊坊师范学院学报(自然科学版)Journal of Langfang Normal University(N atural Science Edition)Jun.2021Vol.21No.2芳香族氨基酸及其衍生物的研究进展刘苹,苏卫卫(燕山大学,河北秦皇岛066004)【摘要】氨基酸是蛋白质的基本组成单元,氨基酸的缩合、衍生都与蛋白质的形成及功能相关。

芳香族氨基酸作为机体重要的氨基酸,生物学功能非常丰富。

介绍芳香族氨基酸的特征、芳香族氨基酸及其衍生物的合成及应用,并对芳香族氨基酸在营养学领域、人类医学、生物材料等方面应用进行重点阐述,对芳香族氨基酸的发展前景进行展望。

【关键词】芳香族氨基酸;生物合成法;氨基酸交联;生物材料Advances in the Study of Aromatic Amino Acids and Their DerivativesLiu Ping,Su Weiwei(Yanshan University,Qinhuangdao066004,China)[Abstract]Amino acids are the basic constituent units of proteins.The condensation and derivation of amino acids are related to the formation and function of proteins.As important amino acids in the body,aromatic amino acids have abundant biological functions.This article introduces the characteristics of aromatic amino acids,the synthesis and application of aro­matic amino acids and their derivatives,and focuses on the application of aromatic amino acids in nutrition,human medicine and biological materials and so on.The development prospect of aromatic amino acids is prospected in this article.[Key words]aromatic amino acids;biosynthesis;cross-linking of amino acids;biomaterials冲图分类号〕06-1〔文献标识码〕A〔文章编号〕1674-3229(2021)02-0027-080引言氨基酸作为生物活性分子,是蛋白质的基本组成单元。

淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌(amp+)中的表达

淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌(amp+)中的表达

淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌(amp+)中的表达一、相关背景淀粉酶是较早发现的酶类之一,早在1833年Payen和Persoz已首次从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀分离到淀粉酶。

1894年高峰让吉从米曲霉(Aspergillus oryzae)中提取出作为消化剂的酶,即高峰淀粉酶。

1919年法国Boidin和Effront首次用枯草杆菌生产淀粉酶。

淀粉酶(amylase,AMY,AMS)是作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1,4-葡聚糖,水解α-1,4-糖苷键的酶类的总称。

现在淀粉酶大致可分为四大类:第一类α-淀粉酶,广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽、山萮菜)及微生物。

第二类β-淀粉酶(EC3.2.1.2)从底物非还原性末端顺次水解每隔一个α-1,4糖苷键,切下的是麦芽糖单位。

第三类葡萄糖淀粉酶(EC3.2.1.3),习惯上简称糖化酶,从底物的非还原性末端顺次水解α-1,4糖苷键和分支的α-1,6键生成葡萄糖。

第四类解枝酶或异淀粉酶(EC3.2.1.9)只水解糖原或支链淀粉分支点α-1,6糖苷键,切下整个侧枝。

还有淀粉α-1,6葡萄糖酶是在分支点的葡萄糖单位仅一个时起作用。

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称,通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料,由于淀粉酶退浆机械作用小,水的用量少,可以在低温条件下达到退浆效果,具有鲜明的环保特色。

除此之外,不同性质的α-淀粉酶还具有许多不同的用途。

耐热性α-淀粉酶,由于使用时温度提高,液化完全,用酶量少,操作比较容易,β-淀粉酶在食品工业中主要用于制造麦芽糖浆、啤酒、面包、酱油等。

在制醋工业中,常用β-淀粉酶代替部分麸曲节省成本,在白酒和其他工业中也可以用其作糖化剂。

在医药工业上,β-淀粉酶的一个重要用途是制造麦芽糖,医学上常用该酶和α-淀粉酶一道作为消化剂使用。

二、目前研究情况1 .国内外研究机构由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶,国内外很多课题组对它进行了研究。

基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达技巧

基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达技巧

第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达前言基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。

基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。

基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动,即剪切下外源基因片段,拼接到另一个基因表达体系中,使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。

第一节基因的表达系统与表达策略一、最佳的基因表达体系:⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。

二、宿主细胞的选择(一)适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度的细胞;2、能利用易得廉价原料;3、不致病、不产生内毒素;4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态;5、容易进行代谢调控;6、容易进行DNA重组技术操作;7、产物的产量、产率高,8、产物容易提取纯化。

(二)宿主细胞分为两大类:1、原核细胞:常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等;2、真核细胞:常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。

大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。

优越性:①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。

②有各类菌株和载体系列。

③目前以实现多种基因的高效表达。

表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。

④易培养,成本低。

缺点:①大肠杆菌中的表达不存在信号肽,产品多为胞内产物,提取困难。

②因分泌能力不足,真核蛋白质常形成不溶性的包含体,表达产物需经变性复性才恢复活性。

③蛋白质不能糖基化。

产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。

④其内毒素很难除去。

酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。

其基因组小,世代时间短,有单倍体双倍体两种形式,繁殖迅速,无毒性。

能外分泌,产物可糖基化。

已有不少真核基因成功表达。

三、根据表达蛋白用途选择基因的表达策略1.生物化学和分子生物学研究2.表达蛋白质用作抗原3.结构研究真核基因表达的特点●一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽,不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式;●基因转录调节区很大,而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基,它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合,而是通过改变基因5’上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合;●mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作,而且通常都有复杂的成熟和剪接过程;●基因的启动子区和原核基因差异很大,而且有增强子序列存在。

细菌漆酶LacA在大肠杆菌中的异源表达.

细菌漆酶LacA在大肠杆菌中的异源表达.
组员(按学号排序如下):
刘艳红、王瑞、姚伟静、张明珠、康兴、程飞、 孙元元、刘燕红、程旭、査倩、潘伟民、傅声祥 汇报人:程飞
实验简介
实验过程
实验原理
实验材料
实验目的
一、实验简介
漆酶(Laccase)是一种含酮的多酚氧化酶,能够催化多种酚类和 非酚类化合物发生氧化,同时伴随由分子氧还原成水。
漆酶一般由500-600个氨基酸组成,不同来源的漆酶氨基酸序列的 相似程度较低,但是其催化位点序列相当保守。对漆酶的晶体结 构进行研究,发现其分子具有3个铜离子结合位点,共结合四个铜 离子。 野生漆酶的产量低,重组表达是提高漆酶产量的一种常用方法。 本实施主要通过由保守区设计简并引物扩增部分漆酶LacA片段, 以及反向PCR扩增已知序列临近的未知序列,并且通过序列拼接获 得完整的LacA基因序列,并转化大肠杆菌,进行异源高效表达。
二、实验目的
1. 获得细菌LacA基因 。 2. LacA在大肠杆菌中异源表达。
三、实验原理
1. 2. 3. 4. DNA重组。 简并引物。 酶。 TA克隆:将3´端具有单个“A”突出末端的PCR产物克隆到3´端具有单个“T”突出末端 的载体的克隆法。 5. 反向PCR: 反向PCR是一种新型的基因扩增方法,它能扩增一段已知序列旁侧的DNA。 6. 载体选择。 7. 蓝白筛选: 质粒载体含有大肠杆菌β -半乳糖苷酶基因(lacz)的启动子(受IPTG诱导)及其 编码α 肽链(β -半乳糖苷酶的氨基末端短片段)的DNA序列(特称为lacz基因)。受体大 肠杆菌细胞的β -半乳糖苷酶发生了突变,失去的氨基末端。当lacz基因编码的α 肽链同 失去了正常氨基末端的β -半乳糖苷酶突变体互补时,便会产生出有活性的β -半乳糖苷酶 分子,在IPTG诱导下,会启动表达,分解X-gal产生蓝色背景。当MCS中插入外源基因后, 会阻断α 肽链合成,不能形成互补,不能产生功能活性的β -半乳糖苷酶,也就不会产生 蓝色背景。所以含有重组质粒载体的克隆是白色的。

【CN109971784A】一种毕赤酵母中异源表达内切葡聚糖酶EGⅡEGⅣEGⅤ的构建方法【专利】

【CN109971784A】一种毕赤酵母中异源表达内切葡聚糖酶EGⅡEGⅣEGⅤ的构建方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910230812.8(22)申请日 2019.03.26(66)本国优先权数据201811127604.7 2018.09.26 CN(71)申请人 天津科技大学地址 300457 天津市滨海新区经济技术开发区第十三大街29号(72)发明人 钟成 舒月力 李栋梁 (74)专利代理机构 北京瑞盛铭杰知识产权代理事务所(普通合伙) 11617代理人 郑海松(51)Int.Cl.C12N 15/81(2006.01)C12N 9/42(2006.01)(54)发明名称一种毕赤酵母中异源表达内切葡聚糖酶EGⅡ,EG Ⅳ,EG Ⅴ的构建方法(57)摘要本发明的目的在于构建一种异源表达EG Ⅱ,EG Ⅳ,EG Ⅴ蛋白的重组毕赤酵母,具体步骤如:(1)里氏木霉RNA和CDNA的获得:固体诱导培养基获得菌丝体,试剂盒提取总RNA和cDNA;(2)目的基因的克隆:用合理引物PCR扩增出目的基因;(3)构建表达载体:以Ppic9k为载体,将目的基因插入启动子AOX1下游,5'和3'端酶切位点分别为EcoR Ⅰ,Not Ⅰ;(4)获取重组菌株:以bgl Ⅰ为表达载体的线性化位点,实现表达载体线性化,电转,得到重组酵母;(5)重组菌株的诱导产酶:摇瓶发酵,用适当甲醇诱导产酶;(6)重组蛋白活性检测:利用SDS -PAGE及刚果红-CMC检测重组蛋白的表达量及活性。

本方法构建的重组菌株能高效表达带his标签的蛋白,能得到高效单酶组分。

权利要求书1页 说明书3页 附图3页CN 109971784 A 2019.07.05C N 109971784A权 利 要 求 书1/1页CN 109971784 A1.一种毕赤酵母中异源表达内切葡聚糖酶EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ蛋白的构建方法,包括以下步骤:(1)里氏木霉RNA和CDNA的获得:将里氏木霉QM9414培养,直至出绿色孢子,然后接种于固体诱导培养基(表面贴有玻璃纸)获得菌丝体,用试剂盒提取总RNA和反转录得到cDNA;(2)目的基因的克隆:设计合理引物,合适的条件,PCR扩增出EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ的基因;(3)构建表达载体:以Ppic9k质粒为载体,将EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ基因插入启动子AOX1下游,5'端酶切位点为EcoRⅠ,3'端酶切位点为NotⅠ,构建Ppic9k-EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ表达载体;(4)获取重组菌株:以bglⅠ为Ppic9k-EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ表达载体的线性化位点,实现表达载体线性化,然后通过电转化转入毕赤酵母,得到EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ的重组酵母;(5)重组菌株的诱导产酶:将筛选后的菌株,摇瓶发酵,加入适当甲醇诱导产酶;(6)重组蛋白活性检测:刚果红-CMC方法检测重组毕赤酵母是否分泌有活性的纤维素降解酶;SDS-PAGE检测重组蛋白是否为目的蛋白及其蛋白表达量。

【CN109554325A】一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌及其应用【专利】

【CN109554325A】一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌及其应用【专利】
代理人 张勇
(51)Int .Cl . C12N 1/21(2006 .01) C12P 13/22(2006 .01) C12R 1/19(2006 .01)
( 54 )发明 名称 一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌及其
应用 ( 57 )摘要
本发明公开了一种可高产酪氨酸的大肠杆 菌工程菌及其应用,属于基因工程以及微生物工 程技术领域。本发明通过敲除大肠杆菌中编码芳 香族氨基酸转运蛋白的基因aroP和/或编码酪氨 酸特异性转运蛋白的基因tyrP的基础上,同时 , 在大肠杆菌中表达编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖 酸-7-磷酸( DAHP )合成酶( DS )的基因aroGfbr和/ 或编码分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶( CM-PD )的 基因tyrAfbr ,大大提高了大肠杆菌的酪氨酸产 量;利用本发明的大肠杆菌工程菌诱导发酵46h, 可使发酵液中酪氨酸的含量高达44 .5g/L,较大 肠杆菌HGXP提高了57%。
背景技术 [0002] 酪氨酸(L-tyrosine,Tyr)是一种人体的条件必需氨基酸,常被用作苯丙酮尿症患 者的 营养补充剂 ,多肽类激素 、抗生素 、L-多巴 等医药化工产品的 制备原料 ,以 及合成如白 藜芦醇 、柚皮素、生松素等高附 加值酪氨酸衍生物的 前体 ,被广泛应 用于食品 、饲料 、医药、 化工等行业。 [0003] 目前,工业上主要由酶法来制备酪氨酸,酶法具有周期短、选择性强、转化率高和 分离纯化步骤简单的优点,但是,天然酶活性低和稳定性差等缺点限制了酶法的应用。而与 酶法相比 ,微生物发酵法可以利用生物质原料实现酪氨酸的从头合成,从而降低酪氨酸的 生产成本,同时,微生物发酵法在稳定性方面具有明显对的优势。 [0004] 因此,利用微生物发酵法生产酪氨酸以代替酶法具有非常广阔的发展前景。 [0005] 但是,现有的酪氨酸生产菌,如E .coli DPD4193(Olson ,M .M .,Templeton ,L .J ., Suh ,W .,Youderian ,P .,Sariaslani ,F .S .,Gatenby ,A .A .,Dyk ,T .K .V .,2007 .Production of tyrosine from sucrose or glucose achieved by rapid genetic changes to phenylalanine-producing Escherichia coli strains .Appl Microbiol Biot .74 ,10311040)、E .coli ygdT KO(Santos ,C .N .S .,Stephanopoulos ,G .,2008 .Melanin-based highthroughput screen for L-tyrosine production in Escherichia coli .Applied and Environmental Microbiology .74 ,1190-1197 .)、E .coli F(Juminaga ,D .,Baidoo ,E .E .K ., Redding-Johanson ,A .M .,Batth ,T .S .,Burd ,H .,Mukhopadhyay ,A .,Petzold ,C .J ., Keasling ,J .D .,2012 .Mod ula r Engineering of L-Tyrosine Prod uction in Escherichia coli .Applied and Environmental Microbiology .78 ,89-98 .)等,酪氨酸产 量均较低,仅有0 .18g/L、0 .59g/L、2 .65g/L,这无疑大大阻碍了微生物发酵法生产酪氨酸的 工业化进程。 [0006] 因此,急需找到可提高酪氨酸生产菌酪氨酸产量的方法。

大肠杆菌异源表达ChSase ABCⅠ及合成芳香族化合物

大肠杆菌异源表达ChSase ABCⅠ及合成芳香族化合物

大肠杆菌异源表达ChSase ABCⅠ及合成芳香族化合物大肠杆菌(E.coli)作为一种宿主菌,具有基因操作简单,繁殖快等优点,在实验室中被当作首选宿主用来表达外源酶和合成重要化学物。

基于此,本研究选择E.coli作为宿主菌,实现了异源硫酸软骨素裂解酶ABCⅠ(ChSase ABC I)的高效表达和重要芳香族化合物的生物合成。

ChSaseABC I是一种能将大分子量硫酸软骨素(CS)降解成小分子量CS的多糖裂解酶。

本研究将融合标签麦芽糖结合蛋白(MBP)与ChSase ABCⅠ进行融合,实现了 MBP-ChSaseABCⅠ的可溶性表达。

通过表达宿主优化,其产量能达到3180.0 ± 19.0 IU/L fermentation liquor,同时探究了融合标签对ChSaseABCⅠ性质的影响。

其次,系统探究了工业常用His标签对ChSase ABC I性质的影响,发现His标签未对ChSase ABC I的聚合状态、最适作用温度和pH产生影响。

但是降低ChSase ABC I的催化效率和比酶活。

为提高ChSase ABC I对CS B 的活性,我们通过序列比对和分子模拟分析结构,用定点突变的方法,得到了对底物CSB活性比野生型高的ChSaseABCⅠ的突变体。

此外为进一步提高ChSase ABC I的表达量和酶活,我们发掘了一种新的融合标签3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),该酶是糖酵解途径中不可缺少的一种酶。

另外,其在实时荧光定量PCR(RT-PCR)实验中常被用作内参基因,原因在于其在表达时几乎不受实验条件的干扰。

随后,我们将该标签与ChSase ABC I融合表达后,结果显示融合有GAPDH标签的ChSase ABC I,其表达水平和酶活比未融合的ChSase ABC I分别提高了2.3和3.0倍。

经过发酵条件优化,在最优条件下,GAPDH-ChSaseABCⅠ产量能够达到28488.6 ± 2143.3 IU/L fermentation liquor(880.0 ± 61.0 IU/g wet cell weight),该产量也是目前报道的最高水平。

基因工程改造大肠杆菌生产酪氨酸探究实验方法

基因工程改造大肠杆菌生产酪氨酸探究实验方法

基因工程改造大肠杆菌生产酪氨酸探究实验方法随着生物技术的发展,基因工程在现代生物学研究中扮演着越来越重要的角色。

基因工程技术可以改变生物体的遗传信息,从而制造出更多有用的产品。

其中,大肠杆菌是一种常用的模式生物,被广泛应用于基因工程研究中。

利用基因工程技术改造大肠杆菌生产酪氨酸,不仅有助于提高酪氨酸的产量,还可以为相关领域的生物医学研究和产业生产提供帮助。

本文将探究基因工程改造大肠杆菌生产酪氨酸的实验方法,为相关研究和实验工作提供参考。

一、确定目标基因确定要改造的目标基因。

酪氨酸的合成受到多个基因的调控,因此需要明确哪些基因是影响酪氨酸合成的关键基因。

通过文献查找和生物信息学分析,筛选出与酪氨酸合成相关的基因,选取其中一个或多个作为目标基因进行改造。

二、构建重组质粒在确定了目标基因后,需要构建相应的重组质粒。

重组质粒是将外源基因导入到宿主细胞中的载体,通常包括启动子、终止子、选择标记基因等重要元件。

在构建重组质粒时,需要选择适合大肠杆菌的表达载体,并将目标基因插入其中。

还需要加入与目标基因配对的调控元件,以实现对目标基因的调控。

三、转化大肠杆菌构建好重组质粒后,需要通过转化技术将重组质粒导入大肠杆菌中。

转化技术包括热激冲转化、钙离子转化、电穿孔转化等多种方法,研究者可以根据实验需要选择合适的转化方法。

在实验中,可利用培养基或温度等条件诱导大肠杆菌产生细胞膜孔道,以有利于外源DNA的导入。

四、筛选阳性菌株转化后的大肠杆菌含有重组质粒,但并非每个菌落都成功导入了目标基因。

需要筛选出含有目标基因的阳性菌株。

通常可利用抗生素筛选、表型筛选等方法进行筛选,例如将重组质粒中的抗性基因与抗生素耐受性通联在一起,从而筛选出含有重组质粒的阳性菌株。

五、培养和表达筛选出阳性菌株后,需要进行培养和表达实验。

在培养实验中,首先需要确定最适合大肠杆菌生长和酪氨酸合成的培养条件,包括培养基成分、培养温度、培养时间等因素。

之后,通过测定酪氨酸合成产物的含量和相关酶活性等指标,评估目标基因的表达效果。

215502053_酵母生物活性物质及其化妆品功效研究进展

215502053_酵母生物活性物质及其化妆品功效研究进展

生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 3 期 345 ~ 352Current Biotechnology ISSN 2095‑2341进展评述Reviews酵母生物活性物质及其化妆品功效研究进展鲍佳生 , 潘丙珍 , 乔栖梧 , 刘慧智 , 潘素华广州海关技术中心,广州 510623摘 要:随着《化妆品监督管理条例》及其配套文件的实施,对化妆品原料安全性和功效性都提出了更具体的要求。

酵母能够合成多种生物活性物质且安全性高,利用酵母来获取化妆品功效原料已成为化妆品行业的创新突破口。

概述了酵母作为细胞工厂生产活性糖类、多肽类、萜类、维生素、多酚类等天然产物方面的研究进展,梳理总结了酵母提取物以及酵母相关生物活性物质的美白、保湿、舒缓、防晒、抗皱等多种化妆品功效,并展望了酵母在化妆品原料领域的开发和应用前景。

关键词:酵母;生物活性物质;化妆品功效DOI :10.19586/j.2095­2341.2023.0013中图分类号:Q939.97, TS974 文献标志码:AAdvances in Yeast Bioactive Substances and Their Cosmetic EfficacyBAO Jiasheng , PAN Bingzhen , QIAO Qiwu , LIU Huizhi , PAN SuhuaGuangzhou Customs Technology Center , Guangzhou 510623, ChinaAbstract :With the implementation of Cosmetic Supervision and Adminstration Regulation and its supporting documents , there are more specific requirements for the safety and efficacy of cosmetics. Because yeast can synthesize various bioactive substances with high safety , using yeast to obtain effective raw materials for cosmetics has become an innovation breakthrough in the indus⁃try. In this review , the research progress of yeast as a cell factory to produce bioactive sugars , peptides , vitamins , terpenoidsand other natural products was summarized. The effects of yeast extract and bioactive substances in yeast on whitening , moisturiz⁃ing , sunscreen , anti -aging and other cosmetics were introduced. The development and application of yeast as raw material of cos⁃metics were also prospected.Key words :yeast ; bioactive substances ; cosmetic efficacy酵母中富含活性糖类、多肽、核苷酸、氨基酸、维生素等天然成分,广泛应用于生物医药、保健食品及化妆品等领域。

荚膜红细菌来源的酪氨酸酚裂解酶的酶学性质

荚膜红细菌来源的酪氨酸酚裂解酶的酶学性质

荚膜红细菌来源的酪氨酸酚裂解酶的酶学性质张宇;周景文;堵国成;陈坚【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2018(044)007【摘要】L-酪氨酸作为人体非必需氨基酸之一,是合成苯丙素类化合物等多种高价值化学产品的重要前体物质.因其可作为营养补充剂,以及多肽类激素、抗生素、L-多巴、黑色素、对羟基肉桂酸等产品的原料,被广泛应用于食品、化工、饲料和医药等行业.为了促进L-酪氨酸的高效生产,在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达来源于荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)的酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine phenol lyase,TPL),并进行了诱导条件优化、酶活测定和酶学性质分析.结果表明,来源于荚膜红细菌的TPL最适pH为8.5;最适温度为40℃;酶活和比酶活分别为0.29 U/mL和0.29 U/mg;体外全细胞催化的酶活为0.41 U/g;反应10 h生成L-酪氨酸产量为0.30 g/L.结果表明,来源于R.capsulatus的TPL在大肠杆菌中成功表达,为后续提高表达量及分子改造提高催化性能的研究奠定基础.【总页数】7页(P13-19)【作者】张宇;周景文;堵国成;陈坚【作者单位】江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122【正文语种】中文【相关文献】1.酪氨酸酚裂解酶及其在L-酪氨酸酶法合成中的应用 [J], 韦平和;彭加平;营佳2.海洋来源褐藻胶裂解酶分离纯化及酶学性质研究 [J], 韩伟;许鑫琦;叶秀云;林娟3.酪氨酸酚裂解酶的固定化与转化条件的优化 [J], 马文静;周景文;徐国强4.重组酪氨酸酚裂解酶催化制备左旋多巴 [J], 赖秧秧;吴黎诚;周卫国;吴杰群;储消和5.海洋细菌来源低温褐藻胶裂解酶的分泌表达和酶学性质研究 [J], 张文彬;白露;刘彬;王朋梅;莫照兰;李杰因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达

基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达

基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达.txt花前月下,不如花钱“日”下。

叶子的离开,是因为风的追求还是树的不挽留?干掉熊猫,我就是国宝!别和我谈理想,戒了!【教学时数】4小时【教学目录与学时分配】4.1 基因的表达系统与表达策略(0.5)4.2 基因在大肠杆菌中的高效表达(2)4.2.1 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统4.2.2 蛋白质的融合表达4.2.3 蛋白质的分泌型表达4.2.4 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性4.3 基因在酵母中的高效表达(1.5)4.3.1 酵母表达系统概述4.3.2 甲醇酵母表达系统4.3.3 组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达【教学目的】让学生掌握基因表达系统的概念,基因在大肠杆菌与酵母中的高效表达策略,基因高效表达的实例。

【教学重点】基因在大肠杆菌高效表达的策略和方式。

【教学难点】基因在酵母中的高效表达。

【教学方式】多媒体讲解结合启发讨论式教学【教学过程与内容】第一节基因的表达系统与表达策略(0.5)一、基因的表达系统基因的表达即有目的的合成目的基因的产物。

包括转录、翻译、加工等过程。

表达载体:将目的基因在人工控制下置于生物宿主中大量生产。

表达载体的三个系统:1 DNA复制及质粒DNA的筛选: 有多克隆位点,有DNA复制起点ori, 及Amp, Tet 抗性基因2 目的基因的转录的调控序列:这一系统包括启动子,抑制物基因和转录终止子.启动子位于目的基因的上游,常用的如Placz等.3 蛋白质的翻译:包括核糖体识别位点SD,翻译起始密码子和终止密码子.(一)大肠杆菌表达系统一个好的大肠杆菌表达系统应该满足的条件:①尽可能低的诱导前泄漏表达;②快速简便的诱导方式;③能够高表达多种基因;④易于进行克隆操作;⑤能直接进行点突变和DNA序列分析而不要亚克隆,从而满足蛋白质工程研究的需要。

优点:操作简便,产量高,成本低。

缺点:表达产物缺乏翻译后加工,得到的蛋白质可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。

在大肠杆菌中表达有活性的人STK11蛋白

在大肠杆菌中表达有活性的人STK11蛋白
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在大肠杆菌中表达有活性的人 !"#$$ 蛋白
侯 鑫# , 扈廷茂# , 刘俊娥$"
(# 内蒙古大学生命科学学院 ( 中国科学院微生物研究所
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呼和浩特 北京
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要: ( F*,6<*GHB,*C<6<* I6<.F* ##) 是近年来发现的具有多种重要功能的蛋白, 可参与调控细胞周期、 D?E## 蛋白 J2@
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偏好性 优化 . 合 成基 因后 于 E . c o l i B L 2 1 ( D E 3 ) 中成 功表 达 。 经过 硫酸铵 分级 沉 淀、 Q F F阴离子 交 换层析 、 分子 筛纯化后得 到 了纯化 的酪氨 酸 解氨 酶 , 比 酶活 达到 1 . 7 8 U / mg 。在 相 同的培养 条件
摘 要 :酪氨 酸 解氨 酶是 苯 丙氨酸 代谢 途 径 的 关键 酶之 一 。酪 氨酸 经其 催 化生成 对 香豆 酸 , 可进

步 生成 白藜芦 醇 、 柚 皮素等 具有 抗氧 化 、 抗 衰老 作 用的苯 丙素 类天 然产物 。 作 者选取 来源于粘
红酵母 ( R h o d o t o r u l a g l u t i n i s ) 的酪 氨 酸 解氨 酶 , 对 其 基 因进 行 大肠 杆 菌 ( c h e r i c h i a c o l i ) 密码 子
p r o d u c t s, s u c h a s r e s v e r a t r ol a n d n a r i n g e ni n. I n t h i s s ud t y, t he t a /g e ne f r o m Rh o d o t o r u l a u t i n i s wa s
s e r v e s a s a p r e c u r s o r o f a wi d e a r r a y o f a n t i ・ ・ o x i d a t i v e a n d a n t i ・ - a g i n g n a t u r a l p h e n y l p r o p a n o i d
粘红酵母酪氨 酸解氨酶在大肠杆菌中的异源表达
刘沛然 , 堵 国成 . 一 , 周景 文 , 陈 坚 。
( 1 . 汀 南 大学 业生 物 技 术 教 育 酃 重点 实 验 室 , 江 苏 无锡 2 1 4 1 2 2 ; 2 . 江 南 大学 生 物 ] : 程学 院 , 汀 苏 尤锡 2 1 4 1 2 2 )
a m mo n i u m s u l f a t e pr e c i pi t a t i o n. t he r e c omb i n a n t TAL wa s pu r i ie f d wi t h a ni o n e x c ha n g e c h r oma t o g r a ph y a nd g e l f il t r a t i on c hr o ma t o g r a p hy, r e s ul t i n g i n s p e c i ic f a c t i v i t y of 1 . 7 8 U/ mg e n z y me .Un d e r t h e s a me c ul ur t e c o nd i t i on s, d i fe r e n t e x pr e s s i o n v e c t o r s we r e c o ns t r uc t e d t o g e t
He t e r o l o g o us Ex pr e s s i o n o f Tyr o s i ne Am m o n i a Ly a s e
f r o m Rh o d o t o r u l a g l u t i n i s i n Es c h e r i c h c o l i
氨 酸解氨 酶基 因可 更好 地 应 用于苯 丙素 类物 质的合 成 途径 构建 , 不 同栽 体 的应 用也 为生物 法 生 产 对香豆 酸提 供 了更 多的 选择依 据 。
关键 词 :酪氨 酸解氨 酶 ; 粘红 酵母 ; 大肠 杆 菌 ; 异 源表达 中图分类 号 : Q 8 1 4 文 献标 志码 : A 文章编 号 : l 6 7 3 —1 6 8 9 ( 2 0 1 6 ) l 2 —1 2 4 1 —0 6
下, 以不 同的质 粒作 为表 达载体 , 获得 了不 同的 对香 豆酸 产量 。其 中以酪氨 酸 为底物 发酵 2 4 h , 当以 p E T 一 3 2 a ( + ) 作 为表 达载 体 时 , 获得 最 高的对香 豆 酸产量 1 9 6 . 3 m g / L 。经 密码子 优化后 的酪
L I U P g i r a g l 一 , DU Gl l O C h e n g 一 , Z HOU J i n g  ̄ , e n 一 , C HE N ( Ⅲ '
( 1 . Ke y L a b o r a t o r y o f I n d u s t r i a l Bi o t e c h n o l o g y. Mi n i s t y r o f Ed u c a t i o n, J i a n g n a n Un i v e r s i t y, Wu x i 2 1 4 1 2 2, Ch i n a
a m mo n i a — l y a s e ( T AL)c a t a l y z e s t h e f o r ma t i o n o f p — c o u ma r i c a c i d f r o m L — t y r o s i n e . P - Co u ma r i c a c i d
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
s e l e c t e d , c o d o n o p t i mi z e d a n d o v e r e x p r e s s e d i n E s c h e r i c h i a c o l i B L 2 I( DE 3 ) . A f t e r t r e a t me n t w i t h
2 . S c h o o l o f B i o t e c h n o l o g y, J i a n g n a n Un i v e r s i t y, Wu x i 2 1 4 1 2 2, Ch i n a )
Abs t r a c t : As o n e o f t h e ke y e n z y me i n t he p h e n y l a l a n i ne me t a b ol i s m p a t h wa y, t y r os i ne
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