安普霉素的生物合成辛二糖C7-N上 甲基的甘氨酸来源

中国科学 C 辑 生命科学 2006, 36 (1): 35~42 35安普霉素的生物合成: 辛二糖C7′-N 上甲基的甘氨酸来源*许铭翾①† 朱颖旻①† 金志坤①武慧渊②李相丰②杨蕴刘①焦瑞身①姜卫红① 吴厚铭③ 田 威② 白秀峰②* 赵国屏①*(① 中国科学院上海生命科学院上海植物生理生态研究所分子微生物实验室, 上海 200032; ② 沈阳药科大学制药系,沈阳 110016; ③ 中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室, 上海 200032)摘要 安普霉素是一类结构特殊的氨基糖苷类抗生素, 其分子中含一个稀有的辛二糖结构单元. 迄今为止, 尚无关于安普霉素生物合成途径及其前体化合物的完整报道. 研究发现, 向发酵培养基中添加甘氨酸和丝氨酸均可以出现在菌体生长保持基本不变的情况下促进抗生素产量的现象, 表明甘氨酸和/或丝氨酸可能参与了安普霉素的合成. [2-13C]甘氨酸示踪实验的核磁共振(NMR)检测结果表明, 甘氨酸专一地掺入安普霉素辛二糖环C7′-N 甲基. 同时发现, 菌体胞内的S 腺苷甲硫氨酸(SAM)水平上升与外加甘氨酸的量呈正比, 但是甲硫氨酸的加入会抑制安普霉素的合成. 据报道, 甲硫氨酸对结构中含有甲基取代基的抗生素, 如对rapamycin 的 生物合成中转甲基过程有抑制作用. 由此推测, 尽管甲硫氨酸本身对抗生素产量呈抑制作用, 甘氨酸仍然可能通过甲硫氨酸循环提供甲基. 此外, [2-13C,15N]丝氨酸的示踪实验结果表明丝氨酸也可能作为安普霉素的限制性前体物参与了NH 2的合成.关键词 黑暗链霉菌 安普霉素 辛二糖 13C-NMR [2-13C]甘氨酸 15N-NMR[2-13C, 15N]丝氨酸收稿日期: 2005-08-07; 接受日期: 2005-09-13 † 同等贡献* 联系人, E-mail: baixiufengph@ ; gpzhao@ , mxxu@安普霉素也称为尼拉霉素组分2. 尼拉霉素是由黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrabrius )产生的氨基糖苷类复合物[1,2]. 安普霉素的结构非常独特, 其分子中含有一个β型吡喃糖苷8碳双环构型的氨基糖结构,这一结构明显区分于其他氨糖类抗生素[3~6]. 迄今为止, 已报道的具有该辛二糖环结构的氨糖类抗生素只有3种: 安普霉素、氧化安普霉素和糖霉素(KA-686, 4″-去氨-4″-羟基安普霉素)[7,8]. 氧化安普霉素就是尼36中国科学C辑生命科学第36卷拉霉素的组分因子7, 而糖霉素的产生菌Saccharo- polyspora hirsute ATCC 27875的同时也能产生微量的安普霉素[6]. 因此, 我们推测类似安普霉素的含辛二糖结构的氨糖类抗生素具有相似的特殊的合成途径[1]. 安普霉素的另外两个结构单元(图1)为4-氨基-4-去氧-D-α-葡萄糖和2-脱氧链霉胺(2-DOS).图1 安普霉素的化学结构安普霉素分子中包含3个结构单元: Ⅰ示4-氨基-4-去氧-D-α-葡萄糖; Ⅱ示辛二糖; Ⅲ示2-脱氧链霉胺. 对本文中未涉及的C原子未加以标记, 源于[2-13C]甘氨酸的辛二糖N-CH3以*号标注据报道, 与其他氨基糖苷类抗生素类似[9~11], 标记的葡萄糖前体可掺入安普霉素的所有结构单元: 辛二糖的C1-C6, 2-DOS和4-氨基-4-去氧葡萄糖[1]. 对安普霉素产生菌阻断突变株中间体积累分析的研究表明安普霉素的合成顺序有可能如下式:2-DOS→巴龙霉胺→安普霉胺→安普霉素.式11)本文研究了向发酵培养基中添加不同的氨基酸对黑暗链霉菌菌体生长及安普霉素产量的影响. 添加甘氨酸对安普霉素产量的促进作用, 提示甘氨酸可能是安普霉素生物合成过程中的限制性前体物. [2-13C]甘氨酸示踪实验证实了甘氨酸能够掺入辛二糖C7′-N甲基.1 材料与方法1.1 菌株, 培养基和培养条件(1) 菌株: 黑暗链霉菌ATCC 17920[6]产生尼拉霉素的两个组分: 组分Ⅱ安普霉素和组分Ⅶ氧化安普霉素. 本研究中的菌株UD2为ATCC 17920的阻断突变株, 只产单一组分的安普霉素.(2) 培养基:斜面培养基: 1%葡萄糖, 0.3%碳酸钙, 0.3%蛋白胨, 1.0%黄豆粉, 0.2%酵母膏, 1.1%琼脂粉(灭菌前pH调至7.4).种子培养基: 成分与斜面培养基相同, 但不加琼脂粉.发酵培养基: 2.0%葡萄糖, 4.0%淀粉, 5.0%黄豆粉, 0.5%碳酸钙和0.2%硫酸镁(灭菌前pH调至7.0). 发酵培养基中的固体成分先在沸水中煮3次, 每次30 min, 残渣用纱布虑弃.(3) 培养条件: 孢子或菌丝体接种至斜面培养基, 培养5天后, 转种至种子培养基, 培养16~20 h; 再以十分之一量转种至发酵培养基中(装量为30 mL的250 mL三角瓶); 37℃恒温, 旋转摇床220 r/min, 避光连续培养4天[6].1.2 抗生素效价的测定以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为指示菌用杯碟法测定抗生素效价[2].1.3 安普霉素的纯化通过离心(8000 r/min, 5 min)或过滤的方法除去发酵液中的不溶物和菌丝体. 所得发酵液中加入0.2%草酸以沉淀发酵液中的蛋白, 10000 r/min离心5 min, 收集上清. 上清用NaOH回调pH至7~8后, 过预平衡的HD-2的离子交换树脂(相当于Amberlite CG-50(氨型)树脂, 25 mL发酵液/g树脂, 中国上海华震公司), 饱和后的柱子用蒸馏水洗涤, 然后以0.1%~0.5%的氨水进行梯度洗脱. 洗脱液以磷酸钨沉淀反应进行监测, 收集呈阳性的洗脱组分, 通过冷冻干燥浓缩至终浓度为200 mg/mL的浓溶液. 进一步以制备型硅胶(60H, E. Merck. Art.7736)薄层层析纯化, 溶剂系统为醋酸氨(10%):甲醇(1:1), 层析完后, 以茚三酮显色反应来确定安普霉素的层析条带. 收集条带, 以蒸馏水洗脱硅胶粉, 收集洗脱液, 冷冻干燥浓缩至白色粉末(纯度900 µg/mg)供核磁共振(NMR) 检测.1) 李相丰等, 未发表第1期许铭翾等: 安普霉素的生物合成: 辛二糖C7′-N上甲基的甘氨酸来源371.4 S腺苷甲硫氨酸(SAM)的定量分析SAM的浓度用HPLC法[12]定量检测.1.5 同位素掺入的检测[2-13C]甘氨酸购自ISOTEC公司. 转种后36 h, 将[2-13C]甘氨酸添加到发酵培养基中. 13C-NMR检测仪器为瓦里安 XL-100傅立叶变换检测仪. 13C标记的产物及自然丰度的产物在平行的条件下进行检测. 15N的NMR检测参见文献[13].2 结果2.1 在发酵培养基中分别添加丝氨酸、甘氨酸或苏氨酸能显著提高黑暗链霉菌UD2安普霉素的产量选择向发酵培养基中分别添加不同的氨基酸来研究它们对抗生素生物合成的影响. 结果表明, 5种氨基酸对抗生素的合成具有促进或抑制作用(图2). 单独添加甘氨酸, 丝氨酸或苏氨酸使抗生素产量明显增加, 相反, 甲硫氨酸和半胱氨酸的加入使产量降低, 但均未发现对菌体生长都有明显的影响.2.2 [2-13C]甘氨酸能够有效地掺入到安普霉素中并标记到辛二糖C7′-N的甲基上在多数细菌的初级代谢中, 丝氨酸和甘氨酸可以相互转化, 如式2; 同时, 苏氨酸也可以转化成甘氨酸和丝氨酸[14,15]. 选择甘氨酸进行同位素示踪实验, 可图2 不同氨基酸对安普霉素产量的影响待试氨基酸在转种后, 发酵0 h时加到发酵培养基中. 对照为加同样体积的无菌水, 氨基酸的终浓度除甲硫氨酸为0.1%(w/v)外, 其余为0.3%式2研究甘氨酸是如何参与安普霉素的生物合成的.(1) 甘氨酸掺入实验条件的优化: 如图3(a)所示, 当甘氨酸的添加量为0.3%(w/v, 终浓度10 mmol/L) 时, 抗生素的产量最高. 图3(b)表明, 在发酵36 h加入0.3%的甘氨酸, 抗生素产量的增加幅度最大, 发酵结束后单位菌体的抗生素效价能达到约500 U/g.图3 在黑暗链霉菌UD2的发酵中添加甘氨酸的实验条件优化(a) 在发酵0 h时加入甘氨酸, 浓度0.1%~0.7%, 发酵96 h后收获; (b) 0.3%的甘氨酸分别于发酵0, 12, 24, 36, 48, 72 h时加入, 发酵96 h后同法测定抗生素效价38中国科学C辑生命科学第36卷黑暗链霉菌生长曲线实验结果表明, 转种发酵至36 h,菌体的生长进入平台期(数据未显示)次级代谢产物,如安普霉素, 在这个时期开始合成. 此时, 向培养基中添加0.3%的甘氨酸能够被菌体最好的利用. 因此,接下来的同位素掺入实验将按照上述条件进行.(2) [2-13C]甘氨酸的掺入: 按上述优化的条件向发酵培养基中添加[2-13C]甘氨酸(丰度25%). 安普霉素的13C-NMR图谱参见文献[13], [2-13C]甘氨酸标记安普霉素的检测结果见图4, 化学位移值见表1.表1 自然丰度和[2-13C]甘氨酸标记的安普霉素的化学位移值碳原子自然丰度安普霉素的化学位移值标记安普霉素的化学位移值1 50.410 51.0252 35.376 34.9953 49.458 49.8794 86.761 86.6335 76.030 76.4326 77.220 76.7991′ 100.660 100.660 2′ 49.000 49.458 3′ 31.878 32.226 4′ 67.221 67.606 5′ 70.298 70.829 6′ 65.500 65.884 7′ 61.599 62.021 8′ 95.734 96.118 1″ 94.672 95.203 2″ 70.994 71.506 3″ 73.502 74.015 4″ 52.388 52.901 5″ 72.733 73.191 6″ 60.958 61.489 N-Me 32.134 32.226通过比较自然丰度(上)和[2-13C]甘氨酸标记(下)的安普霉素的13C-NMR图谱可以确定[2-13C]甘氨酸标记碳原子在安普霉素分子中的分布. 当选定一个已知的碳峰作为参照时, 即可计算出每个碳峰的积分强度. 鉴于所得的13C-NMR图谱中, C1′的碳峰不会因加入了前体而发生改变, 故被选作为参照峰[1].有关[2-13C]甘氨酸掺入的NMR研究结果(图4)表明, 仅有N-CH3的一个碳被标记; 也就是说, [2-13C]甘氨酸专一而有效地标记在N-CH3, [2-13C]甘氨酸标记的和自然丰度的安普霉素N-CH3峰高的积分比为 4.95:1, 证实了C7′的N-甲基来源于甘氨酸, 这与之前的喂饲实验结果一致(图2), 甘氨酸很可能是安普霉素生物合成中的限制性前体.2.3 在黑暗链霉菌发酵过程中添加甘氨酸能够明显提高菌体胞内的SAM水平在初级代谢中甘氨酸主要是通过甲硫氨酸循环途径来提供甲基的(图5). 在安普霉素的发酵过程中, 外源加入甲硫氨酸使安普霉素产量降低(图2). 但是, 甘氨酸的加入也引起菌体胞内SAM浓度增加(表2). 在发酵0 h时, 向发酵培养基中添加0.3%甘氨酸引起菌体胞内SAM浓度增加54%; 发酵36 h, 添加甘氨酸导致胞内SAM浓度增加90%, 相应的安普霉素的产量也增加了.2.4 [2-13C,15N]丝氨酸掺入安普霉素如图2所示, 添加适量的丝氨酸和甘氨酸都可以提高安普霉素的产量, 并对菌体生长没有明显影响. 因此, 我们也通过[2-13C,15N]丝氨酸掺入实验来研究丝氨酸在安普霉素生物合成中的作用.发酵培养基中添加0.3%(w/v)[2-13C,15N]丝氨酸(丰度为25%), 添加条件按照甘氨酸添加优化实验中的最佳条件进行. 13C-NMR检测的结果表明, 没C峰被标记上(数据未显示).由于安普霉素的15N-NMR化学位移值具有pH依赖性漂移, [2-13C,15N]丝氨酸标记和自然丰度的安普霉素的15N-NMR分别选择在酸性条件(pH=3)和碱性条件(pH=8)下进行检测, 这样可以使得部分化学位移值重叠的氮峰得到分离. 安普霉素的15N-NMR化学位移值见报道[17]. [2-13C,15N]丝氨酸的掺入结果见图6. 安普霉素15N化学位移值见表3.由于自然丰度的氮原子丰度非常低, 在我们的检测条件下, 样品NMR检测的浓度为10 mmol/L, 自然丰度的N信号不能被检测到(图6). 因此, 通过比较[2-13C,15N]丝氨酸标记的和报道的安普霉素化学位移值来确定同位素的掺入情况(表3). 尽管据报道, N(1)和N(3)峰为勉强暂定的, N(7′)及N(4″)则不能清楚区分[15], 本试验NMR检测结果至少可以肯定N(2′)被[2-13C,15N]丝氨酸标记, 另外N(1), (3), N(7′)和N(4″)可能被其标记了.第1期许铭翾等: 安普霉素的生物合成: 辛二糖C7′-N上甲基的甘氨酸来源39图4 自然丰度(a)和[2-13C]甘氨酸标记(b)的安普霉素13C-NMR图谱箭头标记的峰为[2-13C]甘氨酸标记的 N-CH3的碳峰图5 推测安普霉素生合成过程中甘氨酸供甲基的途径[16]表2 添加外源甘氨酸对黑暗链霉菌胞内SAM浓度的影响a)对照/h 添加0.3%甘氨酸/h0 36 0 36pH 7.67.67.77.8菌体浓度/% 11.0 10.6 11.0 10.6效价/U·g−1561 520 681 738SAM浓度/ng·µL−10.892 0.875 1.386 1.658a) 所有数据均在发酵完成后测定. 对照以等体积的无菌水代替0.3%甘氨酸40中国科学 C 辑 生命科学第36卷表3 比较报道的和[2-13C,15N]丝氨酸标记的安普霉素的15N-NMR 化学位移值a)pH N(1)b) N(3)b) N(23′) N(7′)c) N(4″)c) 报道值3 17.2 15.7 16.5 11.4 ca.10.0 15N-丝氨酸标记 3 15.88 16.72 10.30 报道值8 10.5 12.4 10.0 1.2 0.9 15N-丝氨酸标记8 12.61 9.94 1.03a) 化学位移值以NH 4Cl 为标定, 单位为σ ; b) 据报道, 该位移值为暂定的[16]; c) 据报道, 该位移值为非肯定的[16]图6 自然丰度(上)和[2-13C,15N]丝氨酸标记(下)的安普霉素的15N-NMR 图谱(a) 酸性条件下(pH = 3); (b) 碱性条件下(pH = 8). 箭头所指为[2-13C,15N]丝氨酸标记的氮峰3 讨论安普霉素的化学结构在氨糖类抗生素中非常独特, 尤其是分子结构式中的第II 部分—— 辛二糖(图1). 本研究中, 氨基酸喂饲实验结果揭示了3种氨基酸(甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸)可能是安普霉素生合成的限制性前体物. 该结果与目前已有的氨基酸作为抗生素生物合成的结构单元或前体的广泛报道一 致[18~21]. [2-13C]甘氨酸和[2-13C,15N]丝氨酸掺入实验证明, 安普霉素中唯一的取代甲基—— 辛二糖环上C7′-N 上的甲基来源于甘氨酸的2位C 原子. 安普霉素中的氨基取代基可能来源于丝氨酸.氨基糖苷类抗生素的取代甲基多数来源于甲硫氨酸[19,22~26]. 本研究发现, 向黑暗链霉菌UD2的发酵培养基中加入外源的甘氨酸导致胞内的SAM 水平增加, 相应的抗生素产量也明显提高. 这项结果表明, 甘氨酸提供甲基极可能是通过甲硫氨酸循环实现的, 同时这个过程中也应需要四氢叶酸(THF)的参与. 实际上, 在向发酵培养基中添加外源的THF(终浓度 4 mmol/L)时, 菌体胞内的SAM 量增加一倍, 相应的抗生素产量增加13%(数据未显示). 但是, 氨基酸喂饲实验的结果表明, 外源添加0.1%甲硫氨酸却会严重抑制安普霉素的合成(图2). 在以前的研究中发现, 外源的甲硫氨酸会抑制一些具有甲基取代基的抗生素的产量. 例如: rapamycin 的生物合成研究结果显示, 甲硫氨酸会抑制至少一种去甲基rapamycin 甲基转移酶和S-腺苷甲基转移酶的活力, 从而降低rapamycin 的产量[27]. 因此, 推测在安普霉素的生物合成途径中, 甲硫氨酸对安普霉素产量的抑制具有类似的机制. 从而可以解释, 为什么添加中间体甘氨酸和THF 均可第1期许铭翾等: 安普霉素的生物合成: 辛二糖C7′-N上甲基的甘氨酸来源41以提高安普霉素的产量, 但是添加甲硫氨酸本身却会抑制抗生素的合成. 换言之, 尽管甲硫氨酸是甲硫氨酸循环中的关键中间体, 但是增加外源甲硫氨酸的量会抑制甲基转移和甲基化的过程, 从而导致抗生素的产量降低.虽然甘氨酸和丝氨酸都可以做甲基的供体, 它们之间也可以相互转化, 但丝氨酸的第2位碳原子并不能标记到安普霉素中. 目前, 尚不能排除C3对安普霉素的合成有贡献, 因为实验中仅选择了C2位的同位素标记. 另外, 更令人感兴趣的是, 自然丰度和[2-13C,15N]丝氨酸标记的安普霉素的15N-NMR检测结果证明, 至少N(2′)H2基团是来源于丝氨酸的, 其余的氨基, N(1), N(3), N(7′), N(4″)的氮峰的强度有可能由于15N标记丝氨酸的掺入而增加, 但是还不能准确确定. 要对每个N峰在不同pH条件下进行精确的定位, 需要有更多的实验数据, 如提高自然丰度的样品的浓度, 确定自然丰度安普霉素氮谱中氮峰的定位和在更多的pH条件下进行15N-NMR检测. 总之, 这里报道的实验结果表明, 丝氨酸在安普霉素生物合成中的作用与甘氨酸不同, 丝氨酸是提供氨基的限制性前体物.总而言之, 本研究中利用同位素示踪实验证实了在安普霉素的生物合成中, 甘氨酸提供了辛二糖上C7′-N上的甲基, 这一过程很可能是通过甲硫氨酸循环完成的. 丝氨酸至少是N(2′)氨基的主要供体. 这项研究成果也为今后安普霉素的合成途径研究奠定了坚实的方法基础.致谢感谢沈阳药科大学的张怡轩博士和何建勇教授的支持和帮助.参考文献1 Stark W M, Hoehn M M, Knox N G. Nebramycin, a newbroad-spectrum antibiotic complex. I. Detection and biosynthesis.Antimicrobial Agents Chemother, 1967, 7: 314~3232 Higgins C E, Kastner R E. Nebramycin, a new broad-spectrumantibiotic complex. II. Description of Streptomyces tenebrarius.Antimicrobial Agents Chemother, 1967, 7: 324~3313 Stark W M, Knox N G, Wilgus R M. Strains of streptomyces tene-brabrius and biosynthesis of nebramycin. Folia Microbiol, 1971,16(3): 205~2174 O’Conner S, Lam L K, Jones N D, et al. Apramycin, a uniqueaminocyclitol antibiotic. J Org Chem, 1976, 41(12): 2087~20925 Umezawa H, Hooper I R. In Okuda T, Ito Y, eds. AminoglycosideAntibiotics. Berlin Heidberg, New York: Springer-Verlag, 1982.179~1806 Stark W M. US patent 3 962 427, 1976-06-087 Kamiya K, Deushi T, Iwasaki A, et al. A new aminoglycoside an-tibiotic, KA-5685. J Antibiot, 1983, 36(6): 738~7418 Awata M, Satoi S, Muto N, et al. Saccharocin, a new aminoglyco-side antibiotic. Fermentation, isolation, characterization and structural study. J Antibiot, 1983, 36(6): 651~6559 Rinehart K L Jr. Biosynthesis and mutasynthesis of aminocyclitolantibiotics. J Antibiot, 1979, 32(12): 32~4610 Goda S K, Akhtar M. Neomycin biosynthesis: The incorporationof D-6-deoxy-glucose derivatives and variously labelled glucose into the 2-deoxystreptamine ring. Postulated involvement of 2-deoxyinosose synthase in the biosynthesis. J Antibiot, 1992, 45(6): 984~99411 Wee T G, Frey P A. Studies on the mechanism of action of uridinediphosphate galactose 4-epimerase. II. Substrate-dependent reduc-tion by sodium borohydride. J Biol Chem, 1973, 248(1): 33~4012 Wang W, Kramer P M, Yang S, et al. Reversed-phase high-perfo-rmance liquid chromatography procedure for the simultaneous de-termination of S-adenosyl-L-methionine and S-adenosyl-L-homo- cysteine in mouse liver and the effect of methionine on their concen-trations. J Chromatogr Biomed Sci Appl, 2001, 762(1): 59~65[DOI]13 Szilagyi L, Pustahelyi Z S. Apramycin: Complete 1H and 13C NMRassignments and study of the solution conformation by ROESY measurements. Magn Reson Chem, 1992, 30(2): 107~117[DOI]14 Wong H C, Lessie T G. Hydroxy amino acid metabolism in Pseudo-monas cepacia: Role of L-serine deaminase in dissimilation of serine, glycine, and threonine. J Bacteriol, 1979, 140(1): 240~24515 Angelaccio S, Pascarella S, Fattori E, et al. Serine hydroxy-methyltransferase: Origin of substrate specificity. Biochemistry, 1992, 31(1): 155~162[DOI]16 Selhub J F. Vitamin B12 and vitamin B6 and one carbon metabo-lism. J Nutr Health Aging, 2002, 6(1): 39~4217 Dorman D E, Paschal J W, Merkel K E. 15N Nuclear magneticresonance spectroscopy. The Nebramycin aminoglycosides. J Am Chem Soc, 1976, 98(22): 6885~688818 Favret M E, Paschal J W, Elzey T K, et al. Biosynthesis of thio-peptide antibiotic A10255: incorporation of isotopically-labeled precursors. J Antibiot, 1992, 45(9): 1499~151119 Lee B K, Condon R G, Wagman G H, et al. Micromonospora-pro-duced sisomicin components. J Antibiot, 1976, 29(7): 677~68442中国科学C辑生命科学第36卷20 Ohnuki T, Muramatsu Y, Miyakoshi S, et al. Studies on novelbacterial translocase I inhibitors, A-500359s. IV. Biosynthesis of A-500359s. J Antibiot, 2003, 56(3): 268~27921 van Kleef M A, Duine J A. L-tyrosine is the precursor of PQQbiosynthesis in Hyphomicrobium X. FEBS Lett, 1988, 237(1-2): 91~97[DOI]22 Habib el-SE, Scarsdale J N, Reynolds K A, Biosynthetic origin ofhygromycin A. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(7): 2065~ 2071[DOI]23 Deguchi T, Okumura S, Ishii A, et al. Synthesis of carbon-14 andtritium labeled sagamicin. J Antibiot, 1977 30(11): 993~99824 Itoh S, Odakura Y, Kase H, et al. Biosynthesis of astromicin andrelated antibiotics. I. Biosynthetic studies by bioconversion ex-periments. J Antibiot, 1984, 37(12): 1664~1669 25 Walker J B. Enzymatic synthesis of aminoglycoside antibiotics:Novel adenosylmethionine: 2-deoxystreptamine N-methyltransferase activities in hygromycin B- and spectinomycin-producing Strepto-myces spp. and uses of the methylated products. Appl Environ Mi-crobiol, 2002, 68(5): 2404~2410[DOI]26 Seno E T, Baltz R H. Properties of S-adenosyl-L-methionine:Macrocin O-methyltransferase in extracts of streptomyces fradiae strains which produce normal or elevated levels of tylosin and in mutants blocked in specific O-methylation. Antimicrob Agents Chemother, 1981, 20(3): 370~37727 Kim W S, Wang Y, Fang A, et al. Methionine interference in Ra-pamycin production invovlves repression of demethylrapamycin methyltransferase and S-adenosylmethionine synthetase. Antimi- crob Agents Chemother, 2000, 44(10): 2908~2910[DOI]。