一种新型重组人复合α干扰素的表达、分离纯化及活性测定
重组人干扰素α2b和胸腺肽α1融合蛋白的分离纯化
１ ２ 试 剂与 仪器 ．
胰蛋 白胨 、 母 提 取 物 ， ｏｄ公 司 ； 组 肠 激 酵 Ｏｘ ｉ 重
功构 建过 人干扰 素 Ｏ ｂ 腺 肽 ａ 的 融合 蛋 白， 无 ￣－ ２胸 ． 还 在 Ｅ．ｏｉ中表 达并 分离 纯化 此融 合蛋 白的报 道 。 ｃｌ
本文 考察 了 Ｅ．ｏｉ 达 的重 组 人干 扰 素 ａｈ ｃｌ 表 和 胸腺 肽 ａ 的融合 蛋 白的分离 纯 化条 件 ， ｌ 为进 ～ 步研 究重 组融 合 蛋 白的 分离纯 化提 供理论 指 导 。
终 目的 融 合 蛋 白 产 量达 ６ ｍｇｇ干 菌 体 。 ８ ／ 关 键 词 ：人干 扰 素 ａｂ ；胸腺 肽 ａ； 合蛋 白 ； 属 螯 合 层 析 ２ ｌ融 金 中 图分 类号 ：Ｑ １ ． ５２７
干 扰 素 （Ｆ 是 一 类 重 要 的抗 病 毒 、 肿 瘤 的 ＩＮ） 抗 治 疗 药 物 ， 抗 病 毒 活 性 最 为 公 认 … 胸 腺 肽 其 １。
分 离 纯 化 过 程 。 实 验 结 果 表 明 ： 涵 体 经 ７ ｌＬ盐 酸 胍 ， ０ 包 ／ ｍｏ １ ｌ Ｔ 变 性 ； １Ｌ尿 素 ， ＩＬ还 原 型 谷 ｍｍｏ Ｌ Ｄ Ｔ ／ １ ／ ｍｏ ２ ｍｍ。 ／ 胱 甘 肽 ， ． ｍｍ ｌＬ氧 化 型 谷 胱 甘 肽 脉 冲 加 样 稀 释 复 性 ； 属 螯 合 层 析 收 集 ０ ３ｍ ｌ 咪 唑 洗 脱 峰 ， 干 后 经 重 组 ０ ２ ｏ／ 金 ． ｏ／ Ｌ 冷 肠 激 酶 ３ ℃ 酶 切 ２ 、 ｅｈｄｘＧ ５ ０ ４ Ｓｐ ａｅ －０柱 纯 化 ， 得到 纯 度 达 ９ ％ 的 重 组 人 干 扰 素 ２ 胸 腺 肽 ａ 融 合 蛋 白 ， 最 ｈ 可 ０ ｂ 和 ｌ 且
高效液相色谱在多肽分离分析中的应用
高效液相色谱在多肽分离分析中的应用李文龙;张慧;汤琦;高利龙;丛海林;于冰【摘要】多肽的高生物活性和低毒副作用使其成为近来国内外生命科学研究的热点,因此多肽的分离与分析也愈发的关键.高效液相色谱(HPLC)以其极高的分离效率和良好的选择性已经成为实验室和工业分离分析生物大分子最常用和有效的方法.本文主要介绍了HPLC以及一些新型色谱在多肽分析分离中的应用.%Polypeptide has become the focus of life science research at home and abroad because of its high bioactivity and low toxicity. High performance liquid chromatography(HPLC)with high separation efficiency and good selectivity has become the commonly used and the most effective method in laboratory and industrial separation and analysis of biological macromolecules. T his review mainly summarized the ap-plication of HPLC and some new chromatography techniques in the separation and analysis of polypep-tides.【期刊名称】《分析仪器》【年(卷),期】2018(000)001【总页数】5页(P63-67)【关键词】高效液相色谱;多肽;分离;分析【作者】李文龙;张慧;汤琦;高利龙;丛海林;于冰【作者单位】青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;纤维新材料与现代纺织国家重点实验室培育基地,青岛大学材料科学与工程学院,青岛266071;青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;纤维新材料与现代纺织国家重点实验室培育基地,青岛大学材料科学与工程学院,青岛266071【正文语种】中文随着生物化学技术的不断发展，多肽因其独特而又高效的吸收机制和非常强的生物活性，而成为生化专家们所关注和研究的热门材料。
重组猪_干扰素的纯化及生化性质鉴定
重组猪α-干扰素的纯化及生化性质鉴定邵 菁1,2,于瑞嵩2,3,董世娟2,3,朱于敏2,3,沈世缘2,3,曹祥荣1,李 震2,3(1.南京师范大学生命科学学院,江苏南京210046)(2.上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海201106)(3.上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106)[摘要] 对巴斯德毕赤酵母高效分泌表达的猪α2干扰素(Po I F N 2α)纯化工艺和纯化后重组蛋白的部分生化特性进行了研究,结果表明:猪α2干扰素(Po I F N 2α)发酵液经离心、透析、过滤处理之后,依次利用亲和层析和离子交换层析使目的蛋白得到了纯化.经N 端氨基酸测序,W estern 2bl ot,对酸、热、巯基乙醇的稳定性和糖基化程度等检测后发现,所表达的猪α2干扰素N 端氨基酸序列(前5个)正确,对酸和热基本稳定,二硫键对目的蛋白的活性至关重要,没有发现目的蛋白的糖基化.[关键词] 重组猪α2干扰素(Po I F N 2α),亲和层析,离子交换层析,糖基化,生化性质[中图分类号]S852.4 [文献标识码]A [文章编号]100124616(2008)022*******Pur i f i ca ti on of Recom b i n an t Porc i n e 2αI n terferon and the Iden ti f i ca ti on of its B i ochem i ca l Character isti csShao J ing 1,2,Yu Ruis ong 2,3,Dong Shijuan2,3,Zhu Yum in2,3,Shen Shiyuan2,3,Cao Xiangr ong 1,L i Zhen2,3(1.School of L ife Science,Nanjing Nor mal University,Nanjing 210046,China )(2.Ani m al Husbandry and Veterinary Research I nstitute,Shanghai Acade my of Agricultural Sciences,Shanghai 201106,China )(3.ShanghaiMunici pal Key Laborat ory of Agri 2Genetics and B reeding,Shanghai 201106,China )Abstract:I n this study,we devel oped the technique f or purifying recombinant porcine 2αinterfer on (Po I F N 2α)that was efficiently exp ressed by Pichia Past oris and studied the bi oche m ical characteristics of Po I F N 2α.Recombinant porcine I F N 2αwas purified t o homogeneity by affinity chr omat ography and i on 2exchange chr omat ography stepwisely after centrifu 2gati on 、dialysis and filtrati on .The results of its bi oche m ical characteristics showed that the first five a m ino acids of N -ter m inal of the purified p r otein was correct .The p r otein was heat and acid 2stable and the dithi olate 2bond was crucial t o the p r otein activity .No glycosylati on were f ound on the target p r otein .Key words:recombinant porcine α2interfer on (Po I F N 2α),affinity chr omat ography,i on 2exchange chr omat ography,glyco 2sylati on,bi oche m ical characteristics 收稿日期:2007207202.基金项目:上海市农业科学院青年科技发展基金(农青年科技2005-02)资助项目.通讯联系人:李 震,研究员,研究方向:动物生物技术,E 2mail:zhenli@ 干扰素(I nterfer on,I F N )是一类重要的细胞因子,具有种属特异性,在同种细胞上具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖、免疫调节等多种生物活性.根据干扰素的来源和性质可分为Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素[1,2].猪干扰素(Po I F N )也可分为I 型和Ⅱ型,I 型包括α、β、ω和τ4种,Ⅱ型仅有γ1种.I 型猪干扰素基因无内含子,基因组中一般含有多个I 型猪干扰素基因[3].猪I F N 2α(Po I F N 2α)基因家族分为二类同源的、但明显不同的基因类型:Po I F N 2α1和Po I F N 2α2.目前,Po I F N 2α1基因已经在真核和原核细胞中得到表达,但相关的分离纯化报道很少.通过研究表明,Po I F N 2α可被用作动物疫苗的免疫增强剂和猪病毒病的治疗剂[4,5],因此,在获得较高水平表达产物的基础上,探索重组Po I F N 2α的分离纯化工艺,具有重要的理论意—79—第31卷第2期2008年6月 南京师大学报(自然科学版)JOURNAL OF NANJ I N G NOR MAL UN I V ERSI TY (Natural Science Editi on ) Vol .31No .2Jun,2008义和实践价值.1 材料和方法111 材料111.1 试剂 磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、Tris 、甲醇、氯化钠、三氟甲基磺酸、苯酚、脱氧胆酸钠和三氯乙酸购自上海国药生物公司,辣根过氧化物酶、P VDF 膜和咪唑购自上海西唐生物公司,BCA 试剂盒购自Pierce 公司.11112 设备及仪器高速离心机(Sig ma ),凝胶电泳仪(B i o 2rad ),凝胶图像处理系统(上海Tanon ),pH 计(M illi pore ),M il 2li pore 012μm 滤器(Pall ),截留相对分子质量3500的透析袋(上海华美),FP LC 分离纯化系统和H isTrap HP Kit 亲和预装柱(安玛西亚),H isTrap DE AE FF 离子交换预装柱(GE Healthcare ),真空干燥器(Sa 2vant ).112 方法11211 纯化 发酵液于4℃12000r/m in 离心15m in,收集上清液;上清液用pH810、P O -3420mmol/L 、NaCl 500mmol/L 透析24h 后,于4℃10000r/m in 离心15m in,再次收集上清液;上清液经过012μm 微孔滤器过滤后上样金属N i 2+亲和预装柱(1mL ),通过不同浓度的咪唑进行阶段洗脱,收集流出峰并测其活性;活性峰用pH 716、Tris 20mmol/L 透析24h 后,上样DEAE FF 离子交换预装柱(1mL ),通过不同浓度的NaCl 阶段洗脱,收集流出峰并测其活性.11212 活性检测猪α2干扰素的活性检测采用W I SH 细胞(人羊膜传代细胞株)-VS V (滤泡性口炎病毒)抗病毒系统[6].I F N 抗病毒活性单位的定义是指能抑制50%细胞病变或50%病毒空斑形成效应的I F N 最高稀释度的倒数.11213 纯度检测S DS -P AGE 银染电泳鉴定纯度[7].11214 蛋白浓度测定蛋白浓度用BCA 试剂盒,具体步骤见盒中说明书.11215 蛋白质免疫印迹样品先进行S DS -P AGE 电泳,结束后切下含有目的蛋白的胶;将NC 膜和3mm 滤纸按海绵垫—滤纸(3张)—凝胶—NC 膜—滤纸(3张)—海绵垫的结构放入转印电泳槽,冰浴下200mA 恒流转印3h .结束后将NC 膜依次置于:封闭液中振摇1h,用封闭液稀释为1∶6000的鼠抗Po I F Nα一抗中振摇1h;P BST 中洗3次,每次10m in;用封闭液稀释为1∶5000的HRP 标记山羊抗小鼠I g G 的二抗中振摇1h;P BST 洗3次,每次10m in .最后将膜浸入底物溶液中直至适中的颜色出现,用去离子水冲洗终止反应.11216 蛋白质N 端氨基酸序列、等电点(p I )的测定委托上海中科院生化与细胞所测试中心检测.11217 对酸、热、巯基乙醇稳定性的检测①猪α2干扰素对酸的稳定性:将1mL 纯化的蛋白样液在4℃下置于pH 210、20mmol 的磷酸二氢钠溶液中透析24h .②猪α2干扰素对热的稳定性:将1mL 纯化的蛋白样液放入Eppendorf 离心管中,置于56℃水浴锅内1h .③猪α2干扰素对巯基乙醇的稳定性:将200mmol β-巯基乙醇加入纯化的蛋白样液中,在4℃下置于pH 714的磷酸二氢钠溶液中透析24h .通过抗病毒系统检测猪α2干扰素的活性[8].11218 糖基化修饰的初步鉴定(1)辣根过氧化物酶(HRP )的糖链切割:取一定量HRP 于Eppendorf 离心管中,依次加入100μL 三氟—89—南京师大学报(自然科学版) 第31卷第2期(2008年)甲基磺酸和50μL 苯酚,于0℃1000r/m in 旋转1h,加100μL 20mmol/L Tris 终止反应,并于4℃pH 714、20mmol 磷酸缓冲液内透析24h;用三氯乙酸沉淀法沉淀,加入适量的样品缓冲液后进行S DS -P AGE 电泳[9,10].(2)猪α2干扰素的糖链切割:先通过三氯乙酸沉淀法将目的蛋白沉淀,冷冻抽干后,按方法(1)对目的蛋白进行糖链切割.2 结果与分析211 纯化 图1显示亲和层析后(泳道4)的杂蛋白量已经大幅减少,再经离子交换层析分离纯化后(泳道6),可以获得较为单一的目的蛋白.表1显示了这一纯化路线的纯化效果,最终的蛋白比活为115×104I U /mg,蛋白回收率为1133%,纯化倍数为0127.表1 猪α2干扰素的分离纯化的效果Table 1 Par i f i ca ti on eff i c i ency of Po I FN 2α样品蛋白浓度/(mg/mL )蛋白活力/(×104I U /mL )蛋白比活/(×104I U /mg )蛋白收率/%纯化因子上样前发酵液3100237167100—亲和上样前透析液116461183177541670149亲和上样收集的峰017321062182241330175离子交换前透析液01110161515531671197离子交换收集的峰01040106115011330127212 W estern bl ot 、蛋白质N 端氨基酸序列和等电点(p I )的测定检测发现相对分子质量16100和210002条蛋白的N 端前5个氨基酸序列均是E -A -E -A -X,对照猪α2干扰素N 端前5个氨基酸序列(C -D -L -P -Q )和载体α信号肽最后5个氨基酸序列(R -E -A -E -A )发现,所测的前4个氨基酸序列是载体α信号肽末端未切除的部分;X 在一般情况下是C,正好是目的蛋白的第一个氨基酸,这样连同W estern bl ot 分析结果(图2)均证明,在16100和21000出现的2条蛋白N 端保持完好,且均是猪α2干扰素.另外,相对分子质量16100的目的蛋白等电点为415～418,而用软件分析猪α2干扰素裸蛋白的等电点为614.表2 猪α2干扰素对酸、热、巯基乙醇的稳定性Table 2 The st ab ility of Po I FN 2αi n face of ac i d 、hea t and m ercaptoethanol条件活性未经处理酸(pH210)热(56℃,1h )巯基乙醇(200mmol )干扰素滴度/(I U /mL )628503312邵 菁,等:重组猪α-干扰素的纯化及生化性质鉴定213 对酸、热、巯基乙醇稳定性的检测表2说明在酸、热和巯基乙醇存在的条件下:猪α2干扰素在pH210时基本稳定,在56℃1h内具有一定的稳定性,而它对巯基乙醇则十分敏感,表明二硫键对维持其活性有着非常重要的作用.214 糖基化修饰的初步鉴定图3显示HRP经TF MS切割后相对分子质量由40000左右移至30000附近,说明TF MS法确实能够切除糖蛋白的糖链.图4显示16100和21000这2条带经TF MS法切割后,并没有出现位置上的明显变化,所以初步认为表达的猪α2干扰素没有发生糖基化.3 讨论在金属螯合亲和层析纯化过程中,本文选用咪唑为竞争性物质,通过改变咪唑浓度来洗脱目的蛋白.实验中目的蛋白洗脱下的咪唑浓度较低,显示目的蛋白结合不很牢固,可能与蛋白质的空间结构有关,也可能与目的蛋白C末端H is的降解有关;在离子交换层析纯化过程中,缓冲液的pH值是影响分离效果的关键因素之一,实验中选用的pH716缓冲液可以较好地达到分离纯化重组猪α2干扰素的目的.从整个纯化效果来看,蛋白回收率、比活和纯化因子都不理想,可能的原因是:在纯化过程中,①一些含有目的蛋白组分较高、但纯度不是很高的样品不得不被放弃;②有相当一些目的蛋白可能因为外界条件的变化而改变了其空间构象,造成目的蛋白的失活.本实验中的目的蛋白C端理论上带有15个氨基酸残基的抗原表位和6个组氨酸残基,如果表达完整,相对分子质量应该在21000左右.实验结果显示相对分子质量在16100和21000的2条蛋白均是目的蛋白,造成两者相对分子质量差异的原因可能是:大部分目的蛋白C末端的6个H is,甚至15个抗原表位氨基酸残基已经降解.另外,目的蛋白理论等电点应在614左右,这与所测的415～418也有明显差异,可能的原因是:目的蛋白C端的15个抗原表位氨基酸序列(E-Q-K-L-I-S-E-E-D-L-N-S-A-V-D)中有5个是酸性氨基酸,只有1个是碱性氨基酸,这也说明目的蛋白C末端6个H is可能已经部分或全部降解,从而导致整个蛋白的电负性增加.三氟甲基磺酸法(TF MS)可以切除与肽链直接相连的单糖以外的所有糖基,而肽键则在同样的条件下保持稳定,最后通过电泳比较糖链切割前后蛋白相对分子质量的变化来判断某一蛋白是否糖基化.该法反应温和,速度很快,对糖基化类型没有选择性,可以作用于所有类型的糖链.经过TF MS法切割后的目的蛋白(图3、图4)相对分子质量未发生明显变化,故初步判断目的蛋白没有糖基化.(下转第104页)[9] Nadl ong L.Sepueira L.I ncrease in per oxidase activities are not directly involved in induced resistance in t obacco[J].Physi2ol Plant Pathol,1980(16):128.[10] 宋平,曹显祖,吴永宏,等.水稻矮秆基因对G A3敏感性的酶学基础[J].江苏农学院学报,1994,15(4):10213.[11] Giannopolitis C N,R ice S K.Super oxide dis mutase.Purificati on and quantitative relati onshi p with water2s olube p r otein inbreeding[J].Phant Physi ol,1977(59):3152318.[12] 刘惕若,陈洁敏,郭彦太,等.小麦品种对赤霉病的抗性研究[J].黑龙江八一农垦大学学报,1995(1):125.[13] 刘道宏.植物叶片的衰老[J].植物生理学通讯,1983(2):14219.[14] 林植芳,李双顺,林桂珠,等.水稻叶片的衰老与超氧化物歧化酶活性及脂质过氧化作用的关系[J].植物学报,1984,26(6):6052615.[15] 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报告基因法测定干扰素活性
报告基因法测定干扰素活性附录ⅩC 干扰素生物学活性测定法第2法报告基因法（适用于Ⅰ型干扰素）本法系将含有干扰素刺激反应元件和荧光素酶基因的质粒转染到HEK293细胞中，构建细胞系HEK293puroISRE-Luc，作为生物学活性测定细胞，当Ⅰ型干扰素与细胞膜上的受体结合后，通过信号转导，激活干扰素刺激反应元件，启动荧光素酶的表达，表达量与干扰素的生物学活性成正相关，加入细胞裂解液和荧光素酶底物后，测定其发光强度，，得到标准品溶液生物学活性对其化学发光强度的剂量反应曲线，以此测定Ⅰ型干扰素生物学活性。
试剂（1）完全培养液MEM培养液，含有2mM的L-谷氨酰胺，1mM的丙酮酸钠，0.01mg/L的非必需氨基酸，2μg/ml的嘌呤霉素，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素，10%的胎牛血清。
4℃保存。
（2）测定培养液除不含嘌呤霉素外，其它成分与完全培养液相同。
4℃保存。
（3）PBS 取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。
（4）消化液称取乙二胺四乙酸二钠0.2g、胰酶2.5g，用PBS溶解并稀释至1000ml，除菌过滤。
4℃保存。
（5）荧光素酶报告基因检测试剂盒包括细胞裂解液、荧光素酶底物等。
标准品溶液的制备取重组人干扰素生物学活性测定国家标准品，按说明书复溶后，用测定培养液稀释至每1ml约含10000IU。
在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。
在无菌条件下操作。
供试品溶液的制备将供试品按标示量溶解后，用测定培养液稀释成每1ml约含10000IU。
在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。
在无菌条件下操作。
测定法使HEK293puroISRE-Luc细胞在完全培养液中贴壁生长。
按1∶4传代，每周2～3次，于完全培养液中生长。
取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗1次后消化和收集细胞，用测定培养液配制成每1ml含3.5×105～4.5×105个细胞的细胞悬液。
重组人干扰素
重组人干扰素简介重组人干扰素（recombinant human interferon）是一种由基因重组技术制备的人工合成干扰素。
干扰素是人体自然产生的一类蛋白质，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性。
通过基因重组技术，人工合成的重组人干扰素可以在人体内发挥类似自然干扰素的生物学活性，被广泛应用于医学领域的疾病治疗和预防。
组成与结构重组人干扰素的组成与结构与自然干扰素类似，主要由蛋白质组成。
根据不同的干扰素类型，药物名称可能会有所不同，如重组人α干扰素（recombinant human interferon alpha），重组人β干扰素（recombinant human interferon beta）和重组人γ干扰素（recombinant human interferon gamma）等。
重组人干扰素通常采用大肠杆菌等常见微生物进行表达和生产，通过基因重组技术将干扰素基因导入到宿主细胞中，使宿主细胞表达并合成干扰素蛋白质。
制备过程中还可能采用亲和层析、离心、冻干等工艺，保证药物的纯度和稳定性。
作用机制重组人干扰素通过与人体细胞表面的干扰素受体结合，触发一系列信号转导途径，从而发挥其多种生物学活性。
主要的作用机制包括：1.抗病毒作用：重组人干扰素可以激活多种抗病毒机制，如抑制病毒复制、增强细胞免疫反应、诱导干扰素诱导基因和抗病毒蛋白的表达等，从而对多种病毒感染起到抑制和清除的作用。
2.抗肿瘤作用：重组人干扰素可以通过调节宿主免疫系统、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长和扩散等机制，对多种恶性肿瘤具有抑制和杀伤作用。
3.免疫调节作用：重组人干扰素可以调节宿主免疫系统的免疫应答，增强细胞免疫和体液免疫功能，对免疫相关性疾病具有治疗和预防作用。
临床应用重组人干扰素在临床应用中已被广泛用于多种疾病的治疗和预防。
以下是一些常见的临床应用：1.丙型肝炎：重组人干扰素可以用于慢性丙型肝炎的治疗，通过抑制病毒复制和增强宿主免疫力来达到治疗效果。
重组人干扰素生产工艺
4.1 干扰素α-2b分离工艺过程
菌体裂解 预处理 初级分离
(1)菌体裂解
裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃ （pH7.5）
使用保护剂：EDTA，PMSF。 破碎－20℃菌体：2厘米以下的碎块 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
(2)预处理-沉淀
15℃以下。 检测：发酵液杂菌检查
3.4．菌体收集
连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min 离心收集。
菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。 检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥
失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。
4 干扰素的分离纯化工艺过程
4.1、干扰素分离工艺过程
4.2、干扰素的纯化工艺过程
主要内容
干扰素概述 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 干扰素的发酵工艺过程 干扰素的分离纯化工艺过程
1 .干扰素概述
干扰素的种类 干扰素的理化性质 干扰素的生物学活性 干扰素的临床应用 干扰素的生产工艺路线
1.1 干扰素的种类
概念： （interferon，IFN）
干扰素是一种细胞因子，它是机体感染病毒时，宿主细胞 通过抗病毒应答反应，而产生的一组结构类似、功能相近 的低分子糖蛋白。英文名称为Interferon，简称IFN。
一种重组人复合α干扰素的制备方法[发明专利]
![一种重组人复合α干扰素的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/ea670d3e3186bceb18e8bb8e.png)
专利名称：一种重组人复合α干扰素的制备方法
专利类型：发明专利
发明人：储炬,郝玉有,张嗣良,庄英萍,史琪琪,王永红,杭海峰,刘志敏,杨士珍,吴康华
申请号：CN200510028285.0
申请日：20050729
公开号：CN1733929A
公开日：
20060215
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种经真核表达制备重组人复合α干扰素(cIFN)制备方法，其主要步骤是：将酵母工程菌(Pichia pastoris GS115/pPIC9K－CIFN)经种子培养、发酵罐培养、外源蛋白诱导表达及目标蛋白纯化后获得cIFN，其特征在于，在外源蛋白诱导表达启动时加入Tween－20、Tween－80、SDS、Triton X－100、Triton X－114、NP－40、CHAPS、Zwittergent3－14、LiDS、胆酸钠、脱氧胆酸钠、辛匍糖苷或/和Brij35，加入量为0.01～10g/L发酵液；外源蛋白诱导表达的温度控制在20～30℃；外源蛋白诱导表达时发酵液的pH值控制在3.0～7.0且发酵液中的甲醇含量控制在1.0～10.0g/L发酵液。
本发明不仅实现了cIFN的高密度高发酵表达，而且使cIFN在发酵液中维持了正确的单体分子状态和生物活性，大大抑制了cIFN聚合体和降解产物的形成。
申请人：华东理工大学
地址：200237 上海市徐汇区梅陇路130号
国籍：CN
代理机构：上海顺华专利代理有限责任公司
代理人：陈淑章
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人用重组DNA制品质量控制技术指导原则
人用重组DNA制品质量控制技术指导原则一、引言由于分子遗传学、核酸化学及重组DNA（rDNA）技术的迅速发展,现已能够确定和获得许多天然活性蛋白的编码基因，将其插入表达载体或引入某种宿主细胞后,能有效地表达该基因产物，再经分离、纯化和检定，可得到用于预防和治疗某些人类疾病的制品,诸如现有的乙型肝炎疫苗、胰岛素、生长激素、干扰素等.用不同于常规方法的rDNA技术生产的制品，是近年来出现的新产品，评价其安全性和有效性亦不同于常规方法。
这一领域中的知识和技术还在不断发展，为了有利于这类制品在我国的研究和发展，并为这类制品的审评提供依据,有必要制定一个原则性指导文件，以保证在人群中试验或应用时安全有效。
本“人用重组DNA制品质量控制技术指导原则”（以下简称《指导原则》）不可能面面俱到，可能有许多专门技术问题会出现,对于这类问题或某一特定制品，则应视具体问题具体研究决定。
本《指导原则》亦将随科学技术发展和经验积累而逐步完善。
二、总则（一)本《指导原则》适用于rDNA技术生产并在人体内应用的蛋白质、肽类制品.（二)凡属与一般生物制品有关的质量控制，均按现行版《中国药典》有关规定执行。
有关生产设施的要求应参照国家药品监督管理局《药品生产质量管理规范》执行。
三、质量控制要求（一）原材料的控制1．表达载体和宿主细胞应提供有关表达载体详细资料，包括基因的来源、克隆和鉴定，表达载体的构建、结构和遗传特性。
应说明载体组成各部分的来源和功能，如复制子和启动子来源，或抗生素抗性标志物.提供至少包括构建中所用位点的酶切图谱。
应提供宿主细胞的资料,包括细胞株(系)名称、来源、传代历史、检定结果及基本生物学特性等。
应详细说明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态（是否整合到染色体内）及拷贝数。
应提供宿主和载体结合后的遗传稳定性资料。
2．克隆基因的序列应提供插入基因和表达载体两侧端控制区的核苷酸序列。
所有与表达有关的序列均应详细叙述。
重组人干扰素α1b制造及检定规程
2.6 半成品检定 按3.2项进行。 3.2项进行。 2.7 分装及冻干 按本版规程通则《生物制品分装规程》 按本版规程通则《生物制品分装规程》进行。 2.8 规格 应为国家药品管理当局批准的规格。 2.9 包装 按本版规程通则《生物制品包装规程》 按本版规程通则《生物制品包装规程》进行。
3 检定
2.2 工程菌菌种 2.2.1工程菌菌种名称及来源 2.2.1工程菌菌种名称及来源 重组人干扰素α1b工程菌株系由人干扰素α1b基因的重组 重组人干扰素α1b工程菌株系由人干扰素α1b基因的重组 质粒转化的大肠杆菌菌株。生产用工程菌株需经国家药品管理 当局批准。 2.2.2 种子批建立、传代及保存 从原始种子批传代、扩增后用适当方法保存，作为主种子 批；从主种子批传代、扩增后用适当方法保存作为工作种子批。 2.2.3 菌种检定 主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。 2.2.3.1 划种LB琼脂平板 划种LB琼脂平板 应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。 2.2.3.2 涂片革兰氏染色 在光学显微镜下观察，应为典型的革兰氏阴性杆菌。
3.1.1 效价测定 方法见附录。用国家标准品校准确定效价(IU)。 方法见附录。用国家标准品校准确定效价(IU)。 3.1.2 蛋白质含量 用Lowry法测定。 Lowry法测定。 3.1.3 比活性 应不低于1.0 应不低于1.0 × 107IU /mg蛋白。 /mg蛋白。 3.1.4 纯度 3.1.4.1 电泳法 用非还原型SDS-PAGE法。加样量应不低于5 g(银 用非还原型SDS-PAGE法。加样量应不低于5µg(银 染法) 10µg(考马氏亮蓝R 250染色法) 染法)或10µg(考马氏亮蓝R-250染色法)。经扫描仪扫描， 纯度应不低于95.0%。 纯度应不低于95.0%。 3.1.4.2 高效液相色谱法 用波长280nm检测，应呈一个吸收峰，或主峰应不 用波长280nm检测，应呈一个吸收峰，或主峰应不 低于总面积的95.0%。 低于总面积的95.0%。
重组人干扰素-λ1的纯化与鉴定
重组人干扰素-λ1的纯化与鉴定赵俊英【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2008(012)050【摘要】背景: 2003年研究发现一个全新的Ⅲ型干扰素家族,即IFN-λs,包括λ1,2,3 三种亚型.目的;对在毕赤酵母中高效表达重组人干扰素-λ1(rhIFN-λ1)进行产率纯度分析.理化性质、受体表达鉴定以及抗肿瘤活性初步探讨.设计、时间及地点: 单一样本观察,于2006-09/2008-07在中国医学科学院基础所生物化学与分子生物学系完成.材料: 含rhIFNλ1表达质粒的酵母菌种pAO815-4 α F-IFNλ1/GS115,人宫颈癌细胞系Hela细胞和HCT116细胞,为中国医学科学院基础所医学分子生物学国家重点实验室保存.方法: 诱导含rhIFN-λ1表达质粒的甲醇营酵母Pichia pastoris进行表达,表达产物经阳离子交换层析及凝胶层析纯化.主要观察指标: 通过HPLC,质谱,毛细管电泳等鉴定其纯度及理化性质,反转录-聚合酶链反应及real-time荧光定量聚合酶链反应鉴定其在肿瘤细胞中特异受体的表达,应用四甲基偶氮唑盐比色法初步评价其抗肿瘤活性.结果: 毕赤酵母表达的rhIFN-1表达水平约9.23 mg/L,纯化后的纯度近90%.rhIFN-λ1等电点为8.01,相对分子质量为20 960.在Hela和HCT116中均检测到rhIFN-λ1受体小亚基IL-10R2和特片大亚基IL-28RmRNA的表达,但U937细胞中末检测到IL-28RmRNA的表达.rhIFN-λ1具有与IFN-α 2a相似的降低细胞增殖的作用,但在经检测无或极少表达IL-28R的细胞中此作用不明显.结论: rhiFN-λ1可以在毕赤酵母中实现高效表达,表达产物的理化性质与天然IFN-λ1一致,具有与IFN-α 2α相似的抗肿瘤活性,但对其特异受体分布少的骨髓造血系统降低增殖作用相对较弱.【总页数】5页(P9929-9933)【作者】赵俊英【作者单位】北京协和医学院基础学院,中国医学科学院基础医学研究所生物化学与分子生物学系,北京市,100005【正文语种】中文【中图分类】R392.114【相关文献】1.重组人干扰素α2b和胸腺肽α1融合蛋白的分离纯化 [J], 罗琪;陈劲春2.采用DOE试验方法优化重组人干扰素α2a纯化工艺 [J], 苏诗蟠3.注射用重组人干扰素β1b的分离纯化及质量研究 [J], 张振龙;刘建源;杨云凯;崔春青;邓宛明;汤燕文;赵建英;郭秀梅;郭鹏4.重组人干扰素λ1的表达、纯化及生物活性研究 [J], 张钫;郑丽舒;袁武梅;王翔;薛鹏浩;麻粉莲;张骞5.重组人干扰素α-2b的梯度凝胶色谱柱复性和同步纯化 [J], 高飞;范清林;邹文艺;李运;宋礼华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
干扰素的研究进展
在 畜 禽 疾 病 上 的 应 用
1、猪白细胞干扰素 1998年 刘万钧等用Vero 传代细胞对猪流行性腹泻病毒(PEDV) 进行干扰试验, 1998年，刘万钧等用Vero 传代细胞对猪流行性腹泻病毒(PEDV) 进行干扰试验, 证明猪白细胞干扰素能有效地抑制PEDV 的繁殖活性, 剂量为100U/ 证明猪白细胞干扰素能有效地抑制PEDV 的繁殖活性,在IFN 剂量为100U/ ml 时可明显 抑制, 1000U/ ml 可显著抑制,2500U/ ml几乎可完全抑制。 抑制, 可显著抑制,2500U/ ml几乎可完全抑制。 几乎可完全抑制 抗新城疫病毒(NDV) 2、抗新城疫病毒(NDV) 2003年 王玉东等报道,发生新城疫后，在相同饲养条件下, 2003年，王玉东等报道,发生新城疫后，在相同饲养条件下,采取试验和对照治疗方 表明使用干扰素、抗生素和多维素治疗的集群停止死亡。 法,表明使用干扰素、抗生素和多维素治疗的集群停止死亡。 抗传染性法氏囊病病毒( 3、抗传染性法氏囊病病毒( IBDV) 2004年 李风华等报道,发病率为60 %26日龄肉鸡用囊病康 黄氏灵等中药治疗, 日龄肉鸡用囊病康、 2004年，李风华等报道,发病率为60 %26日龄肉鸡用囊病康、黄氏灵等中药治疗,效 果不明显,死亡率达12 ,后来用干扰素注射 后来用干扰素注射, 天死亡率降到2 ,第 天停止死亡, 果不明显,死亡率达12 % ,后来用干扰素注射,第2 天死亡率降到2 % ,第3 天停止死亡, 治愈率98 %。发生IBD 后使用IFN 的时间越早,效果越好。 治愈率98 %。发生IBD 后使用IFN 的时间越早,效果越好。 2001年 等报道,采用100LD50 的超强毒株HK46 感染38 日龄的SPF 2001年，Mo 等报道,采用100LD50 IBDV 的超强毒株HK46 感染38 日龄的SPF 鸡8h 肌肉注射或分别用011mgrGGIFN 后,再012mgrGGIFN - α肌肉注射或分别用011mgrGGIFN - α 进行肌肉注射和口服治 天后, 使用rGGIFN 的鸡可成活30 %～ ,而未使用干扰素的鸡群仅能成 疗, 7 天后, 使用rGGIFN -α的鸡可成活30 %～50 % ,而未使用干扰素的鸡群仅能成 %。 活10 %。 病毒( 、抗 病毒( IV) 2001年 夏春等克隆和鉴定了我国三黄鸡干扰素基因,并用QIAexpressIV 2001年，夏春等克隆和鉴定了我国三黄鸡干扰素基因,并用QIAexpressIV 原核表达 系在M15工程菌中表达了N′端含6 个组氨酸(6 M15工程菌中表达了N′端含 的融合蛋白。 系在M15工程菌中表达了N′端含6 个组氨酸(6 - His) 的融合蛋白。在鸡胚实验系中 抗禽流感病毒效果好。 6His - rGGIFN - α抗禽流感病毒效果好。 氏病( 、 氏病( D 2004年 李风华等报道,临床诊断为MD MD的病鸡 2004年，李风华等报道,临床诊断为MD的病鸡 ,用IFN 按500 只/ 瓶加白细胞介素 (500只 肌肉注射,3 天后鸡群状态好转,康复较好。 - 2 (500只/ 瓶) 肌肉注射,3 天后鸡群状态好转,康复较好。 、抗 是细胞介导免疫的重要免疫分子,不论是外源性IFN γ,还是内源性的 IFN - γ是细胞介导免疫的重要免疫分子,不论是外源性IFN - γ,还是内源性的 γ,都表现了强大的抗虫效应 外源性的IFN 都表现了强大的抗虫效应， 具有强大的抗感染效应, IFN - γ,都表现了强大的抗虫效应，外源性的IFN - γ具有强大的抗感染效应,内源 性的IFN - γ在阻止弓形虫增殖、促使休眠状态弓形虫包囊形成、防止包囊的活化突 性的IFN 在阻止弓形虫增殖、 促使休眠状态弓形虫包囊形成、 破等方面具有重要的作用。 破等方面具有重要的作用。
重组人干扰素生产工艺
重组人干扰素生产工艺一、简介重组人干扰素（Interferon）是一类重要的免疫调节蛋白，在生物制药领域具有广泛的应用，特别是在抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等方面。
重组人干扰素生产工艺是指利用基因工程技术，将人体细胞中制造干扰素的基因导入细菌、真菌或动植物细胞中，并通过发酵、提取等步骤最终制备重组人干扰素的过程。
本文将介绍重组人干扰素生产工艺的关键步骤、技术原理及优化方法。
二、生产工艺步骤1.基因克隆和表达载体构建：–选择适合的重组表达宿主菌，如大肠杆菌、毕赤酵母等。
–将编码重组人干扰素的基因克隆到表达载体中，构建表达载体。
–将表达载体导入宿主菌细胞中，实现干扰素基因的表达。
2.发酵过程：–设计合适的培养基，满足宿主菌的生长和表达需求。
–进行适当的培养条件控制，如温度、pH值、氧气供给等。
–监测培养过程中的生长情况和干扰素的表达水平。
3.重组人干扰素的提取与纯化：–通过离心、超滤等方法将细菌或细胞破碎，释放干扰素。
–采用亲和层析、离子交换层析等技术进行干扰素的纯化和富集。
–进行最终的纯化步骤，得到高纯度的重组人干扰素。
三、关键技术原理•基因克隆：利用PCR扩增目的基因，将其插入适当的表达载体中。
•表达调控：通过调控启动子、转录子等元件来控制干扰素基因的表达水平。
•蛋白质纯化：利用蛋白质的生物特性，如大小、电荷等，选用不同的层析技术进行纯化。
四、工艺优化方法1.菌种优化：选择高表达、稳定的宿主菌株，优化质粒结构。
2.培养条件优化：根据宿主菌的生长情况，调整培养基成分和培养条件。
3.表达调控：利用诱导剂、转录启动子等手段调控干扰素基因的表达水平。
4.提取纯化优化：优化破碎、纯化过程，提高干扰素的产率和纯度。
五、结论重组人干扰素的生产工艺是一项复杂而重要的技术，通过不断优化工艺流程和条件，可以提高干扰素的产量和纯度，满足临床和市场需求。
未来随着基因工程技术的不断发展，重组人干扰素生产工艺将进一步精细化和高效化，为人类健康带来更大的益处。