微生物限度方法学验证
微生物限度和无菌检查法验证
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方法验证的步骤与内容 1、制备验证试验用菌液 按药典无菌检查法中培养基灵敏度检查项中试验用 菌液的制备方法将规定需用的试验菌分别制成每毫 升中含10～100个菌（CFU）的供试菌液。 2、样品的前处理方法 样品的前处理方法是验证试验的一部分，需证明所 用的处理方法对各试验菌的生长无影响。 根据供试品的性状，选用以下适宜的方法，或几种 方法联合使用： 溶解：验证所用溶液、助溶剂和水浴助溶温度对微 生物的生长无影响。
7
乳化：验证所用乳化剂和水浴助溶温度的有效性、 使用量及对微生物的生长无影响。 破乳：验证所用破乳剂的有效性、使用量及对微生 物的生长无影响。 萃取：验证有机相选择的合理性、有效性及对微生 物的生长无影响。 稀释：验证降低供试品相对抑菌浓度的有效稀释倍 数。 离心：验证所用转速、时间和微生物的分布情况。 应说明采取某种前处理方法的原因，如样品不需要 特别的前处理就能制成均匀的供试液，这一步可以 省掉，直接进入确定样品有无抑菌性的步骤。
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选择适当的方法消除或有效降低供试品的抑菌性 根据供试品的特性选择药典规定的消除其抑菌性的 方法（一种或几种方法联合），或根据药物的化学 特性，寻找出其他合理、有效的方法，特别是有效 的中和剂；并通过模拟试验（验证试验）对消除或 降低抑菌性的效果进行检验。 无菌检查可采用：①薄膜过滤法；②中和法（目前 药典仅收载β-内酰胺酶处理法）。 ①薄膜过滤法适用于液体供试品和可溶于水的固体 供试品（只要许可，应首先采用）。验证的重点是 确定滤膜的适用性、确定冲洗的方法和冲洗液的用 量。
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方法验证中应注意的问题与评价要求 1、验证试验的完整性 验证试验的完整性与方法的科学性密切相关，验 证工作不完整，就不能全面体现供试品和试验过 程对微生物的影响情况，则很可能影响或干扰对 最终试验结果的判断。故应按照中国药典2005年 版的要求进行方法验证。特别是对某些具有抑菌 性的供试品，需采取适当的方法消除或有效降低 供试品的抑菌性。在对供试品进行特殊处理时， 既要考察供试品的抑菌性，还要考察在供试液制 备过程中微生物受影响的程度（稀释剂对照组） 。
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋
白胨溶液30 ml溶解后，过滤。
7.活菌计数
活菌计数结果见表1。
10－4稀释
10－5稀释
10－7稀释
试验次数
1
2
1
21Βιβλιοθήκη 2金黄色葡萄球菌56
60
枯草芽孢杆菌
77
79
白色念珠菌
86
70
黑曲霉菌
80
76
铜绿假单胞菌
47
50
方法验证
直接接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌液（30-100个/ml），置规定温度培养3-5天，逐日观察结果。
仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无菌试验过滤培养器（批号20050105）北京牛牛基因有限公司。
01
方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实验
02
操作方法 菌液制备： 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 32.5±2.5℃培养18～24小时；
培养：硫乙醇酸盐流体培养基桶30-35℃培养；真菌培养基桶23-28℃培养。观察结果。
结果 细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2。
表1 细菌数计数 表2 真菌数计数结果
*
菌 种
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
铜绿假单胞菌
生孢梭菌
计数(CFU)
22
26
36
39
62
66
58
54
45、 23
128、108
微生物限度方法学验证
微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。
表4试剂稀释液：（1）pH6.8取，摇匀，既得。
（2）0.9%（3）0.05用。
（420ml徐徐滴入。
1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。
上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。
2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。
用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。
菌悬液在室温下放置应在122.130～35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉1ml(内含菌约50～100cfu)，注入无菌平皿中（取用黑曲霉时应注意自身安全），立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数。
同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验，作为对照。
其大小、形态应与对照培养基一致，且数量应不小于对照培养基的70%。
细菌、霉菌及酵母菌培养基适用性检查证明此批次培养基可以准确的检测出相应微生物情况。
版药典微生物限度检查方法验证方案
版药典微生物限度检查方法验证方案验证微生物限度检查方法的方案一、实验目的：验证药典中的微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性。
二、实验材料：1.药典中规定的微生物限度检查方法；2.待验证的药品样品；3.适用的培养基和培养条件；4.培养基的质量控制菌种。
三、实验步骤：1.制备适用的培养基：按照药典中规定的方法和成分制备适用的培养基，并进行批次记录。
2.准备质量控制菌种：3.制备菌液悬液：从购买的质量控制菌种中，挑取一株菌种进行连续传代培养至活性最佳的生长阶段。
然后制备菌液悬液，以备后续试验使用。
4.扩大悬液应用范围：从第3步得到的菌液悬液中，取适量接种于适用培养基上，培养出代表性的细菌菌液悬液。
然后，通过菌液的光学检测、显微镜检查和菌落计数，确定菌液的细菌浓度。
5.验证方法的准确性：将待验证的药品样品加入培养基，根据药典中的方法将培养基分成不少于3组。
每组培养基中分别加入一定量的菌液悬液，并在药典规定的温度和时间下培养。
同时，设置对照组，只加入菌液悬液和培养基。
6.菌落计数：取适量的培养基样品，分别进行菌落计数，并根据培养基的数量、培养基总菌落数、对照组的菌落数等数据，计算菌落形成单位。
7.验证方法的可靠性：将待验证的药品样品按照药典中的方法进行连续验证，至少重复3次。
然后，对比不同验证结果的一致性和稳定性，评估方法的可靠性。
8.验证方法的可行性：根据实际的样品情况和验证结果，评估方法在操作上和技术上的可行性。
如，是否存在样品的特殊要求，检测方法是否能满足检测要求等。
四、数据处理与分析：根据实验结果的菌落计数和验证的次数，进行数据处理和统计分析。
评估验证结果的一致性、可靠性和可行性。
五、结论：根据实验结果和数据分析，得出关于药典中微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性的结论。
如果验证结果与药典一致，说明方法可靠并可以使用。
如果验证结果与药典不一致，需要进一步分析原因和进行修正或优化。
微生物限度方法学验证方案
微生物限度方法学验证方案1.实验目的：本实验的目的是确定产品中大肠杆菌的数量，以评估其微生物污染程度，并验证产品是否符合相关规定的微生物限度标准。
2.实验材料和仪器：-试样：待测试的产品样品（如药品、食品等）-培养基：亚洲太平洋社会协调委员会（APHA）液体培养基或平板培养基-培养器具和耗材：试管、平板、无菌纱布、无菌拔火棉、无菌吸管、无菌移液器、无菌塑料培养瓶等-仪器设备：恒温箱、培养箱、显微镜等3.实验步骤：3.1样品制备：将待测试产品样品均匀涂布于无菌培养基平板上，根据需要，将不同稀释度的样品分别涂布于多个平板上。
3.2培养：将涂布好样品的平板放入恒温箱或培养箱中，在适当的温度（通常为37°C）下培养一定时间（通常为24小时）。
在培养的过程中注意保持无菌环境。
3.3平板计数：在培养完成后，检查每个平板上的菌落形成情况。
根据实验需要，可以选择不同的方法进行菌落计数。
常见的方法有手工计数和自动计数仪器。
例如，使用显微镜进行手工计数，或使用自动计数仪器进行电子计数。
3.4数据处理：根据菌落计数结果计算大肠杆菌的数量，并将结果与相关的微生物限度标准进行比较。
如果实验结果符合标准，则产品可被视为合格；如果结果不符合标准，需要采取相应的控制措施，如重新调整产品配方、改变生产工艺等。
4.实验注意事项：-所有试验操作都必须在无菌环境中进行，以避免结果被外源性微生物污染。
-使用符合相关质量标准的试剂和培养基。
-实验前应进行适当的预试验，以确定最佳的稀释度和培养条件。
-大肠杆菌计数要根据不同的产品、数量和国家的相关标准来确定。
-实验结果的准确性和可靠性需要重复试验和验证。
通过以上实验步骤和注意事项，可以进行微生物限度方法学验证，确定产品中大肠杆菌的数量，并评估其微生物污染情况。
这个验证方案可以用于药品、食品和其他产品的质量控制和安全评估。
微生物限度检验方法验证__概述说明
微生物限度检验方法验证概述说明1. 引言1.1 概述微生物限度检验方法验证是一项重要的实验技术，用于评估和确认微生物对产品的影响程度和存在情况。
它可以帮助我们了解产品中是否存在有害微生物，并确保产品在使用过程中的安全性。
本文旨在介绍微生物限度检验方法验证的概念、重要性以及一般流程，并详细介绍常见的验证技术及其特点。
1.2 文章结构本文将分为五个部分进行阐述。
首先，在引言部分可以了解到微生物限度检验方法验证的概述、目的和文章结构。
接下来，在第二部分中探讨微生物限度检验方法验证的重要性，包括其背景与意义、验证方法的必要性以及验证结果的影响和应用。
第三部分将介绍微生物限度检验方法验证的一般流程，包括设计验证方案和实验步骤、样品的准备与处理，以及实验操作及数据分析。
在第四部分中，则具体介绍常见微生物限度检验方法验证技术，包括营养琼脂培养基平板计数法验证方法、膜过滤法验证方法以及PCR法验证方法。
最后，在第五部分中进行总结，对微生物限度检验方法验证的重要性进行归纳，并展望未来的发展方向。
1.3 目的本文的目的是为读者提供一个清晰全面了解微生物限度检验方法验证的文章。
通过介绍其概述、重要性、一般流程和常见技术，希望读者能够理解微生物限度检验方法验证在产品质量控制中的作用，并对未来方向有所思考。
同时，本文也为从事相关研究和实验工作的科研人员提供了参考和指导，以提高微生物限度检验方法验证技术的应用水平。
2. 微生物限度检验方法验证的重要性2.1 微生物限度检验的背景和意义微生物限度检验是一项重要的质量控制方法，用于评估药品、食品、化妆品以及其他消费产品中是否存在病原微生物和致病菌。
微生物污染可能引发严重的健康问题，包括细菌感染、传染病传播和中毒等。
因此，确保产品符合相关标准和法规对于保护公众健康至关重要。
2.2 验证方法的必要性验证微生物限度检验方法的准确性和可靠性是非常必要的。
通过验证方法，可以确认该方法能够准确地检测出有害微生物存在，并排除误报或漏报的可能性。
微生物限度方法学验证
微生物限度方法学验证
微生物限度方法学验证是一种用于确定化妆品和药品中微生物污染水平的方法。
这种验证方法用于确定产品是否符合微生物限度规定，并确保产品的安全性和质量。
微生物限度方法学验证的步骤包括：
1. 根据相关规定选择适当的微生物限度测试项目。
常见的微生物测试项目包括总生菌数、霉菌和酵母菌、大肠菌群等。
2. 准备适当的培养基和培养条件，以促使微生物在培养基上生长。
3. 从样品中获取适当的微生物培养物。
样品可以是产品中的一部分或整个产品。
4. 在适当的培养基上接种微生物培养物。
5. 在适当的环境条件下孵育培养基，以促进微生物生长。
6. 定期检查培养基的生长情况，包括观察菌落形态和计数菌落数量。
7. 将菌落转移到适当的检测方法中，如涂抹法、膜过滤法等。
8. 使用适当的培养基和培养条件，在适当的温度和pH条件下，观察和计算培养基上的微生物生长数量。
9. 比较结果与规定的微生物限度标准，确定产品是否符合要求。
微生物限度方法学验证可以帮助制药和化妆品行业确保产品的微生物质量，并确保产品在使用过程中不会对消费者的健康有害。
这种验证方法需要严格的实验室操作和合理的测试标准，以确保结果的准确性和可靠性。
微生物限度方法学验证方案
微生物限度检测方法学验证方案文件编号：P-目录1.目的 ................................................................................................................................................... 错误！未定义书签。
2.范围 ................................................................................................................................................... 错误！未定义书签。
3.责任者及职责 ................................................................................................................................... 错误！未定义书签。
4.验证简介 ........................................................................................................................................... 错误！未定义书签。
5．验证过程 ........................................................................................................................................... 错误！未定义书签。
6．结果判断 ........................................................................................................................................... 错误！未定义书签。
无菌、微生物限度检查及方法验证
01
02
03
直接接种法
将样品接种在培养基上， 观察是否有微生物生长。
薄膜过滤法
将样品通过薄膜过滤，收 集滤膜上的微生物，再进 行培养。
离心沉淀法
将样品离心，收集沉淀物 中的微生物，再进行培养 。
无菌检查的注意事项
确保环境洁净
无菌检查需要在洁净的环境中进行，以避免 外界微生物的污染。
避免样品中防腐剂的影响
方法验证
方法验证的定义与目的
定义
方法验证是对检测方法的可靠性、准确性和可重复性的评估过程，以确保该方 法能够满足预期的检测要求。
目的
方法验证的目的是确保所采用的无菌、微生物限度检查方法具有足够的灵敏度 、特异性、重现性和可操作性，以保证检测结果的准确性和可靠性。
方法验证的流程
准备验证计划
制定详细的验证计划，包括验 证实验的设计、实验步骤、数 据收集和分析等内容。
进出口检验
进出口药品需要进行严格的微生物限度检查，以确保药品符合进口 国或地区的质量标准，保障公众健康。
方法验证在药品质量控制中的应用
验证无菌、微生物限度检查方法的可靠性
通过方法验证可以确保无菌、微生物限度检查方法的准确性和可靠性，提高药品质量控制 水平。
评估检测方法的性能指标
方法验证过程中需要对检测方法的性能指标进行评估，如灵敏度、特异性、重现性等，以 确保检测结果的准确性和可靠性。
如果样品中含有防腐剂，可能会抑制微生物 的生长，因此需要进行相应的处理。
正确选择培养基
根据待测样品的特性，选择适合的培养基， 以确保微生物能够正常生长。
定期进行方法验证
无菌检查方法需要定期进行验证，以确保其 可靠性。
0义与目的
中国药典无菌、微生物限度与细菌内毒素检查方法学验证内容详解
国家药典委员会
中国药品生物制品检定所
二00五年十月十一日
● 验证的目的: 验证所采用的方法和条件是否适合 于供试品的无菌检查。 即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌 活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。 ● 验证的意义：保证检验结果的准确、可靠及检 验方法的完整性。
二、无菌检查验证的关键点
中检所和药典会多次召开会议肯定工作的成绩、 研讨存在的问题，希望各级领导能给予高度重 视，从各方面支持这项工作长期持续发展。 实际工作中，药品生产、研发企业和各级药检 所在工作中都存在很多困难和问题。
关于执行《中国药典》2005年版微生物限度 检查法和无菌检查法有关问题的说明
国药典发[2005]98号
验证的目的是为了确认试验中供试品应选择药 典中所收载的何种供试液制备方法、何种测定
方法及确定的检测系统是否适用于该供 试品的检验，即只有通过方法验证，才 能确定供试品的检验条件和方法，保证 “微生物限度检查”或“无菌检查”方法的 科学性和检验结果的准确性。
2．不同企业生产的相同品种，特别是中 成药，因原料来源、工艺、辅料的不同， 药品可能表现出不同的抑菌特性；同一个 企业生产的相同品种，因原料来源不同、 工艺改变或不同实验室等原因，也可能导 致检测结果的差异。因此，不同企业生产 的相同品种进行“微生物限度检查”或“无菌 检查”时，其具体试验方法如冲洗量等不 能简单照搬，需通过验证试验核实该试验 方法和检测系统是否适宜。
生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64 941]
白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98 001]
黑曲霉 (Asperglllus niger) [CMCC(F) 98 003]
微生物限度方法学验证
微生物限度方法学验证微生物限度方法学验证是指通过一系列的实验和分析，确定某一产品或样品中所含微生物的数量和种类。
它是一种质量控制的重要手段，用于评估产品的微生物污染情况，确保产品符合安全要求。
微生物限度方法学验证通常包括以下几个步骤：1. 确定样品的限度：首先，需要确定限度的范围。
在国家标准和相关规范中，通常会对不同产品的微生物限度进行规定，根据产品的特性和用途，设定了不同的限度要求。
因此，在进行验证之前，需要先明确所要验证的产品的限度。
2. 提取样品：根据所要验证的产品特性，选择适当的方法提取样品。
提取样品的目的是将样品中的微生物完全释放出来，以便后续的实验分析。
3. 预培养或净化：在某些情况下，样品中的微生物数量非常少，无法直接进行分析。
此时，需要进行预培养或净化操作，增加微生物数量或减少其他杂质的干扰。
预培养可以使用适当的培养基，为微生物提供生长所需的营养物质和条件。
净化操作可以通过滤膜、离心等方法，将大部分的杂质去除。
4. 微生物分离和鉴定：将样品进行稀释处理，并分别均匀涂布在适当的培养基上。
在一定的时间和温度条件下，培养基上会出现不同形状和颜色的菌落。
通过观察菌落的特征、形态学和生理学测试，可以大致判断出菌落所属的微生物种类。
5. 统计分析：通过对微生物菌落进行计数，并根据所设定的限度要求进行统计分析。
常用的统计方法包括平板计数法、薄膜过滤法和浸入法等。
统计分析的结果可以得知样品中微生物的数量和种类，进而判断样品是否符合限度要求。
6. 结果判定：根据统计分析的结果，结合所设定的限度要求，判断样品是否合格。
如果样品中的微生物数量和种类在限度范围内，并且符合相关标准要求，那么样品可以被认为是合格的。
微生物限度方法学验证具有一定的复杂性和技术难度，需要操作人员具备一定的实验室技术和知识。
同时，验证过程中要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可靠性。
此外，验证结果需要及时记录和整理，以便对产品质量的稳定性进行评估和改进。
5种医院制剂微生物限度检查法的方法学验证
中国药业 !"#$% &"%’(%)*+,#)%-.
・!"・
药物鉴定
2 批号为 !""+"/,!4 !""+"/,04 !""+"/,1 3 ， 一方散 2 批号为 !""+"/!14 风湿散 2 批号为 !""+"/,*4 !""+"/!,4 !""+"/!/3， !""+"/!)4 !""+"//" 3， 外敷一号液 2 批号为 !""+"/"!4 !""+"/,*4 !""+"//" 3 ， 均为广西玉 林市骨科医院制剂。 培养基与稀释剂： 培养基包括营养琼脂培养基、 玫瑰红钠琼脂 培养基、 营养肉汤培养基、 硫乙醇酸盐流体培养基、 胆盐乳糖培养 （.5） 、 改良马丁培养基、 改良马丁琼脂培养基、 甘露醇氯化钠琼 基 脂培养基、 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基。 稀释剂为 67 8 +9 " 的 无菌氯化钠 : 蛋白胨缓冲液、 "9 *’ 无菌氯化钠溶液等。 仪器： 霉菌培养箱。 ;7< : !-" 型生化培养箱， ! !" # 方法与结果 菌液制备 大肠埃希菌、 枯 取 /- = 下培养 ,) > !0 ? 的金黄色葡萄球菌、 草芽孢杆菌、 铜绿假单胞菌的营养肉汤培养物， 用 "9 *’ 无菌氯化 钠溶液制备成每 , @5 含菌数为 -" > ,"" #$% 的菌悬液， 备用； 取 !+ = 下培养 !0 > 0) ? 的白色念珠菌改良马丁培养基培养物， 用 "9 *’ 无菌氯化钠溶液制备成每 , @5 含菌数为 -" > ,"" #$% 的菌悬液， 备用； 取 !+ = 下培养 - > + A 的黑曲霉改良马丁琼脂培养基斜面培 养物， 用 "9 *’ 的无菌氯化钠溶液 - @5 洗下霉菌孢子， 吸取孢子悬 液， 置无菌试管内， 用 "9 *’ 无菌氯化钠溶液制备成每 , @5 含孢子 备用。 数为 -" > ,"" #$% 的孢子悬液， !" ! 供试品溶液制备 !" & 取跌打散、 十味散、 一方散、 风湿散各 ," B， 加 67 为 +9 " 的无 菌氯化钠蛋白胨水缓冲液至 ,"" @5， 混匀即得 , C ," 的溶液， 作为 供试品溶液。 对于外敷一号液， 则取原液作为供试品溶液。 !" $ 回收率预试验 为确定细菌、 霉菌和酵母菌菌落数的测定方法， 选用敏感菌 株金黄色葡萄球菌、 白色念珠菌， 分别用常规法、 培养基稀释法 （"9 - @5 & 皿 ） 对供试品进行预试验。 常规法： 取平皿， 分别注入供试品溶液和菌悬液各 , @5， 每株 菌平行做 ! 个皿， 再加入相应的培养基， 依法培养， 进行菌落计数。 （"9 - @5 & 皿） 培养基稀释法 ： 取平皿， 分别注入供试品溶液 "9 - @5 和菌悬液 , @5， 每株菌平行做 ! 个皿， 再加入相应的培养基， 依法 培养， 进行菌落计数。 结果： 见表 , 。 可见， 跌打散、 十味散、 一方散、 风湿散采用常规 法检查， 金黄色葡萄球菌及白色念珠菌回收率均大于 +"’ ， 达到 《 中国药典 》 要求， 予以采用； 外敷一号液采用常规法检查， 金黄色 葡萄球菌回收率均小于 +"’ ， 白色念珠菌回收率均大于 +"’ ， 因 此霉菌及酵母菌检查可采用常规法， 而细菌检查须采用培养基稀 （"9 - @5 & 皿 ） 进一步预试。 预试结果显示， 金黄色葡萄球菌回 释法 《中国药典 》 收率为 ),’ ， 达到了 要求， 予以采用。
药品微生物限度检查方法验证步骤及示教
药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。
细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。
特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。
2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。
（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。
（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。
6. 写出验证资料。
示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。
2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。
霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。
2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。
微生物限度方法学验证完整版
微生物限度方法学验证 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。
二、菌种、培养基及稀释液表2培养基表3对照用培养基表4试剂稀释液：（1）缓冲液取L磷酸二氢钾溶液250ml,加L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。
（2）%无菌氯化钠溶液取氯化钠，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。
（3）％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80 ，用％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。
（4）靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。
三、菌液的制备1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。
上述培养物用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。
2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。
用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu 的菌悬液。
微生物限度检查方法学验证实验
《中国药典》 2005年版微生物限度检查法的方法验证试验目录一、微生物限度检查的意义二、微生物限度检查的范围三、验证的目的四、验证的类型五、验证的过程一、微生物限度检查的意义药品是治病防病，关系患者生命健康的特殊商品，必须保证其质量,用药的安全与有效。
微生物污染药品引起的药源性疾病屡见不鲜，在国内外均有报道。
为保证药品质量，必须对微生物污染进行必要的控制和检验。
其意义在于(1)保证药品质量已有许多实例表明，药品污染微生物不仅危机病人用药安全，而且也直接影响药品的有效性，所以药品卫生质量是药品质量不可分割的部分。
(2) 反映药品生产工艺的科学性，合理性及质量管理水平，通过检验，凡工艺条件，生产管理水平，生产人员的素质差，不注意文明生产的单位和企业，其生产的药品，染菌必然严重，不合格率无疑就高。
微生物限度的检验是提供药品卫生质量的重要依据，因而在保证销售与使用过程中药品的有效性和安全性，是促进与提高生产单位全面质量管理水平与提高药品质量的重要措施。
二、微生物限度检查的范围1．根据药品使用要求，把药品化为两大类:(1) 规定灭菌药品:包括注射剂和输液剂，及用于体腔，严重烧伤,溃疡,出血用药等制剂。
(2) 非规定灭菌药品:包括常用口服制剂与一般外用制剂。
对这一部分制剂一般不要求绝对无菌，允许一定限量的微生物存在，但同时规定不得有可疑致病的细菌存在。
由于致病菌的范围很广，各国药典都规定了几个常见的致病菌或指示菌作为控制菌。
2．在非灭菌的各种制剂中，对每克或每毫升的药品按剂型或品种不同规定(1)染菌量检查:包括细菌数，霉菌数及酵母菌数测定，以检查这几类微生物对药品的污染程度。
(2) 控制菌检查:包括大肠埃希菌，大肠菌群，沙门菌，金黄色葡萄球菌及铜绿假单孢菌，生孢羧菌。
3．药品微生物限度检验中的困难，最根本的原因在于检验对象本身的特殊性。
(1) 不确定性:药品受外来微生物的污染，这种污染是可有可无;在有中又可多可少;其种类可以多样.污染的情况依生产,设备,原材料,管理,剂型等等条件而定,非药品本身所固有.所以微生物限度检验的对象是不确定的。
常见的微生物检测方法
常见的微生物检测方法微生物检测是生物科技领域中非常重要的一个环节，广泛应用于食品、药品、环境等领域。
随着科技的发展，微生物检测的方法也在不断进步，从最初的定性检测到现在的高通量、高精度检测，为各个行业提供了强有力的支持。
下面，我们将介绍几种常见的微生物检测方法。
1、显微镜直接观察法显微镜直接观察法是一种通过显微镜直接观察样本中微生物形态和数量的方法。
该方法操作简单，但需要专业的显微镜操作技能。
显微镜直接观察法可用于食品、药品、化妆品等领域的微生物检测。
2、培养法培养法是一种将样本接种到培养基上，通过培养基提供营养物质和适宜的生长环境，使微生物生长繁殖的方法。
培养法可对样本中的微生物进行计数和鉴定，是一种广泛应用于食品、药品、环境等领域的方法。
3、免疫学方法免疫学方法是利用抗原-抗体反应的特异性，对样本中的微生物进行检测和鉴定的一种方法。
免疫学方法具有快速、灵敏度高、特异性强的特点，但可能会因为交叉反应而出现假阳性结果。
免疫学方法广泛应用于食品、药品、环境等领域。
4、分子生物学方法分子生物学方法是一种利用DNA或RNA的特异性序列进行检测和鉴定微生物的方法。
该方法具有高灵敏度、高特异性、高精度等特点，可对微生物进行亚型分析，适用于食品、药品、环境等领域的微生物检测。
5、质谱技术质谱技术是一种利用离子源将微生物的蛋白质或代谢物电离，然后通过质量分析器将离子按质量/电荷比分离，由离子检测器进行检测的方法。
质谱技术具有高灵敏度、高分辨率和高重现性的特点，可用于食品、药品等领域的微生物检测。
总结：微生物检测是各个领域中非常重要的一个环节，不同的检测方法具有不同的特点和应用范围。
在实际应用中，应根据具体的情况选择合适的检测方法，以保证检测结果的准确性和可靠性。
随着科技的不断进步，相信未来还会有更多新的微生物检测方法出现，为各个领域的发展提供更加强有力的支持。
微生物快速检测方法在食品工业中，微生物的快速检测对于保障食品安全和防止疾病传播至关重要。
2022版药典微生物限度微生物无菌方法学验证流程
2022版药典微生物限度微生物无菌方法学验证流程1.：提交单位购买申请菌种的购买：需要1.5个月单位介绍信证明工作用途等文件，并向中检院网站提交申请，接到申请后一个月后中检院会把有的菌种邮寄到使用单位，中检院菌种经常缺货并不是很齐全，不能一次买齐所需要的8种菌一次性买齐，2.每种从菌复活、分离、纯化复壮：共需要30天药典规定进行药品检验所需8种标准阳性菌，购买中检院冻干菌粉后进行复活与保藏1大肠埃希菌2金黄色葡萄球菌3枯草芽孢杆菌4生孢梭菌5铜绿假单胞菌6沙门菌（细菌每种冻干菌粉复活到分离纯化保藏各需要3-4天时间）7白色念珠菌8黑曲霉菌（霉菌酵母菌冻干菌粉从复活到分离纯化制备孢子菌悬液需要至少7天时间）3.培养基适用性/灵敏度验证：需要60-80天实验中使用的培养基需要进行与中检院提供的标准培养基进行培养基适用性验证每种培养基不同批号之间也需要进行验证之后方可以进行微生物检验用药检室现有培养基种类20余种，每种培养基验证需要3-4天，完成所有培养基适用性验证需要60-80天。
恩替卡韦分散片微生物限度方法学适用性验证：1.回收率验证：回收率验证实验共需要26天（若回收率达不到药典规定需要重新选用另一种方法进行验证）五种实验菌分别验证1金黄色葡萄球菌2铜绿假单胞菌3枯草芽孢杆菌4白色念珠菌5黑曲霉菌五种阳性菌的回收率验证需使标准阳性菌回收率在阳性对照组计数达到50％-200％之间假设验证一次成功3种细菌回收率各需要4天时间，2霉菌酵母菌各需要7天时间2.控制菌适用性验证：共需要20天大肠埃希菌控制菌方法：需要5天时间其他制剂含药材原粉的中药制剂需要检查沙门菌、耐胆盐革兰式阴性菌各需要7天时间共1周实验室消毒实验用具灭菌，实验细菌培养物灭活处理，实验用具洗涮等方法学验证一次顺利完成共需要46天，验证方法过程需要重复一遍作为方法学适用性确认复方茵陈注射液无菌方法学适用性验证：1.方法适用性验证：验证实验共需要30天（若回收率失败或达不到药典规定回收率需要重新选用方法进行验证）五种实验菌分别验证1金黄色葡萄球菌2大肠埃希菌菌3枯草芽孢杆菌4生孢梭菌5白色念珠菌6黑曲霉菌6种实验组阳性菌需与对照管组进行对照,含供试品的实验菌均生长良好则说明方法可行假设验证一次成功每种菌分别按规定温度培养，培养时间不得超过5天实验室消毒实验用具灭菌，实验细菌培养物灭活处理，实验用具洗涮等，方法学验证一次顺利完成共需要30余天，验证方法过程需要重复一遍作为方法学适用性确认。
微生物限度检查方法学验证实验
生物安全柜（Biological safety cabinets， BSCs）是为操作原代培养物、菌毒株以及诊 断性标本等具有感染性的实验材料时，用来 保护操作者本人、实验室环境以及实验材料， 使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的 感染性气溶胶和溅出物而设计的。
生物安全柜正广泛用于微生物和生物工程及 其他对操作环境有苛刻要求的场所，目前正 在为医疗卫生、制药、科学研究领域提供无 菌、无尘的可移动的工作环境。
用于微生物限度验证的菌种
菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准 菌株(或该药品中常见的污染菌)
菌种的要求：不得超过5代,采用适宜的方法保存。
CMCC (China Medical Culture Collection Center) 中国医学微生物菌种保藏管理中心 B- Bacteria(细菌) F-Fungi(真菌)
(1) 不确定性:药品受外来微生物的污染,这种 污染是可有可无;在有中又可多可少;其种类可 以多样.污染的情况依生产,设备,原材料,管理, 剂型等等条件而定,非药品本身所固有.所以微 生物限度检验的对象是不确定的.药品所规定 的项目,除无菌检查,热原具有上述性质,其他 项均无此特征.这一点往往被忽视.污染对药品 而言是一个意外事件.污染批号中的不合格品 是一个随机变量.
结果时 。 定期的验证。
同一产品不同批次、不同企业生产的同一产品。
当建立药品的微生物限度检查方法时，应进 行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证， 以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、 霉菌及酵母菌数的测定。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵 母菌计数所规定的方法及下列要求进行，对 各试验菌的回收率逐一进行验证。
产单位全面质量管理水平与提高药品质量的 重要措施.
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WOIRD格式微生物限度检测方法学验证方案&D.|[0w#j!Q+{/w7^#E:k'p(t9J!T3W#O&W!d8S*\7k!y$k!C1A|*Q4X*I)[5@8g%_8H0}!X:c5V4s:w%J'K)}0Q-W:H1f9N$[4V7L7}文件编号：P-AMV002-1101"r%|2C7e-IY#s%f1v8U8D4M(n(q*a6o3e2f0z/_9`'j5[+y9c&C)D!O*O\%X:d,r0C(o3D"A2c,\6C'j+^(L1L-n3{/J;K执行前批准签字页2N+}8E8x%C!M1b2~1o'}方案起草姓名公司/岗位签字日期:c"s'R:u"l1q#l'o)}8h (@.}&N#s;[2E)H&U!R1G5Q-h5N)|+I2p方案审核姓名公司/岗位签字日期+N:w0{4j"`"}-x4r(Z#P;a3Z/|0U1\2P&v6j*`2h方案批准姓名公司/岗位签字日期$p1h:X#G"u.})B;d.V7R!@7t5v&D9a0l!i,W4p4o6f+Z4V7s*X3F8A7B3q"`1g6T9y;U,k+k9b目录,t,n2w&_4mT1.目的42.范围4,V*l"_%Q5f,K#k3.责任者及职责43^X*Q$x(E3g:B)E4.验证简介45．验证过程76．结果判断76c9[/O1U&R7．结论和建议7%{)x.{$f%I8．异常情况报告7*E.Q.`;?!k#q9．再验证710．附件8/O0@.@8O!`:c5c1n!k1L)N.^2w+d3Y%V1.目的$M;j2K6p'|:y3F'K+K按照中国药典2010版（第一部），采用平皿法对龙加通络胶囊（成品）进行微生物限度检查，本方案是对此方法进行验证。
;x'?8a'^6C5@!^2.范围&J+b'o7r7m6Z5t龙加通络胶囊成品8A,S/U]3h1J3.责任者及职责部门职责QC起草并审核验证方案进行验证试验的具体操作完成验证记录中相关操作记录的填写根据验证结果起草和审核验证报告6q5D5e1|(h,f3CQA审核并批准验证方案和验证报告(S&h:^!z#k,K:B1Q!j)?&^监督验证方案的实施7?4y(`6P(r4.验证简介4.1定义CFU：菌落数供试液3].N/E/p"O8}6C7R4d取样品10g，取pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液稀释至1g/ml（1:10）。
供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
'S#h$n1U:X's/J)e"C 试验组取规定量供试液采用平皿法进行细菌、霉菌及酵母菌计数。
菌液组测定所加的试验菌数。
%I8Y$G*Q4f;u.C*|%l+N样品组样品溶液菌悬液（50-100CFU）稀释液平均菌落数(CFU/皿)供试液对照组+-+C供试液对照组3G#_,O-A'P#P;H试验组+++C试验组菌液组-+-C菌液组'z5n%U:j2A(~"}N4.2菌悬液4.2.1菌种及来源(y)W#A2Q$p.I8y4M4m"z.|#p本次验证涉及到金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、枯草芽胞杆菌、白色念珠菌、黑曲霉，其详细情况如下：培养基名称名称及代号编号批号代次有效期至来源营养琼脂;{#X!e5G$K.I培养基金黄色葡萄球菌5A"m%R/H!`4[+s3@CMCC(B)26003注释1注释2中国生物制品检定所"x7i8@#~+k1j"L2c大肠埃希氏杆菌!C+G)S,c-NH+pCMCC(B)44102"`;X#m%_8R,`枯草芽胞杆菌5s,C2Q%{Sy.{#QCMCC(B)63501;A1n#H6t"?.X&O6{3J玫瑰红钠5\$K6K+D9["~3G)g$a#s)t1r7O琼脂培养基白色念珠菌6|!x+?&N*Rs9i;k%aCMCC(F)98001,G]:s"h0A!p(D黑曲霉CMCC(F)98003+Rf(L/N:h5[+A8|2J备注$D'_2t'\#O检查人：复核人：检查日期：4.2.2菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30~35℃培养18~24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，20~25℃培养24~48h。
上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50~100CFU的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28℃培养5~7天，加入3~5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100CFU的孢子溶液。
4.3培养基及稀释液4V)Z!~!g%z%U0l4.3.1培养基和稀释液的名称:U*_*Z6d5M9x0z:E6f培养基：营养琼脂培养基（121℃15分钟）、玫瑰红钠琼脂培养基（121℃15分钟）稀释液：pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液（121℃30分钟）4.3.2培养基灵敏度复核!V&g5[D)u;W${9B培养基灵敏度复核，参见《培养基的灵敏度检查操作规程》，结果见附件1。
-J7d9o+a)D9YC8 C4.4供试液的制备4.4.1样品名称及数量9v:m&Z7S.F&P$B.}*?(X+e:k)|-j:[样品名称批号取样量#e6u&X*|+M$a"n龙加通络胶囊（成品）10g0o9m;o'^/a1v'q10g"R'S!H.Q6y.{6_1q10g4.4.2样品预处理方法取样品10g，取pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液稀释至1g/ml（1:10）。
'k8i3^4Y9e&t.^4.5实验用品2i4r(D"\+t-@实验设备名称型号规格厂家有效期t0a,y:`/z$r;E(X低温培养箱注释3(y(O*J!{9S6r'S.y9h生化培养箱注释3)b5m4p#O7T8X洁净工作台——+m"Y#b3N#v"B-C0u6?生物安全柜——,P.@+B#x!l4_"h#h*Z7h水浴锅——0g7z/~8m.d-c备注检查人：复核人：检查日期：(Y,b;E.`8|实验中使用培养基2y0O,F3B5e$p名称规格厂家8g$t#a0k:z(q5U8I营养琼脂培养基,o)@8`$h'n1X%O玫瑰红钠琼脂培养基8Q;h7z+f7D硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基营养肉汤培养基改良马丁琼脂培养基4.6参考文件1}"f$Z+uz.]+f中国药典2010版第一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法《验证管理规程》8Z)P!l;L!a+{《超标数据调查及处理管理规程》《异常情况管理规程》#W)\"V:r$m)k)D《取样管理规程》《培养基管理规程》"C9\4B6[/_.t-q-t1h《培养基的灵敏度检查操作规程》*K6X)H*f'm#R&T.Q5X4[/sb!w《菌种复苏、传代及菌悬液制备操作规程》8[7m#I9_9h5[《微生物限度检查操作规程》5．验证过程5.1试验次数：验证试验应进行3次独立平行实验4k$R,F!n0c5_&S1~(c5.2试验器具准备0p"t$o9~0V0b+T8k试验前，将先前已准备的适量稀释液和培养基灵敏度复核检查合格的培养基、检品和无菌的玻璃平皿（Φ90mm）一同放入无菌室的传递厨内，打开送风和灭菌按钮。
;e4O1j1x*Z0x用当月使用的消毒剂对无菌室进行消毒，并擦拭超净台，打开超净工作台风机及紫外灯灭菌1小时以上。
5T'L"l0c8m@5.3测定4M:~1x$m!J1a7@,S:|*k'B5.3.1按照无菌室更衣程序更衣，进入无菌室。
-^:Y"p2\5t1v%W8K5.3.2用70%酒精棉球擦拭工作台面与待测品表面。
5.3.3在无菌环境下，取4.2.2项下配制的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml，分别注入无菌平皿中，立即将保温在水浴锅中（45℃）无菌营养琼脂培养基倾倒入内，每个平皿约20ml，每株试验菌平行制备2个平皿。
待培养基混匀、凝固后准备培养计数；取4.2.2项下配制的白色念珠菌、黑曲霉各1ml，分别注入无菌平皿中，立即倾注保温在水浴锅中（45℃）无菌玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，待培养基混匀、凝固后准备培养计数；以上作为菌液组。
5.3.4无菌操作取4.4.2制备的预处理后的样品，加入至4个无菌平皿中，每个加入1.0ml。
将保温在水浴锅中（45℃）无菌营养琼脂培养基和无菌玫瑰红钠琼脂培养基培养基分别倒入2个无菌平皿中，每个约20ml。
作为供试液对照组。
5.3.5无菌操作取4.4.2制备的预处理后样品，加入至10个无菌平皿中，每个加入1.0ml，同时将4.2.2项下配制的5种菌液每种加入到2个已加入样品的平皿中，每个平皿加入1.0ml。
将保温在水浴锅中（45℃）无菌营养琼脂培养基和无菌玫瑰红钠琼脂培养基培养基按4.2.1项下规定，加入到平皿中，每个约20ml。
作为对照组。
5.3.9将5.3.3-5.3.5制得的平皿按下表进行培养，结果记录在附件2上。
培养基培养温度培养时间菌种名称营养琼脂培养基30-35℃3天金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌玫瑰红钠琼脂培养基23-28℃5天白色念珠菌、黑曲霉"W*?+h5i6E6．结果判断;`+Z1P$`"b2Z:O在三次独立的平行试验中，试验组的菌落数回收率K(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不低于70%。
若三次独立试验中任何一次K低于70%，应改进试验方法以消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
+l/ |(M.Z-c&U/W试验组的菌落数回收率K=×100%7．结论和建议此项中将根据实际测试的结果给出结论，有异议的将给出建议。
8．异常情况报告对验证中发现的任何异常/不合格情况应按照《异常情况管理规程》执行。