第四章 发酵工业的无菌技术
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第四章发酵工业的无菌技术
管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
3. 预防
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽
蒸汽
放汽
冷却水
无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
生培养基
真空冷却器 无菌培养基进发酵罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。
将配置好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、 保温和冷却等灭菌过程。——高温短时
（三）连续灭菌（连消）
工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
3. 预防
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽
蒸汽
放汽
冷却水
无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
生培养基
真空冷却器 无菌培养基进发酵罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。
将配置好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、 保温和冷却等灭菌过程。——高温短时
（三）连续灭菌（连消）
工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐
发酵工程 4 发酵工业无菌技术-80页文档资料
4、杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
1）发酵染菌对过滤的影响 染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶， 所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导 致过滤困难。
污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如 污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过 滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵 液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平 衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低 过滤收率，直接影响提取总收率。
3、不同发酵时期染菌对发酵的影响
（1）种子培养期染菌 由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，
而且培养基营养丰富，容易污染杂菌。种子染 菌对发酵危害极大，应严格控制种子染菌，如 在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。
（2）发酵前期染菌
发酵前期最易染菌。
原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势； 且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能 力弱。在这个时期要特别警惕以防止染菌的发生。
2）发酵染菌对提取的影响
染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白 和其它杂质。 采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化， 很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、 庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面， 或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交 换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与 产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。
象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成
不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生
产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。
不 灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑
同 制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。
产 品
对疫苗生产危害很大。现在疫苗多采用深层
发酵工业无菌技术演示教学
• 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比 生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为 主；
• 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难 • 杂菌会降解目的产物； • 杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；
• 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现 象。
4，培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度（10-3） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中， 培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引 起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
4.5.3空气过滤除菌
（一）、空气过滤除菌流程
1、高空采风、两次冷却、两次分油水、 适当加热流程
• 特点 ：两次冷却、两次分油水、适当加热。 空气第一次冷却到30～35℃，第二级冷却 至20～25℃，经分水后加热到30～35℃， 因为温度升高，相对湿度下降。
2、冷热空气直接混合式空气除菌流程
第四章 发酵工业的无菌技术
• 4.1 灭菌与消毒的区别
灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中 所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和 孢子
消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、 器皿内外的病源微生物。
• 培养基灭菌的目的
• 1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果： • 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；
七、补料液的灭菌
在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这 些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补 料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭 菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分 批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属 设备和管道都要经过灭菌。
缺点 –设备比较复杂，投资较大。
• 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难 • 杂菌会降解目的产物； • 杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；
• 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现 象。
4，培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度（10-3） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中， 培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引 起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
4.5.3空气过滤除菌
（一）、空气过滤除菌流程
1、高空采风、两次冷却、两次分油水、 适当加热流程
• 特点 ：两次冷却、两次分油水、适当加热。 空气第一次冷却到30～35℃，第二级冷却 至20～25℃，经分水后加热到30～35℃， 因为温度升高，相对湿度下降。
2、冷热空气直接混合式空气除菌流程
第四章 发酵工业的无菌技术
• 4.1 灭菌与消毒的区别
灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中 所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和 孢子
消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、 器皿内外的病源微生物。
• 培养基灭菌的目的
• 1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果： • 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；
七、补料液的灭菌
在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这 些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补 料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭 菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分 批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属 设备和管道都要经过灭菌。
缺点 –设备比较复杂，投资较大。
【发酵工程】余龙江版 第4章_发酵工业无菌技术(1)
（三）连续灭菌（连消）
工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程 灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。
连续灭菌时间的估算
例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌， 灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有 2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为 15min-1，求灭菌所需的维持时间。
连消塔
维持罐
冷却罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自
溶，发酵液粘度增加，过滤困难
处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采
用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间 极易发生乳化
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间 平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断 DO 水平异常变化 2 pH异常变化 尾气CO 异常变化 2
罐压接近空气压力
夹套或蛇管中通冷水
培养基降温到所需温度
2. 灭菌时间的估算
发酵工业的无菌技术
间 1.设备要求低，不需另外 1.培养基的营养物质损 加热、冷却装置。 失大，灭菌后培养基 歇 质量下降 灭 2.操作要求低，适合小批 量生产规模 2.发酵罐的利用率较低 菌
3.适合含大量固体物料的 3.不适合大规模生产的 灭菌 灭菌
作业
1、连续灭菌的流程与设备 2、对数残留定律 3、分批灭菌、连续灭菌 4、P273第8题
二、影响培养基灭菌的因素p68
杂菌的种类与数量 灭菌温度与时间 培养基成分 pH值 培养基中的颗粒 泡沫
培养基成分
油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性 在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。 环境 耐热性 60～65℃便死亡
水
大肠杆菌
10％糖液
30％糖液
70℃，4～6min
喷射加热连续灭菌流程
薄板换热器连续灭菌流程
3、灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、 后的含菌数。
例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌， 灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有 2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为 15min-1，求灭菌所需的维持时间。
解：C0=2×105(个/ml)
Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)
t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k=2.303×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]
/15 =2.37 min
间歇灭菌与连续灭菌的比较
优 点 缺 点
连 1.高温短时灭菌，培养基 1.设备复杂，操作麻烦, 营养成分损失少。 染菌机会多。 续 灭 2.发酵罐占用时间缩短， 2.不适合含大量固体物 利用率高。 料的灭菌。 菌
3.适合含大量固体物料的 3.不适合大规模生产的 灭菌 灭菌
作业
1、连续灭菌的流程与设备 2、对数残留定律 3、分批灭菌、连续灭菌 4、P273第8题
二、影响培养基灭菌的因素p68
杂菌的种类与数量 灭菌温度与时间 培养基成分 pH值 培养基中的颗粒 泡沫
培养基成分
油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性 在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。 环境 耐热性 60～65℃便死亡
水
大肠杆菌
10％糖液
30％糖液
70℃，4～6min
喷射加热连续灭菌流程
薄板换热器连续灭菌流程
3、灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、 后的含菌数。
例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌， 灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有 2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为 15min-1，求灭菌所需的维持时间。
解：C0=2×105(个/ml)
Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)
t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k=2.303×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]
/15 =2.37 min
间歇灭菌与连续灭菌的比较
优 点 缺 点
连 1.高温短时灭菌，培养基 1.设备复杂，操作麻烦, 营养成分损失少。 染菌机会多。 续 灭 2.发酵罐占用时间缩短， 2.不适合含大量固体物 利用率高。 料的灭菌。 菌
生物化学 第四章 发酵工业的无菌技术
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
湿热：121 ℃ 0.1MPa 20～30分钟饱和蒸汽 高温瞬间灭菌法 干热：160℃ 1小时 烧灼 巴斯德消毒法 冷冻 冷藏
温度
HIST灭菌法：温度升高时，微生物死亡速率常数远远大于 营养成分分解速率常数，因而可以采用在较高温度下缩短灭菌 时间而减少营养成分的损失。
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
第二节 培养基灭菌——分批灭菌和连续灭菌 一、分批灭菌（间歇灭菌）
dN dt
kN
t 2 . 303 /( k lg
N0 Nt
)
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
生物化工基础
第四章 发酵工业的无菌技术
化工学院 应用化学系 沈齐英
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
第一节 概述 灭菌：用物理或化学方法杀灭或清除设备及物料中所有 微生物的技术。 消毒：用物理或化学方法杀灭或清除致病微生物的技术。 防腐：防止或抑制微生物生长的方法。 温度 湿度 物理 射线 过滤 消毒剂 方法 化学 防腐剂 化学治疗剂 生物
t 2 . 303 ( k lg
N0 Nt
第四章 发酵工业的无菌技术
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
第三节 空气除菌 空气过滤除菌是发酵工业中最常用、最经济的方法。 解决： 1、压缩空气及其 冷却 2、除水
第四章 发酵工业的无菌技术
湿热：121 ℃ 0.1MPa 20～30分钟饱和蒸汽 高温瞬间灭菌法 干热：160℃ 1小时 烧灼 巴斯德消毒法 冷冻 冷藏
温度
HIST灭菌法：温度升高时，微生物死亡速率常数远远大于 营养成分分解速率常数，因而可以采用在较高温度下缩短灭菌 时间而减少营养成分的损失。
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第四章 发酵工业的无菌技术
第二节 培养基灭菌——分批灭菌和连续灭菌 一、分批灭菌（间歇灭菌）
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生物化工基础
第四章 发酵工业的无菌技术
化工学院 应用化学系 沈齐英
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第四章 发酵工业的无菌技术
第一节 概述 灭菌：用物理或化学方法杀灭或清除设备及物料中所有 微生物的技术。 消毒：用物理或化学方法杀灭或清除致病微生物的技术。 防腐：防止或抑制微生物生长的方法。 温度 湿度 物理 射线 过滤 消毒剂 方法 化学 防腐剂 化学治疗剂 生物
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第四章 发酵工业的无菌技术
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第四章 发酵工业的无菌技术
第三节 空气除菌 空气过滤除菌是发酵工业中最常用、最经济的方法。 解决： 1、压缩空气及其 冷却 2、除水
第四章 发酵工业的无菌技术 2
第四章发酵工业的无菌技术内容提要•常用技术概念•发酵工业污染的防治策略•发酵工业的无菌技术•发酵培养基及设备管道的灭菌•空气除菌目前，绝大多数的工业发酵都采用纯种培养，即发酵全过程只有生产菌，不允许有“杂菌”污染。
为了保障纯种发酵的顺利进行，在进行生产菌接种之前，必须对整个发酵系统进行灭菌，对发酵环境进行消毒，防治杂菌和噬菌体的感染。
在实际生产中，为了防止杂菌污染，而采用的消毒和灭菌技术，统称为发酵工业的无菌技术。
一般采用“污染概率”作为评价标准。
发酵工业中允许的染菌概率为10-3，即灭菌1000批次的发酵中只允许有1次染菌。
一、常用技术概念几个容易混淆的概念说明：1、灭菌：指用物理或化学的方法杀死物料或设备中所有生命物质的过程。
2、消毒：指用物理或化学的方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。
3、除菌：指用过滤的方法去除空气或液体中的微生物及其孢子。
4、防腐：指指用物理或化学的方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖。
灭菌和消毒的区别和主要用途。
二、发酵工业污染的防治策略（一）、污染的危害1、污染杂菌，造成培养基的异常消耗，生产菌的生产能力下降；2、杂菌合成的代谢产物改变发酵环境，造成产物收率降低或质量下降；3、杂菌代谢产物使发酵系统的PH变化，造成生产菌自溶；4、杂菌分解产物，使发酵失败；5、噬菌体污染，造成生产菌细胞破裂，发酵失败。
目前，国内抗生素发酵，如青霉素发酵染菌率为2%；链霉素、红霉素和四环霉素发酵染菌率为5%；谷氨酸发酵噬菌体感染率为1%-2%。
（二）、发酵生产的产品不同，染菌的种类和性质不同、染菌发生的时间、染菌的途径和程度各不同。
1、不同种类的杂菌对发酵的影响（1）、细菌发酵：发酵周期短。
主要防止噬菌体感染。
例如：谷氨酸发酵菌种：棒状杆菌营养缺陷型细菌发酵（2）、霉菌发酵：发酵周期较细菌发酵长，产物类型各不相同。
主要防止细菌感染。
例如：青霉素发酵——水解产物。
（3）、酵母菌发酵：发酵周期最长。
第四章 发酵工业的无菌技术
3 杂菌污染的途径及其预防
种子带菌及其防治 培养基及器具彻底灭 菌，避免菌种在移接过程中受污染，避 免菌种在培养过程中或保藏过程中受杂 菌污染 过滤空气带菌及其防治 正确选择采气口， 提高采气口的位置或安装前置粗过滤器， 提高空压机进口空气的洁净度。
根据发酵工厂所在地区的气候条件，设 计合理的空气预处理流程，尽可能减少 过滤空气的含油量和湿度，适当提高进 入过滤器的空气湿度，降低空气的相对 湿度，保持过滤介质的干燥状态。设计 和安装合理的空气过滤器，防止过滤器 失效，选用除菌效率高的过滤介质。
杀死微生物的极限温度称为致死温度。 在致死温度下，杀死全部微生物所需要 的时间称为致死时间。 在致死温度以上，温度越高，致死时间 越短。
微生物对热的抵抗力称为热阻，即指微 生物在某一条件下（主要是温度）的致 死时间。 相对热阻是指某一微生物在某一条件下 的致死时间与另一微生物在相同条件下 的致死时间之比。
平板划线培养检查法 先将待检样品在无 菌平板上划线，根据可能的污染类别分 别置于37、27℃下培养划线平板，以适 应嗜中温和低温菌的生长，一般在8h后 即可观察到是否有杂菌污染。
对于噬菌体检查，可采用双层平板培养 法，上层和下层同为肉汤琼脂培养基， 上层减少琼脂糖用量，先将灭菌的下层 培养基融化后倒入平板，凝固后再将上 层培养基溶解并保持40℃，加上生产菌 作为指示菌核待检测样品混合后迅速倒 在下层平板上。置培养箱保温培养经1220h培养，观察有无噬菌斑。
第四章 发酵工业的无菌技术
发酵工业的无菌处理 发酵工业污染的防治策略 发酵工业的无菌技术 发酵培养基及设备管道灭菌 空气除菌
发酵工程发酵工业的无菌技术课件
4.2.1 杂菌污染的危害
*
4）污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH，从而使生物化学反应发生异常变化； 5）发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生产失败等。
*
染菌危害的具体分析 （1）染菌对不同菌种发酵的影响
A．细菌 谷氨酸(棒状杆菌)：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷（枯草杆菌）：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。
*
染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。 采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。
设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现，这类染菌占33.85％。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。
*
密闭式发酵罐
*
*
*
2、机械搅拌发酵罐的结构
好气性机械搅拌发酵罐是密封式受压设备，主要部件包括： 罐身 轴封 消泡器 搅拌器 联轴器 中间轴承 挡板 空气分布管 换热装置 人孔以及管路等
*
*
“死角”
发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
*
4）污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH，从而使生物化学反应发生异常变化； 5）发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生产失败等。
*
染菌危害的具体分析 （1）染菌对不同菌种发酵的影响
A．细菌 谷氨酸(棒状杆菌)：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷（枯草杆菌）：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。
*
染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。 采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。
设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现，这类染菌占33.85％。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。
*
密闭式发酵罐
*
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2、机械搅拌发酵罐的结构
好气性机械搅拌发酵罐是密封式受压设备，主要部件包括： 罐身 轴封 消泡器 搅拌器 联轴器 中间轴承 挡板 空气分布管 换热装置 人孔以及管路等
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“死角”
发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
发酵工程第四章无菌技术
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方 法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵 柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制 细菌 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母； 通风加大，加速产酸。
ND
dNR/dt=-kR NR
dNs/dt =kR NR -ks Ns
→Nt/N0=KR/(kR-kS) [ekst-ks/kR e-kRt]
式中NR：耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数
ND：死亡的芽孢数；kR：耐热性芽孢的比死亡速率；
ks：敏感性芽孢的比死亡速率；
N0：初始活芽孢数。
培养基中含有大量的不耐热的微生物和 相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留 曲线
蒸汽
喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽Βιβλιοθήκη 放汽冷却水无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
dN kN dt
ln Nt kt N0
t 2.303/klogN0 Nt
当Nt=0时， t=∞， 既无意义，也不可能。
一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。
(2) 非对数残留定律
某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方 法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵 柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制 细菌 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母； 通风加大，加速产酸。
ND
dNR/dt=-kR NR
dNs/dt =kR NR -ks Ns
→Nt/N0=KR/(kR-kS) [ekst-ks/kR e-kRt]
式中NR：耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数
ND：死亡的芽孢数；kR：耐热性芽孢的比死亡速率；
ks：敏感性芽孢的比死亡速率；
N0：初始活芽孢数。
培养基中含有大量的不耐热的微生物和 相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留 曲线
蒸汽
喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽Βιβλιοθήκη 放汽冷却水无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
dN kN dt
ln Nt kt N0
t 2.303/klogN0 Nt
当Nt=0时， t=∞， 既无意义，也不可能。
一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。
(2) 非对数残留定律
某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些
发酵工业的无菌技术
发酵工业的无菌技术
（一）概述
空气除菌的必要性 以一个50m3的发酵罐为例，若装料系数为0.7，要 求每立方米发酵液每分钟通气0.8m3，培养周期 170h，那么每个周期需通气量2.86×105 m3(50×0.7 × 0.8 × 170 × 60)，而每立方米大气中约有103-104 个微生物。
发酵工业的无菌技术
分批灭菌与连续灭菌的比较
缺点： 对小型罐无优势，不方便，对设备要求高； 蒸汽波动时灭菌不彻底； 当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时， 以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。
发酵工业的无菌技术
五、空气除菌
（一）概述 （二）空气过滤除菌流程 （三）空气预处理 （四）空气预处理流程设计应用举例 （五）空气过滤介质 （六）空气过滤除菌原理 （七）提高过滤除菌效率的措施
发酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染
菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，
都应全部废弃。
发酵工业的无菌短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
发酵工业的无菌技术
（三）空气预处理
1. 原理： 除尘(外源空气的前处理)：防塞，提高过滤效率和滤 器寿命；措施：建吸风塔、粗过滤器（布袋过滤器、 填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等）、高 效前置过滤器 降温：防烧伤介质及水分蒸发严重，对发酵不利 除油、除水：防塞（因油膜堵），防止过滤器长菌堵 塞（因水滴） 加热：保持相对湿度 稳压：防止压力波动，贮罐
发酵工业的无菌技术
（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
（一）概述
空气除菌的必要性 以一个50m3的发酵罐为例，若装料系数为0.7，要 求每立方米发酵液每分钟通气0.8m3，培养周期 170h，那么每个周期需通气量2.86×105 m3(50×0.7 × 0.8 × 170 × 60)，而每立方米大气中约有103-104 个微生物。
发酵工业的无菌技术
分批灭菌与连续灭菌的比较
缺点： 对小型罐无优势，不方便，对设备要求高； 蒸汽波动时灭菌不彻底； 当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时， 以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。
发酵工业的无菌技术
五、空气除菌
（一）概述 （二）空气过滤除菌流程 （三）空气预处理 （四）空气预处理流程设计应用举例 （五）空气过滤介质 （六）空气过滤除菌原理 （七）提高过滤除菌效率的措施
发酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染
菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，
都应全部废弃。
发酵工业的无菌短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
发酵工业的无菌技术
（三）空气预处理
1. 原理： 除尘(外源空气的前处理)：防塞，提高过滤效率和滤 器寿命；措施：建吸风塔、粗过滤器（布袋过滤器、 填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等）、高 效前置过滤器 降温：防烧伤介质及水分蒸发严重，对发酵不利 除油、除水：防塞（因油膜堵），防止过滤器长菌堵 塞（因水滴） 加热：保持相对湿度 稳压：防止压力波动，贮罐
发酵工业的无菌技术
（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
发酵工程发酵工业的无菌技术课件
发酵工程发酵工业的无菌技术
21
4.2.2 杂菌污染的防治
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间
平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑
肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
› DO2水平异常变化 › pH异常变化 › 尾气CO2异常变化
发酵工程发酵工业的无菌技术
13
（2）不同发酵时期染菌对发酵的影响
1）种子培养期染菌 ➢ 由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势
，而且培养基营养丰富，容易污染杂菌。种子 染菌对发酵危害极大，应严格控制种子染菌， 如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。
发酵工程发酵工业的无菌技术
14
2）发酵前期染菌
➢发酵前期最易染菌。
➢原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势 ；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌 能力弱。在这个时期要特别警惕以防止染菌的发生。
20
➢染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白 和其它杂质。 ➢采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化， 很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 ➢采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、 庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面 ，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的 交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时 与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。
发酵工程发酵工业的无菌技术
9
➢链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不 象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成 不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养，干扰 生产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。 ➢灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑 制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。
4.发酵工业无菌技术
这样对于不同 N0 的培养基，其灭菌时间不 同，即 t = t (N0) 。
发酵工业无菌技术
根据
四 发 酵 培 养 基 及 设 备 管 道 灭 菌
1 N t ln K N0
在给定的温度条件下，t 与 ln N0/N 呈直线 关系，其斜率为 -1/K ；当 N0 给定后，t 决 定于 K ；K 除了决定于菌体的种类及存在 形式外，还是温度的函数。
发酵工业无菌技术
四 发酵培养基及设备管道灭菌
四 发 酵 培 养 基 及 设 备 管 道 灭 菌
发酵生产中主要采用湿热灭菌的方法
生产中需要解决的问题：
杀灭培养基中的杂菌 避免培养基中营养成分的破坏
发酵工业无菌技术
湿热灭菌原理
四 发 酵 培 养 基 及 设 备 管 道 灭 菌
微生物的热阻 表征不同微生物对热抵抗能力强弱的指标。 指微生物在某一特定条件(主要是温度和加热 方式)下的致死时间。 每一种微生物都有一定的最适生长温度范围， 如一些嗜冷菌的最适温度为5～l 0℃；大多数 微生物的最适温度为25～37℃；另有一些嗜 热菌的最适温度为50～60℃。
二 发 酵 工 业 污 染 的 防 治 策 略
发酵工业无菌技术
3.不同染菌的时间分析
二 发 酵 工 业 污 染 的 防 治 策 略
种子阶段
发酵初期
发酵后期
发酵工业无菌技术
杂菌污染途径及预防
二 发 酵 工 业 污 染 的 防 治 策 略
1.种子带菌及防止： 带菌的原因 无菌室的无菌条件不符合要求；培养基灭菌 不彻底；操作不当。 种子带菌的防止 种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在 每次接种后应留取少量的种子悬浮液迚行平 板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂 菌。严格技术觃范种子培养的设备和装置
发酵工业的无菌技术
整理课件
32
分批灭菌与连续灭菌的比较
缺点： 对小型罐无优势，不方便，对设备要求高； 蒸汽波动时灭菌不彻底； 当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时， 以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。
整理课件
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五、空气除菌
（一）概述 （二）空气过滤除菌流程 （三）空气预处理 （四）空气预处理流程设计应用举例 （五）空气过滤介质 （六）空气过滤除菌原理 （七）提高过滤除菌效率的措施
整理课件
1
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
整理课件
2
一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐
灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命 物质的过程。 消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具 表面的微生物。 除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。 防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖 。
从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所 污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别 罐连续染菌，一般是设备问题。
整理课件
15
3. 预防
种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可 靠 保藏可靠
过滤空气带菌的防治 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
整理课件
解：C0=2×105(个/ml) Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml) t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)] =2.37 min
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霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。
不 同 产 品
疫苗生产危害很大。 疫苗是一类不加提纯而直接使用的产品， 一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒 素，都应全部废弃。
2、污染不同种类和性质的微生物的影响 （1）污染噬菌体 噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较防治， 故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅 度下降，严重的造成断种，被迫停产。
dN kN dt
Nt ln kt N0
N0 t 2.303/ k log Nt 当Nt=0时， t=∞， 无意义，也不可能。
一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。
非对数残留定律
某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些
微生物芽孢。
NR Ns dNR/dt=-kR NR
子瓶、母瓶的移种和培养
无菌室和摇床间都要保持清洁。
2、防止设备渗漏 设备上一旦渗漏，就会造成染菌，如盘管、夹套穿孔 渗漏，未灭菌冷却水便会通过漏孔而进入发酵罐中招 致染菌。 阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发酵罐而造成染 菌。 设备上的漏隙如果肉眼能看见，容易发现；但有的微
小泄漏，肉眼看不见，必须通过一定的试漏方法才能
发现 。
3、防止培养基灭菌不彻底 培养基灭菌方法——高压蒸汽灭菌 分批灭菌 1210C，30分钟
连续灭菌 －45分钟
罐温125－1300C，30
5、发酵染菌后的措施 染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。 凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也 要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。 染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲 醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽
和其它设备漏等。所以说加强设备本身及 附属零部件的严密度检查，对制服染菌是
极其主要的，也是重要的。
“死角”
发酵罐的“死角” 由于操作、设备结构或人为因素造成的屏障等原因，
法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌 使蒸汽不能到达预定的灭菌部位或该部位的冷空气不
轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支 易在加热过程中排净，不能达到彻底灭菌的部位。
4. 影响培养基灭菌的其它因素
（1）培养基成分 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增 加微生物的耐热性 低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着 浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以上， 则减弱微生物的耐热性。
（2）pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH<6.0，H+ 易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其 死亡。∴培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。 （3）培养基的物理状态 （ 4 ）泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌 极为不利，可加入少量消泡剂 。 （5）培养基中的微生物数量
四、分批灭菌与连续灭菌的比较
一、湿热灭菌原理
1. 热阻 2. 微生物热死定律：对数残留定律 3.灭菌温度和时间的选择 4. 影响培养基灭菌的其它因素
1. 热阻
定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用比死 亡速率常数k的倒数来表示 。
dN kN dt
k↓，热阻↑, t↑
Nt ln kt N0
（2）污染其它杂菌 有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加 消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。
有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不 耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热， 不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。
3、不同时间染菌对发酵的影响 污染时间是指用无菌检测方法确准的污染 时间，不是杂菌窜入培养液的时间。 杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁殖的 时间才能显现出来，显现的时间又与污染菌量 有关。污染的菌量多，显现染菌所需的时间就 短，污染菌量少，显现染菌的时间就长。
（ 6）发现噬菌体停搅拌、小通风，将发
酵液加热到70~800C杀死噬菌体，才可排 放。发酵罐周围的管道也必须彻底灭菌。
第二节 发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法
湿热灭菌法
射线灭菌法
化学药剂灭菌法
过滤除菌法
火焰灭菌法
第三节 培养基及设备灭菌
一、湿热灭菌原理
二、分批灭菌（实罐灭菌）
三、连续灭菌（连消）
1、建立工厂环境清洁卫生制度，定期检查、定期
清扫，车间四周有严重污染噬菌体的地方应及时撒
石灰或漂白粉。
2、车间地面和通往车间的道路尽量采取水泥地面。 3、种子和发酵工段的操作人员要严格执行无菌操 作规程，不使用本身带有噬菌体的菌种。
（ 4）认真进行发酵罐、补料系统的灭菌。
（5）选育抗噬菌体的菌种，或轮换使用菌 种。
（4）生产量甚少或增长缓慢或停止
有无染噬菌体，根本的要做噬菌斑检验
（二）产生噬菌体的原因 主要是由于生产和试验过程中不断不加注意地把 许多活菌体排放到环境中去，造成了自然界中噬 菌体增殖的好机会。 这些噬菌体有可能潜入生产的各个环节，尤其是 通过空气系统进入种子室、种子罐、发酵罐
（三）噬菌体的防治
导产生青霉素酶，不论在发酵前期、中期或后
不 同 产 品
期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉
素迅速破坏。 链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不 象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造 成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干 扰生产菌的正常代谢、改变pH，降低产量。
灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制
（1）种子培养期染菌
在发酵初期，生产菌生长不占优势，抵抗杂菌能 力低，容易污染杂菌。 如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。
（2）发酵前期染菌 发酵前期最易染菌，且危害最大。 原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且
还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。 要特别警惕以制止染菌的发生。 染菌措施 养周期等 若培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营 养，重新接种再用。 降低温度，调整补料量，调pH值，缩短培
消毒。
四、染噬菌体的防治
（一）染噬菌体对发酵的影响
若受噬菌体侵染，会出现发酵迟缓或停止。
且受噬菌体感染后，往往会反复连续感染， 使生产无法进行，甚至使种子全部丧失。
染噬菌体表现为：
（1）镜检可发现菌体数量明显减少，菌体不规则， 严重时完全看不到菌体，且是在短时间内菌体自 溶。 （2）发酵pH值逐渐上升，4~8小时之内可达8.0以 上，不再下降。 （3）发酵液残糖高，有刺激臭味，粘度大，泡沫 多。
2、以上3种检查法的不足
以上3种检查法未发现染菌，还不能肯定未被
染菌；
原因是以上检查法只能检查杂菌浓度较大的染
菌情况（>1个/ml）
(四)染菌情况分析 1、单罐染菌 不是系统问题，而是该罐本身的问题。如种子 带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分过滤 器失效
2、多罐染菌 系统问题，如空气过滤系统有问题，特别是总过滤器
3. 灭菌温度和时间的选择
培养物质受热破坏也可看作一级反应：
dC k ' C dt
式中C：对热不稳定物质的浓度；k’：分解速度常数； k’的变化也遵循阿累尼乌斯方程：
E ' ) RT E k A exp( ) RT k ' A' exp(
都与相应的活化能及T有关
当T1 →T2 ㏑(k2/k1)/㏑(k2’/k1’)=ΔE/ΔE’>1 (∵ΔE>ΔE’) ∴随着 T 上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成分 分解速率增加倍数，故一般选择高温快速灭菌 。
撑件。
口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、
进料管口
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
法兰连接不当造成的“死角”
2、空气带菌 因为空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不 慎便会导致空气除菌失败。
第四章
发酵工业的无菌技术
本章内容
一、染菌的防治 二、发酵工业的无菌技术
三、培养基及设备灭菌
四、空气除菌
什么是染菌？
发酵过程中除了生产菌以外，还有其 它菌生长繁殖.
一、染菌的影响
发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是 发酵工业的致命伤。
1. 造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失 2.扰乱生产秩序，破坏生产计划。 3.遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会 影响人们的情绪和生产积极性。 4.影响产品外观及内在质量。
（一）染菌对发酵的影响
生产不同的品种，可污染不同种类和性质的
微生物。
不同污染时间，不同污染途径，污染不同菌量， 不同培养基和培养条件又可产生不同后果 。
1、发酵染菌对不同品种的影响 不 同 种 类 菌 种
A．细菌
谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少 染杂菌，但噬菌体威胁大。
肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，
长期没有检查，可能受潮失效；移种或补料的分配站
有渗漏或灭菌不彻底。 3、前期染菌 种子带菌、培养基灭菌不彻底
4、中后期染菌
补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀门
渗漏，一般不会是种子问题。
五、染菌的防止
1、防止种子带菌 制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。 沙土制备时要多次间歇灭菌
注意接种时的无菌操作
] kR ks
ND
→Nt/N0=KR/(kR-kS) [ekst-ks/kR e-kRt]
dNs/dt =kR NR -ks Ns
式中NR：耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数
ND：死亡的芽孢数；kR：耐热性芽孢的比死亡速率； ks：敏感性芽孢的比死亡速率； N0：初始活芽孢数。
∴在T相同时，对数与非对数定律的灭菌时间t不同。
不 同 产 品
疫苗生产危害很大。 疫苗是一类不加提纯而直接使用的产品， 一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒 素，都应全部废弃。
2、污染不同种类和性质的微生物的影响 （1）污染噬菌体 噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较防治， 故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅 度下降，严重的造成断种，被迫停产。
dN kN dt
Nt ln kt N0
N0 t 2.303/ k log Nt 当Nt=0时， t=∞， 无意义，也不可能。
一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。
非对数残留定律
某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些
微生物芽孢。
NR Ns dNR/dt=-kR NR
子瓶、母瓶的移种和培养
无菌室和摇床间都要保持清洁。
2、防止设备渗漏 设备上一旦渗漏，就会造成染菌，如盘管、夹套穿孔 渗漏，未灭菌冷却水便会通过漏孔而进入发酵罐中招 致染菌。 阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发酵罐而造成染 菌。 设备上的漏隙如果肉眼能看见，容易发现；但有的微
小泄漏，肉眼看不见，必须通过一定的试漏方法才能
发现 。
3、防止培养基灭菌不彻底 培养基灭菌方法——高压蒸汽灭菌 分批灭菌 1210C，30分钟
连续灭菌 －45分钟
罐温125－1300C，30
5、发酵染菌后的措施 染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。 凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也 要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。 染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲 醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽
和其它设备漏等。所以说加强设备本身及 附属零部件的严密度检查，对制服染菌是
极其主要的，也是重要的。
“死角”
发酵罐的“死角” 由于操作、设备结构或人为因素造成的屏障等原因，
法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌 使蒸汽不能到达预定的灭菌部位或该部位的冷空气不
轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支 易在加热过程中排净，不能达到彻底灭菌的部位。
4. 影响培养基灭菌的其它因素
（1）培养基成分 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增 加微生物的耐热性 低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着 浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以上， 则减弱微生物的耐热性。
（2）pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH<6.0，H+ 易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其 死亡。∴培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。 （3）培养基的物理状态 （ 4 ）泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌 极为不利，可加入少量消泡剂 。 （5）培养基中的微生物数量
四、分批灭菌与连续灭菌的比较
一、湿热灭菌原理
1. 热阻 2. 微生物热死定律：对数残留定律 3.灭菌温度和时间的选择 4. 影响培养基灭菌的其它因素
1. 热阻
定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用比死 亡速率常数k的倒数来表示 。
dN kN dt
k↓，热阻↑, t↑
Nt ln kt N0
（2）污染其它杂菌 有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加 消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。
有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不 耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热， 不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。
3、不同时间染菌对发酵的影响 污染时间是指用无菌检测方法确准的污染 时间，不是杂菌窜入培养液的时间。 杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁殖的 时间才能显现出来，显现的时间又与污染菌量 有关。污染的菌量多，显现染菌所需的时间就 短，污染菌量少，显现染菌的时间就长。
（ 6）发现噬菌体停搅拌、小通风，将发
酵液加热到70~800C杀死噬菌体，才可排 放。发酵罐周围的管道也必须彻底灭菌。
第二节 发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法
湿热灭菌法
射线灭菌法
化学药剂灭菌法
过滤除菌法
火焰灭菌法
第三节 培养基及设备灭菌
一、湿热灭菌原理
二、分批灭菌（实罐灭菌）
三、连续灭菌（连消）
1、建立工厂环境清洁卫生制度，定期检查、定期
清扫，车间四周有严重污染噬菌体的地方应及时撒
石灰或漂白粉。
2、车间地面和通往车间的道路尽量采取水泥地面。 3、种子和发酵工段的操作人员要严格执行无菌操 作规程，不使用本身带有噬菌体的菌种。
（ 4）认真进行发酵罐、补料系统的灭菌。
（5）选育抗噬菌体的菌种，或轮换使用菌 种。
（4）生产量甚少或增长缓慢或停止
有无染噬菌体，根本的要做噬菌斑检验
（二）产生噬菌体的原因 主要是由于生产和试验过程中不断不加注意地把 许多活菌体排放到环境中去，造成了自然界中噬 菌体增殖的好机会。 这些噬菌体有可能潜入生产的各个环节，尤其是 通过空气系统进入种子室、种子罐、发酵罐
（三）噬菌体的防治
导产生青霉素酶，不论在发酵前期、中期或后
不 同 产 品
期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉
素迅速破坏。 链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不 象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造 成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干 扰生产菌的正常代谢、改变pH，降低产量。
灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制
（1）种子培养期染菌
在发酵初期，生产菌生长不占优势，抵抗杂菌能 力低，容易污染杂菌。 如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。
（2）发酵前期染菌 发酵前期最易染菌，且危害最大。 原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且
还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。 要特别警惕以制止染菌的发生。 染菌措施 养周期等 若培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营 养，重新接种再用。 降低温度，调整补料量，调pH值，缩短培
消毒。
四、染噬菌体的防治
（一）染噬菌体对发酵的影响
若受噬菌体侵染，会出现发酵迟缓或停止。
且受噬菌体感染后，往往会反复连续感染， 使生产无法进行，甚至使种子全部丧失。
染噬菌体表现为：
（1）镜检可发现菌体数量明显减少，菌体不规则， 严重时完全看不到菌体，且是在短时间内菌体自 溶。 （2）发酵pH值逐渐上升，4~8小时之内可达8.0以 上，不再下降。 （3）发酵液残糖高，有刺激臭味，粘度大，泡沫 多。
2、以上3种检查法的不足
以上3种检查法未发现染菌，还不能肯定未被
染菌；
原因是以上检查法只能检查杂菌浓度较大的染
菌情况（>1个/ml）
(四)染菌情况分析 1、单罐染菌 不是系统问题，而是该罐本身的问题。如种子 带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分过滤 器失效
2、多罐染菌 系统问题，如空气过滤系统有问题，特别是总过滤器
3. 灭菌温度和时间的选择
培养物质受热破坏也可看作一级反应：
dC k ' C dt
式中C：对热不稳定物质的浓度；k’：分解速度常数； k’的变化也遵循阿累尼乌斯方程：
E ' ) RT E k A exp( ) RT k ' A' exp(
都与相应的活化能及T有关
当T1 →T2 ㏑(k2/k1)/㏑(k2’/k1’)=ΔE/ΔE’>1 (∵ΔE>ΔE’) ∴随着 T 上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成分 分解速率增加倍数，故一般选择高温快速灭菌 。
撑件。
口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、
进料管口
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
法兰连接不当造成的“死角”
2、空气带菌 因为空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不 慎便会导致空气除菌失败。
第四章
发酵工业的无菌技术
本章内容
一、染菌的防治 二、发酵工业的无菌技术
三、培养基及设备灭菌
四、空气除菌
什么是染菌？
发酵过程中除了生产菌以外，还有其 它菌生长繁殖.
一、染菌的影响
发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是 发酵工业的致命伤。
1. 造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失 2.扰乱生产秩序，破坏生产计划。 3.遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会 影响人们的情绪和生产积极性。 4.影响产品外观及内在质量。
（一）染菌对发酵的影响
生产不同的品种，可污染不同种类和性质的
微生物。
不同污染时间，不同污染途径，污染不同菌量， 不同培养基和培养条件又可产生不同后果 。
1、发酵染菌对不同品种的影响 不 同 种 类 菌 种
A．细菌
谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少 染杂菌，但噬菌体威胁大。
肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，
长期没有检查，可能受潮失效；移种或补料的分配站
有渗漏或灭菌不彻底。 3、前期染菌 种子带菌、培养基灭菌不彻底
4、中后期染菌
补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀门
渗漏，一般不会是种子问题。
五、染菌的防止
1、防止种子带菌 制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。 沙土制备时要多次间歇灭菌
注意接种时的无菌操作
] kR ks
ND
→Nt/N0=KR/(kR-kS) [ekst-ks/kR e-kRt]
dNs/dt =kR NR -ks Ns
式中NR：耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数
ND：死亡的芽孢数；kR：耐热性芽孢的比死亡速率； ks：敏感性芽孢的比死亡速率； N0：初始活芽孢数。
∴在T相同时，对数与非对数定律的灭菌时间t不同。