生物分析检测技术详解演示文稿

实时荧光定量PCR：其反应体系中，引入了 一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行， PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等 比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光 强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变 化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩 增曲线。
2.荧光扩增曲线
➢荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信 号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期 。 •荧光背景信号阶段：扩增的荧光信号被荧光 背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。 •平台期：扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关 系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起 始DNA拷贝数。 •只有在荧光信号指数扩增阶段：PCR产物量 的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我 们可以选择在这个阶段进行定量分析。
三、 实时荧光定量PCR技术的应Fra Baidu bibliotek介绍 1. 医疗方面 2. 研究方面 3. 其它方面
四、荧光定量PCR 实验室所需仪器设备清单
五、实时定量PCR 及应用于植物分子生物学的 研究
一、实时荧光定量PCR仪
▪ 热循环仪（PCR仪） ▪ 荧光检测系统 ▪ 计算机及软件系统
不产热的光源--发光二极管（LED）
➢ 利用已知起始拷贝数的 标准品可作出标准曲线， 其中横坐标代表CT值， 纵坐标代表起始拷贝数 的对数（如图3所示）。
➢ 因些只要获得未知样品 的CT值，即可从标准曲 线上计算出该样品的起 始拷贝数。
➢ This technology is very sensitive in that it is able to detect single copies of genes and requires very little starting material across a wide spectrum of conditions. ➢ The system monitors PCR at each cycle of a reaction, and estimates the cycle when the reaction reaches log phase increments (when the most useful quantitative information about the sample is available) ➢ Quantitation can be "relative" to an internal standard such as a housekeeping gene, or "absolute" when compared to a standard curve generated from known concentrations.
生物分析检测技术详解演示文 稿
优选生物分析检测技术
6. 何为实时？ 7. SYBR Green I 的工作原理 8. Molecular Beacons（发夹型杂交探针）的 工作原理 9. TaqMan（水解型杂交探针）的工作原理 10. 多色多通道技术应用——基因表达分析 11. 内标技术介绍
TaqMan Probes
精确性: ±0.3°C
激发光波长： 450-495nm
发射光波长: 515-545nm
升降温速率: 最高
3°C/秒.
灵敏度: <5nM的荧光素
温度梯度: 有
检测范围: 100 - 108 拷贝
容量: 96样品
反应管: 0.2mL反应管& 96 孔板
操作系统: Windows NT
灵敏度高的检测器--光电倍增管（PMT）
优点： 不产热---无散热装置，全封闭 无机械转动装置---抗震性强 无需经常校准，耐用 灵敏度高 线性范围广
Opticon 实时荧光定量 PCR仪
荧光检测
热循环仪
光色: 蓝色光
均一性: ±0.4°C
染料: FAM, SYBR Green I,
Molecular beacons
3. 荧光阈值和CT值
➢ 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一 个值 ，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段 任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省 设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的 10倍。
• 荧光阈值线的位置一般事实上位于减去本底 的位置上，这时的荧光信号超过了荧光背景 信号并且开始增加。
6. 何为实时？
试剂方面： 如何做到相对荧光强度反应的是PCR 产物的相对量；如何做到相对荧光强度反应的是特 定PCR产物的相对量； 仪器方面： 如何测定相对荧光强度
二、实时荧光定量PCR的技术原理
1.定量与常规的差别
➢ 常规PCR技术：对PCR扩增反 应的终产物进行定量及定性分析
➢ 定量PCR技术：对PCR扩增反 应中每一个循环的产物进行定量 及定性分析
SYBR Green I 定量原理
确定初始模板的浓度: 初始DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环 数越少 Log浓度与循环数呈线性关系：根据样品 扩增达到域值的循环数就可计算出样品中 所含的模板量
➢ 对某一样品的C（t）值就定义为荧光量与荧 光阈值线交叉时的循环数。即每个反应管内 的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环 数被称为CT值（threshold value）。
➢ 定量荧光扩增曲线是荧光量与循环数的图表。
4. 熔解曲线
➢ 在PCR结束后，我们可以根据变性过程中的荧光 值变化绘出每个样品的熔解曲线。
• 绘制熔解曲线时，Real-Time PCR 仪连续监测每 个样品在从双链完全配对到完全解链的升温过程 中荧光值的变化过程。
• 不同的扩增产物因为其长度和GC含量不同而在不 一样的温度下解链，当产物解链时，SYBR GreenⅠ的荧光值将降低并被仪器监测到。由此绘 制出荧光强度随温度变化的负一次倒数图。
• 荧光强度变化的拐点（熔点，Tm）即为熔解峰值。
➢ 熔解曲线是扩增反应的质控途径，当图中没有出
现杂峰，也未出现主峰的异常增宽：表明实验中 未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。
5. 标准曲线
➢ CT值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的 CT值与该模板的起始拷 贝数的对数存在线性关 系：起始拷贝数越多， CT值越小。