AgNOR胶银染色法及体会

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实验五染色体Ag-染色法

实验五染色体Ag-染色法
❖ 1、实验原理 ❖ 应用银染色技术，哺乳动物的核仁组织者
(NOR)特异性染为黑色， ❖ 这种银染色阳性的NOR称为Ag-NOR ❖ 即18S+28S核糖体基因的分布区，
图15-1
❖ 银染色的是与rDNA转录有关的一种酸性蛋白。因此，银染的是有转录活性的NOR。
❖ 一般NOR位于次缢痕的位置。
❖ (3)玻片标本细胞面朝上平放其上，加4滴50 %AgNO3溶液和2滴明胶显影液，
复以盖片(或擦镜纸)直到玻片标本呈金褐色为快速漂洗，晾干。
❖ (5)用Giemsa染色液(磷酸缓冲液：Giemsa原液=10：1)染色8～10 min，用自来水冲洗。
2、实验材料
❖ 水浴锅、试剂瓶、镊子、滤纸、擦镜纸等 ❖ 硝酸银溶液、明胶显影液、Giemsa原液
3、实验方法
❖ (1)按常规方法制备染色体标本片（见实验一）
❖ (2)在培养皿底部放一用蒸馏水润湿的滤纸，上放2根玻棒(或火柴棒)，置水浴锅保温至 56～60℃(一般采用60℃)。
此过程可不放在水浴锅内，直接将常规染色体标本片放在56～60℃的电热板上亦可。
❖ (6)蒸馏水冲洗后，空气干燥，镜检。
5、实验结果与分析讨论
❖ 仔细观察．Ag-NOR分布， ❖ 并计数10个细胞分裂相Ag-NOR数目

AgNOR检测在宫颈癌鉴别诊断中的应用

ＡｇＮＯＲ检测在宫颈癌鉴别诊断中的应用标签：AgNOR检测；宫颈癌；诊断目前，AgNOR检测被用于良、恶性病变鉴别诊断。

作者应用AgNOR染色对80例资料齐全的宫颈刮片进行形态定量检测，对其临床应用价值进行了初步探讨。

1 资料与方法1.1一般资料本组80例宫颈刮片，均来自本院妇科。

其中细胞学分级Ⅰ级30例，Ⅱ级22例，Ⅲ级17例，Ⅳ级8例，Ⅴ级3例。

所有病例行AgNOR染色，并做病理检查对照。

1.2方法1.2.1 AgNOR染色常规固定后，用去离子水充分洗涤；2%明胶（用1%蚁酸配制），1份+50%硝酸银2份，混合滴染于刮片，于室温下避光40～60 min；然后用去离子水清洗，甲基绿-伊红套染；水洗后常规脱水，透明，封固。

1.2.2 AgNOR形态定量计数方法每例镜下随机检测100～130个组织细胞，观察核内AgNOR颗粒形态、分布特点、计数，并进行统计学处理。

2 结果2.1细胞学分级与病理检查结果对照（表1）2.2 细胞核内AgNOR颗粒均值与分布染色后AgNOR颗粒在细胞核内呈棕黑色，细胞核呈淡绿色，胞浆为浅粉色。

Ⅰ级：AgNOR颗粒较细小，形态规则，大小一致，圆形或卵圆形，位于核内中央或略偏，每个核内含1～2个颗粒，占85.1%；含3个以上颗粒，占14.9%；平均每个核内含AgNOR颗粒数为(1.48±0.31)个。

Ⅱ级：AgNOR颗粒略粗大，形态较规则，圆形或椭圆形，界线清楚，每个核内含1～2个颗粒，占82.4%；含3个以上颗粒，占17.6%，平均每个核内含AgNOR颗粒数为(2.02±0.44)个。

Ⅲ级：AgNOR颗粒粗大，形态较接近，常在核偏位，每个核内1～2个颗粒，占74.6%；含3个以上颗粒，占25.4%；平均每个核内含AgNOR颗粒数为(2.26±0.48)个。

Ⅳ级：AgNOR颗粒形态不规则，大小不一，多在核边缘，每个核内含1～2个颗粒，占56.1%；含3个以上颗粒，占43.9%；平均每个核内含AgNOR颗粒数为(4.41±1.18)个。

嗜银蛋白(AgNOR)对针吸脱落细胞癌肿早期诊断研究

军医学院学报，０８６（）３１２０，６：３．
声容易误诊为宫外孕。本组经腹超声诊断的２宫外孕经例
阴道超声诊断为黄体囊肿，经腹腔镜证实。后
ＴＳＡ扫查范围大，于观察盆腔积液，便子宫，附件包块，以及相互关系。Ｔｓ对宫内外孕囊，Ｖ胚芽，心等精细结构胎的显示较好，并且不用憋尿，操作简单，安全无创，可动态监
２０８２）１１．０９．（１：０
［］７伍殷杨，张筱辉．与阴道Ｂ超对异位妊娠的诊断价值比较分腹部
析［］实用医学杂志，０７２（２：５０Ｊ．２０，３２）３４．
［］８曾洪英，马润梅．色多普勒超声在异位妊娠诊断中的应用［］彩Ｊ．
中淋巴结１０例；１甲状腺５８；７９例乳腺６５；组５例软织５８例；膜腔积液３３例。男１８０例，２３９浆２９女１５例。平均年龄４，。正常对照组３０例，１８１４岁０男２
例，１２。平均年龄３．。均经针吸脱落细女７例８２岁胞病理学、理组织学确诊。病，
ｆ稿日期：０９０－５收２０ —１＂２）
文章编号：０７２７２１）２０４２１０ —４８（００１ —２３ —０
嗜银蛋白（ｇＯ对针吸脱落细胞ＡＮＲ）癌肿早期诊断研究
许朝晖王永才张，，蕾赵成艳，
（．１大连医科大学附属一院检验科，宁大连１６２；．辽１０１２大连医科大学附属二院，辽宁大连１６２）１０７

双向电泳凝胶银染操作流程.

2.银染液成分：
(18cm 胶)每块用 500 ml 银染液
成分
(7cm 胶)
(18cm 胶)
(克，毫升,微升) 100 mlⅹ1 500mlⅹ1 500mlⅹ2 500mlⅹ3 500mlⅹ4
AgNO3
0.25 g
1.25 g
2.5g
3.75g
5.0g
1
北京基因组研究所-阳光
纯水
定容
定容
定容
定容
北京基因组研究所-阳光
双向电泳凝胶银染操作流程
目的：检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。
原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，使
银颗粒沉淀在蛋白带上。
一、固定：过夜+10minⅹ3
1.方法：1）.固定 30min 后纯水洗 10minⅹ3。2）.固定过夜后纯水洗 10minⅹ3（推荐）。
1.24g
6.20 g
12.4g
18.6g
24.8g
纯水
定容
定容
定容
定容
定容
总体积
100 ml
500ml
1000 ml
1500 ml
2000 ml
K3Fe(CN)6：铁氰化钾，深红色菱形结晶，比重 1.845，在碱性介质中为强氧化剂； Na2S2O3·5H2O：易溶于水，水溶液呈弱碱性，不溶于乙醇。
Glycine
0.4 g
2g
4g
6g
8g
纯水
定容
定容
定容
定容
定容
总体积
100 ml
500ml
1000 ml
1500 ml
2000 ml
甘氨酸：Glycine，75.07（可以用 EDTA 代替，3.65g 的 EDTA.2H2O 相当于 1g 甘氨酸）六、（补充）：脱色

AgNOR检测在宫颈癌鉴别诊断中的应用

鉴别良、恶性病变的依据。通过对本组结果分析，建议对 Ⅱ级以上官颈刮片做Ａｇ．
２２细胞核内ＡＮＯＲ颗粒均值与分布．ｇ
ＮＲ检测，Ｏ了解核内ｒＡ活动、ＯＲ染色体数目、胞倍ＲＮＮ细体数及细胞增生分化情况等，于早期诊断。利本组甲基绿一红套染，细胞核、伊使胞浆、ＯＲ颗粒呈Ａ
三种颜色，比鲜明，对效果令人满意。并且具有方法简便、快
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
染色后ＡＮｇＯＲ颗粒在细胞核内呈棕黑色，细胞核呈淡绿色，浆为浅粉色。Ｉ级：ｇＲ颗粒较细小，态规则，胞ＡＮＯ形大小一致．圆形或卵圆形，于核内中央或略偏，个核内含位每１２个颗粒，８．％；３个以上颗粒，１．％；均每个～占５１含占４９平核内含ＡｇＯＮＲ颗粒数为（．８０３１。Ⅱ级：ｇＲ颗粒略１￣．１个４ＡＮＯ粗大，态较规则，形圆形或椭圆形，界线清楚，个核内含１每～２个颗粒，８，％；３个以上颗粒，１．％，均每个核占２４含占７６平
布结果．Ⅳ级每个核内含３个以上ＡＮＯｇＲ颗粒的百分数
表１细胞学分级与病理检查结果对照表（）例
２１细胞学分级与病理检查结果对照（１．表）
（３９４．％）和Ｖ级每个核内含３个以上ＡＮＯｇＲ颗粒的百分数

一种改进的植物染色体Ag——NOR染色方法及其应用

的数目
,
定位和行为
进行了说明和讨论
件 4
. . . . 曰. . . .
文摘
一
6
, , ,
一
g
一种改进的植物染色体 A
一N
R染色
方法及其应甩
张赞乎
李愚学
显示染色体上核仁组成区
N
R )
的银染技术即 A g 一 N
。
R技术
,
是继
G i e m
s a
和
O
荧光分带技术之后中已广泛应用
,
。
的改进技术
其主要流程包
5
1%
:
:
2 )
固定
3
,
IN
数酸一一酒精一一冰乙酸 (
,
2
:
3
解离和压片溶液复染
空气千燥片用 5 0 % A
“
g N O
和 1 % 明胶水溶液混合染色
”
。
.
Q 0
亚甲兰水
该银染色技术称之为
、
H A A 一 Ag一 1
压片法制片
所发展的一项最重要的技术
, ,
该技术在人类及哺乳动物染色体研究
,
但在植物界则欠普遍
而国内的研究就更少见
,
其原因之一是用传统的
。
由于有细胞壁和细胞质的千扰
,
银染难以成功或效果不好然而进

银染方法

银染方法1.搪瓷盘中倒入2000ml左右70%乙醇，把胶做好标记卸入乙醇中，摇床上固定15min2.回收乙醇(可重复用3-5次)，蒸馏水洗2遍，每遍2-3min，尽可能把水倒净3.190ml蒸馏水中加入3.6%的NaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml、氨水2ml混匀配成染色液。

倒入染色液，染色30min。

4.倒掉染色液，蒸馏水洗3遍，每遍2-3min，尽可能把水倒净5.200ml蒸馏水中加入1%柠檬酸钠1ml，甲醛100ul混匀配成显色液。

倒入显色液显色至清晰。

6.倒掉显色液，加蒸馏水停显，并洗2-3遍测序板的硅化处理1:每块玻璃板的面都需硅化处理，以防止凝胶与两块玻璃板紧贴并减少电泳完毕后从胶模中取出凝胶时凝胶发生破裂的可能性。

硅化方法为；将拟硅化的玻璃板置于通风橱中，并戴手套操作，在拟硅化板面上加2-3ml 5％二氯二甲基硅烷(二氯二甲基硅烷5％溶于氯仿中)，用纸巾将硅化液涂布均匀，然后用去离子水洗净玻璃板,再用乙醇冲洗后晾干。

如需要从玻璃板上去除原有的硅，可用KOH-甲醇擦拭之。

KOH-甲醇配制为100ml甲醇中加5g片状KOH即可。

测序板的硅化处理2:1.浓度：4%二氯二甲基硅烷2.成分：二氯二甲基硅烷，三氯甲烷4.用途：制备聚丙稀酰胺凝胶时，可用Repel-silane处理小玻板，使凝胶易于剥离。

5.使用方法：测序用玻璃板必须彻底洗净。

先用温水和洗涤剂洗净，用水洗掉洗涤剂,再用去离子水冲洗干净。

最后用乙醇洗板。

1）长玻璃板的处理每次铺胶前均需用亲和硅烷对长玻璃板进行处理。

1、用镜头纸蘸取亲和硅烷溶液少许（1ml左右），涂在长玻璃板上。

要将整块板都涂满、涂匀。

2、4~5分钟后，用95%乙醇洗长玻璃板三次，以去除多余的亲和硅烷。

2）短玻璃板的处理每次铺胶前均需用剥离硅烷对短玻璃板进行硅化处理。

1、处理短玻璃板前先更换手套，以防与亲和硅烷交叉污染。

2、用镜头纸蘸取剥离硅烷溶液适量（1.5ml左右），涂在短玻璃板上。

实验八核仁组织者区(NOR)的银染显示法

在染色体标本上滴加含1%甲酸的 2%明胶水溶液3滴，再加50%硝酸银3滴，混合后盖上盖片，将标本置于60℃恒温台上，处理至液体为棕黄色为止，自来水冲洗，空气干燥，镜检。
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4
实验结果
若染色适中，间期核及染色体为金黄色，
油镜观察，可在某些染色体上看到成对的黑色小点，此即为银染NOR（AgNOR）。
质，参与形成核仁，由于核仁直至前期结束才完
全消散，所以这一部分染色质常常来不及完全收
缩，在中期染色体上，比其它染色质更疏松，因而被淡染，即表现为次缢痕结构。
每个染色体组中，常有多个NOR。例如人的23
对染色体中，有5对端部着丝点染色体短臂的次
缢痕处为NOR。然而，并不是所有的NOR随时
都出于转录之中。当NOR在间期转录时，产生
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5
作业
在油镜下绘制一中期分裂相图，显示Ag- NOR的位置、数目和形态。
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6
一种与转录活动有关的酸性蛋白，此蛋白可保留
至中期并能将染液中的银离子还原为金属银而显
现为黑色。所以银染法可在中期染色体上显示具
有转录活性的NOR数目，而且，染色的深黑程
度，还可以反应出基因的活性高低。
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3
实验方法
银染的具体方法有很多种，如 Ag-AS法,Ag-I法等，我们在此采用快速银染法，具体操作如下：
若整张片子色淡，间期核及染色体都不易
看清，为染色时间不足，在未滴过香柏油的情况下，可重新续染。
若染色时间偏长，则染色体为棕色，此时，
仍可看到黑色的NOR，只是NOR与染色
体间的反差较低。染色严重过度时，整张
片子都布满黑色沉淀，这样的标本一般都

跑胶银染

琼脂糖电泳步骤之超级基础篇一、电泳前准备准备内容作用1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净晾干防止不必要的重复污染，减少外来的污染。

梳子干净有利于梳孔的形成。

2.检查电泳槽，根据情况更换buffer排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。

3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。

4.计算agarose的用量和制胶buffer的用量记录，胶最终越薄越好。

实验记录备查二、制胶步骤注意事项1.称量agarose和bufferBuffer不要用成H2O，称量相对准确2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。

非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。

因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。

保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。

3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一次性倒入。

梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔的体积能点的下所有的样。

用枪头赶掉气泡。

制胶的桌面相对水平。

倒胶时尽量减少气泡的产生。

EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓度为0.5ug/ml。

不宜过低，染色成像不明显；不宜1)银染序列DNA测序系统有什么组分？银染序列DNA测序系统(目录号Q4130)的所有试剂可作100次测序反应，可对10块测序胶作银染。

系统还包括pGEM-3Zf(+)质粒模板和pUC/M13顺向引物作为正对照。

系统所含的组分可在银染序列DNA测序系统技术手册TM023中查阅。

2)银染序列DNA测序系统和染色试剂是分开提供的吗？银染序列DNA测序系统和染色试剂可分开定购。

目录号Q4131所提供的所有试剂可作100次测序反应，并包括正对照模板和引物，目录号Q4132所提供的所有试剂可对10块测序胶作银染。

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验一变性聚丙烯酰胺凝胶电泳配制溶液：1、30% Acrylamide（14.5 g 丙烯酰胺，0.5g 双丙烯酰胺，加水溶解，定容至50 ml，4℃，棕色瓶中储存）2、10% 过硫酸铵（0.5g APS，溶于5ml 去离子水中，4℃可储存数个月）3、10 ×TBE 缓冲液（10.8g Tris,0.744g EDTA,5.5g 硼酸，定容到100ml）4、TEMED5、20-200 DNA marker6、尿素实验步骤：1、配置10%的胶10ml：8M*10ml*60g/mol=4.8g 尿素6.1ml water3.3ml 30% Acrylamide1ml 10 ×TBE0.11ml APS0.01mlTEMED2、立即将胶倒入两块板间并插好梳子，放置，待凝固30min，时间可以适当延长。

3、向电泳槽加入1×TBE，拔出梳子并用注射针筒多次洗涤点样孔，尽可能排除未聚合的丙烯酰胺。

4、将DNA marker 加到点样孔中，以120V（10V/cm）进行电泳直到燃料走到靠近底部的三分之一处，大约需要60-90分钟。

二银染实验银染溶液的配置：实验之前准备4℃水1、固定液（10%醋酸）：20ml冰醋酸，180mlddH2O混匀（通风厨中进行）2、染色液：将0.1g AgNO3溶解于100 ml ddH2O中，使用前加1.5ml37%甲醛溶液，必须储存于避光瓶中，防止接触皮肤（通风厨中进行）3、显影液：将30gNa2CO3溶解于ddH2O中，冷却至4℃，使用前加1.5ml37%甲醛溶液（通风厨中进行），0.1M五水硫代硫酸钠150μl；（0.1M Na2S2O3。

5H2O：将2.48g Na2S2O3。

5H2O溶于100mlddH2O）。

注意事项：1、染色液和显影液要现用现配；2、显影液必须在4℃使用且必须保存在4℃；3、甲醛蒸汽致癌，在通风厨内操作；4、实验室中柔和的背景光线有利于降低背景颜色；5、显色不能在透光的盒子中进行；6、溶液不能直接倒在胶面上，应使盘倾斜后将溶液倒在盘的角上，或者将每种溶液各方一盘，然后将胶从一个盘转到另一个盘；7、溶液的体积必须足够将胶全部浸没；8、显色过程中盘中须轻轻摇动。

银染方法总结

银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有100 多种。

大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。

由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D 凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。

这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法，主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测！如内源性GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究银染操作规程实验原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。

染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。

试剂：乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛实验操作程序：固定：30min或者更长时间100ml 乙醇（40% 乙醇）25ml冰醋酸（10% 冰醋酸）加水到250ml致敏：30min 75ml 乙醇（30% 乙醇）17g乙酸钠或28.2g三水乙酸钠0.5g硫代硫酸钠加水到终体积250ml水洗：3 x 10min银染：20min 0.625g AgNO3、100 ul 37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml水洗：2 x 1 min (注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色)显色：视情况而定6.25 g Na2CO3、50 ul 37% 甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml 终止：10min 3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸加水到终体积250ml保存：1% 冰醋酸，4 ℃注意事项：1．固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。

2．甲醛在使用前加入。

3．最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。

4．显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。

5．银染液和显色液需要预冷。

512例胃镜涂片银染结果观察

512例胃镜涂片银染结果观察摘要】本文应用AgNOR技术对512例患者经胃镜涂片观察，通过细胞内银染颗粒计数，结果显示：胃癌患者AgNOR数目明显高于一般患者，与普通病人结果有显著性差异。

【关键词】胃镜胃癌核仁组成区银染瑞氏染色核仁组成区嗜银蛋白（AgNORs）是位于细胞核内DNA环上与合成核糖体RNA（rRNA）相关。

其形状、大小、数目与细胞的增殖、分化有关。

核仁组成区嗜银染染色结果观察，对恶性肿瘤的诊断价值已有不少报道，我们通过对512例病人胃镜涂片取材所得脱落细胞进行观察，癌症病人与普通病人有显著性差异。

1 资料与方法1.1 临床资料 512例患者通过胃镜涂片经病理确诊，其中慢性炎症、消化性溃疡、静脉曲张及息肉等占489例，胃癌23例，其中男18例，女5例，年龄在38～68岁之间。

另取50例阴性病人作对照实验。

1.2 检测方法染色液的制备甲液：2%的明胶液:取2g明胶溶于1%甲酸水溶液100ml中混匀。

乙液：50%硝酸银水溶液。

将穿刺涂片用丙酮固定5～10分钟后，滴加胶银染色液（2%明胶液与50%硝酸银水溶液按1:2比例混合，现配现用），37℃15min，用去离子水冲洗待干，油镜观察计数。

全部病人均作瑞氏染色，一方面可以帮助我们鉴定癌细胞，另一方面可以帮助我们所数银染细胞为一类细胞。

23例癌症计数20个细胞的银染颗粒，油镜下的AgNORs呈大小、形状不一，清晰的棕黑色或黑色颗粒，位于细胞核内，AgNORs颗粒形态主要有三种类型:核仁内型:银染物质紧密聚集形成圆形实性小体;聚合型:形状、大小不同的数个颗粒较松散地聚集在核仁内;弥散型:数个至数十个形状、大小不同的颗粒散布于细胞核内。

计数100个细胞内各种形状的AgNORs颗粒，进行统计学处理。

[1]2 结果结果显示，各种病变细胞AgNORs颗粒明显增多，AgNORs颗粒为8.87±1.79，对照病人AgNORs颗粒为2.9±0.8，差异有显著性，3 讨论自1975年首次报道了核仁形成区嗜银蛋白染色方法以来，国内不少学者将其应用于肿瘤研究，AgNORs染色所用试剂简单，操作简易迅速，重复性好，可在一般光镜下观察，便于推广，阳性率和符合率都很高，银染在这种情况下比瑞氏染色好观察的多，在银染下，细胞核染色比较清楚，癌细胞核的特征，如核大小不均，形态异常，明显而大的核仁，都很好观察，本实验证实患者细胞内AgNORs颗粒数量与胃癌呈正相关，细胞核及核内嗜银颗粒大小、形态及数量的变化为胃癌早期诊断及鉴别诊断的定量指标，AgNORs因其操作简便，更利于临床推广，增加了一个临床病理诊断方法。

核仁组成区相关的嗜银蛋白（Ag—NOR）快速测定试剂盒及染色方法改进

核仁组成区相关的嗜银蛋白（Ag—NOR）快速测定试剂盒及
染色方法改进
王永才;卢娟
【期刊名称】《大连医科大学学报》
【年(卷),期】1996(18)1
【摘要】核仁组成区相关的嗜银蛋白（Ａｇ－ＮＯＲ）快速测定试剂盒及染色方法改进王永才，姜风，卢娟（附属一院血液室）（大连市瓦房店第三医院检验科）芦艳青，姜威（大连海港医院）（山东威海职工医院）Ａｇ－ＮＯＲ是核仁组成区相关的嗜银蛋白的简称，国内外学者将其广泛应用...
【总页数】2页(P45-46)
【作者】王永才;卢娟
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R730.43
【相关文献】
1.显示核仁组成区嗜银蛋白的快速染色法 [J], 龚志锦;詹熔洲
2.脊髓运动神经元核仁组成区嗜银蛋白的快速染色法 [J], 庞清江;潘恩木;房清敏
3.核仁组成区相关嗜银蛋白染色方法探讨 [J], 刘勇;戴艳枝
4.核仁组成区相关嗜银蛋白染色革新法 [J], 李青
5.核仁组成区相关嗜银蛋白染色在肿瘤研究中的应用Ⅰ.NHL的Ag-NORs定量研究及与预后的关系 [J], 刘景琴;张顺利;李素英
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核仁组成区嗜银(AgNOR)染色

核仁组成区嗜银（AgNOR）染色一、核仁组成区嗜银（AGNOR）染色简介核仁组成区(NORs)是染色体上的一个编码核糖体RNA(rRNA)的片段，存在于DNA特异性环上，凸向核仁。

在电镜下，核仁组成区为在电子致密区中的境界不清的浅染区域。

在石蜡切片上，在核仁中见到的每一个点状反应颗粒有可能代表多个AgNOR位点。

核仁组成区嗜银蛋白染色主要特点是操作简便、批量染色的较为经济，AgNOR位点的数量增加与细胞增殖性增加有关，对于良恶性肿瘤的鉴别具有一定的意义。

二、试剂配制1、AgNOR染色液甲液：明胶2 g 溶于双蒸水至99 ml，在60℃使之完全溶解，再加入纯甲酸1 ml 摇匀待用。

乙液：硝酸银50 g 溶解于双蒸水中至100 ml，4℃冰箱保存。

2、AgNOR工作液取甲液10 ml，乙液20 ml 临用前混合。

三、染色步骤1.切片脱蜡至水2.双蒸水洗2次3.AgNOR 工作液中（25℃）浸染30分钟（暗处进行）（镜下观察）4.脱水，透明，封固5.结果：油镜观察，细胞核及胞质背景为淡黄色， AgNOR呈棕黑色颗粒状。

四、样本说明1、石蜡切片取材：1、组织离体后需及时固定；2、组织标本不宜过大、过厚。

固定：1、固定液：10%福尔马林（4%多聚甲醛）或10%中性甲醛；2、用量：一般固定液的量与组织体积比为10:1～20:1；3、固定：适宜的固定时间，主要根据材料的大小、松密程度及固定液的穿透速度而定。

保存：切片经60℃烤片3-5小时后，可于常温或4℃干燥保存。

2、冰冻切片取材：取材后需立即置于超低温冰箱或液氮中保存。

固定：样本冰冻切片后，应立即放入甲醇、丙酮、95%酒精、4%多聚甲醛等固定液中固定。

保存：固定好的切片自然风干，密封后置于-80℃、-20℃保存，尽快用于后续实验。

3、细胞块石蜡切片细胞量较多的样品，可离心分离所需细胞，用中性甲醛固定后制作成琼脂细胞块，然后按照制作石蜡切片的操作流程进行切片。

我们实验室用的银染方法

我们实验室用的银染方法1.50%甲醇浸泡15分钟(置于摇摆床上,以下省略,本步骤两次,每15分钟更换一次)2.10%甲醇浸泡10分钟3.水漂洗3次,每次数秒4.2μM DTT溶液浸泡20分钟5.0.1%硝酸银溶液浸泡20分钟6.水漂洗3次,每次不超过15秒(每次约150ML)7.显色液漂洗3次,每次不超过15秒(每次约100ML)8.显色液浸泡显色至看到目的蛋白带(约200ML)9.10G柠檬酸定影显色液:15G无水碳酸钠溶于500ml水,用前加入250μL福尔马林搅拌均匀水用双蒸水就可以,纯度越高越好,其他试剂用分析纯,据书上说甲醇用化学纯的比分析纯更灵敏此方法出自冷泉港蛋白质技术指南(实际上是其蛋白质技术会议的总结)灵敏度稍低于分子克隆上老方法,但是非常方便,也比其他方法快速,只需要1.5小时,我染出来的胶非常漂亮,有需要的话可以上传给大家看看一般来说，高背景是由于杂质产生的，银染的水质很重要，最好要用去离子水或双蒸水，装胶的器皿也一定要洗得很干净。

固定、银染之后均需充分的漂洗。

其实银染就是银镜反应，可能是你的样品浓度高，所以白了，浓度更高还会变成一条能反光的带。

固定时间不需加长，我有时来不及还减少固定时间，银染关键是器皿和溶液干净，显色前胶一定要漂干净大板本来效果就差点，浓度越大，条带形状越差，这也很正常，银染薄点的胶效果要好些，因为染的是表面的蛋白1.取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.2. 0.1% 硝酸银染色10分钟.3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.显色液配方: 10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.材料没什么要求，玻璃会更好一点，但不好搞到，我们是见到什么大小合适就用什么。

液体的量一般是胶体积的5倍，比如13×13×0.1cm的胶，用一百ml一定够，80也行。