有机氯化物的酪氨酸酶处理技术_赵庆祥

华　东　理　工　大　学　学　报 Jour nal of E as t Chin a University of Science and T echnology Vol.24No.41998-08+国家自然科学基金资助项目(29577275)收稿日期:1998-02-25研究简报有机氯化物的酪氨酸酶处理技术+赵庆祥*　张　彤　史昕龙　黄　慧(华东理工大学环境工程系,上海200237) 提要:考察了反应时间、酶浓度(酶/酚)、pH 、底物化学结构及凝聚剂等因素对酪氨酸酶净化氯酚类化合物的效果。

反应24h,pH 为7.0,酶酚比为209U /mg 时,对氯酚的去除率可达90%以上,苯酚的去除率为85%,而间氯酚和邻氯酚的去除率仅25%左右,当加入凝聚剂后可显著提高氯酚类的去除效率。

关键词:造纸废水;有机氯化物;酪氨酸酶;氯酚中图分类号:X703 造纸漂白废水中含有包括二类在内的多种有害的有机氯化物[1,2],现有物理化学和生物方法的处理效果很不理想[3],近年来,人们转向酶处理技术的研究[4～7]。

目前能够用于造纸漂白废水处理的酶主要有三类:过氧化物酶[4～6]、酪氨酸酶[7,8]和漆酶[9]。

与过氧化物酶相比,酪氨酸酶不需要添加氧化剂,可直接利用溶解的分子氧使一元酚变成二元酚,形成邻苯醌,然后邻苯醌发生自身氧化反应,或成聚合物从废水中除去。

所以酪氨酸酶的处理工艺简单,成本低廉,受到研究者的关注[7,8,10],但与过氧化物酶相比,对酪氨酸酶的研究还不够深入。

本文选择苯酚和氯酚为模式化合物,研究用酪氨酸酶处理有机氯化物的效果和基本规律,并考察几种无机和有机凝聚剂对酶催化反应的影响。

氯酚和苯酚具有与二类相似的苯环结构,研究将为最终探寻二类的处理技术提供有益的借鉴。

1　材料与方法1.1　试剂酪氨酸酶,美国Sig ma Chemical Co.出品,活力:每m g 中3400U 以上。

苯酚、对氯酚、间氯酚和邻氯酚均为分析纯。

磷酸盐缓冲溶液,pH 5～9。

凝聚剂:HE 凝聚剂(1,6-己二胺环氧氯丙烷)、壳聚糖、聚丙烯酰胺和硫酸铝,均为试剂级。

1.2　试验方法取一定量已知浓度的人工配制废水于锥形瓶中,依次加入缓冲液、酪氨酸酶,置于恒温生化培养箱中,用磁力搅拌器进行搅拌,温度控制在(25±1)°C ,pH 为7.0。

反应一定时间后,取反应液进行分析。

1.3　分析方法・494・1.3.1　产物测定　酚类经酶处理后会形成有色物质,溶液由无色变为棕色,根据文献[7,8]用分光光度计在波长400nm 处进行测定,从消光度的变化确定反应进行的程度。

1.3.2　氯酚测定　用高效液相色谱直接测定底物浓度[7]。

2　结果与讨论2.1　反应时间对催化效率的影响酶催化反应一般随反应时间延长,反应愈彻底,但不同酶催化反应的时间特征不同,有的酶催化反应可以在几分钟到几十分钟完成(如过氧化物酶)[5],而有些酶类的催化反应则要很长时间(如漆酶)[10]。

本研究考察了酪氨酸酶催化对氯酚反应的时间特征。

试验条件如下:反应液酶浓度6.8U /mL,底物浓度分别为77.1m g/L 、38.5m g/L 、15.4m g/L 和7.71mg /L。

图1　时间对酪氨酸酶催化氯酚反应的影响Fig.1　Effect of reaction time on chlor opheno l remo val by tyrosinase 在400nm 波长下测定溶液的消光度(A )结果如图1所示,由图1可知,尽管底物浓度不同,但由于酶浓度相同,反应的初速度都一样,证明酪氨酸酶催化反应的初速度与酶浓度成比例,与底物浓度无关。

而反应的完全程度却与酶酚比有很大的关系,酶酚比愈大,达到反应完全的时间愈短,相反则长,如酶酚比为880(底物浓度为7.71mg /L),反应5h 接近完全,而酶酚比为172(底物浓度为38.5mg /L),反应接近完全则需要24h 。

2.2　酶浓度对催化效率的影响研究者对酪氨酸酶合适投加量的研究结果不一样[11]。

本文以对氯苯酚为底物,酶酚比在66.1～397范围内进行试验,结果见表1。

反应3h 溶液的消光度(即底物的转化率)几乎与酶浓度成正比,表明反应液中与酶相比,底物浓度很高,形成中间产物的速度取决于酶的浓度。

而反应10h 后,溶液的消光度出现明显差异,酶酚比(R )愈大(即酶分子愈多),底物转化率相应增加,对氯苯酚,酶酚比为200～400范围内反应才完全。

2.3　pH 值对酶催化反应的影响pH 影响酶促反应的原因是多方面的,如过酸过碱可使酶空间构象改变,酶失活。

根据过酸过碱的程度,酶可遭受可逆或不可逆失活。

又如pH 可改变底物的解离状态,影响它与酶的结合。

本文以对氯苯酚为底物,对酪氨酸酶催化反应的最佳pH 进行了研究。

试验结果表明(见图2),在pH 值5～9范围内,酪氨酸酶对对氯苯酚均有较高的转化率,随着pH 值的降低或升・495・第4期赵庆祥等:有机氯化物的酪氨酸酶处理技术 高,消光度有差异,但变化不大,可以认为,5～9是酪氨酸酶的稳定pH 值范围,最佳值为7。

表1　酶浓度对催化效率影响的反应条件和结果Table 1　T est Co ndition and r esults fo r catalyses effiency at differ ent concent rat ion o f enzym eN o.C enzyme /(U ・mL -1)C base matter /(g ・L -1)R /(U ・mg -1)A 400nm (3h )A 400nm (10h )15.1077.166.10.0900.16027.8277.11010.2720.800315.6477.12020.4800.800423.6477.13030.640 1.08530.6077.13970.780 1.08图2　pH 对酪氨酸酶催化反应的影响F ig .2　T he Effect o f pH on reaction catalyzed bytyr osinase J .Dec 用邻氯酚和间氯酚进行了试验,pH在4.5～8.5范围内酪氨酸酶对上述两种基质均有较高的转化率,最佳pH 也为7[10]。

相同的酶对不同的物质其稳定pH 值的范围和最佳pH 基本相同,说明pH 对酪氨酸酶催化氯酚反应的影响主要是酶空间构象改变,使酶失活。

这与过氧化物酶不同,过氧化物酶的最佳pH 主要与底物种类有关。

2.4　酶对不同基质的处理效果以苯酚、邻氯酚、间氯酚和对氯酚作为底物,研究了酪氨酸酶对不同物质的处理效果,结果见表2。

反应24h 后苯酚和对氯酚去除率最高,而三种氯酚去除率为:对氯酚>邻氯酚>间氯酚。

这一结果说明酪氨酸酶处理氯代酚类化合物时其去除率与物质结构有关,取代基的位置不同,处理效果也不同。

在本试验条件下,对氯酚的去除率大于94.8%,而间氯酚和邻氯酚的去除率分别为27.8%和25.4%。

表2　酪氨酸酶催化不同基质反应的试验结果Table 2　T est results fo r differ ent subtr acts using ty ro sina seS ubtractsC enzy me /(U ・mL -1)*C base ma tte r /(g ・L -1)R /(U ・mg -1)C after reaction /(g ・L -1)#Rem oval rate(%)Phen ol11.455.7205885.64-C hlorophenol16.177.1209Nodetection >94.82-C hlorophenol16.177.62075627.83-C hlorophenol 16.177.82075825.4 Reaction time is 24h ;Detection lim it is 4mg /L *Befere reaction ;#After reaction2.5　凝聚剂对酶催化反应的影响用壳聚糖为凝聚剂研究了其对酶催化间氯酚反应的影响。

试验先加酪氨酸酶反应24h ,再加别入50mg /L 的壳聚糖,搅拌0.5h,进行分析测定,结果发现单加入壳聚糖,间氯酚的去除・496・ 华　东　理　工　大　学　学　报第24卷率只有6.1%,而酶反应后再加入壳聚糖,间氯酚的去除率达到50.5%,比单用酶处理提高60%。

为了筛选合适的凝聚剂,用壳聚糖、HE 、聚丙烯酰胺和硫酸铝四种凝聚剂(投加量均为50m g/L)对酚类化合物酶处理后的有色溶液(A 400nm =0.389)进行试验。

结果表明,壳聚糖和HE 的效果明显优于聚丙烯酰胺和硫酸铝。

其原因是酶催化反应生成的有色中间化合物容易被胺基中氮原子上的孤对电子进攻,形成C-N 键[7]。

壳聚糖和HE 都是含胺基的阳离子凝聚剂,除吸咐作用外,还发生化学反应,与凝聚剂结合,因而具有比一般凝聚剂更高的净化效果。

HE 投加量对有色物质的去除效果如图3所示。

由图可知,HE 合适的投加量应为20～50m g/L,有色物质的去除率可达到95%以上。

图3　HE 投加量对反应产物去除的影响Fig.3　T he effect of HE co ncentr atio n on remo val ra te ofraction pro ducts3　结　论(1)利用酪氨酸酶和凝聚剂处理造纸废水中的有机氯化物是可行的。

本研究中对氯酚的最高去除率为94.8%以上。

(2)酚类物质的转化速率与酶/酚比有关,酶/酚比增大,转化速率提高。

在所研究的物质中,苯酚和对氯酚较容易去除。

酪氨酸酶处理氯酚类的最佳pH 值在7左右。

(3)酪氨酸酶对不同物质的催化作用是不同的,去除率按照对氯酚,苯酚,邻氯酚和间氯酚的顺序依次下降。

(4)加入凝聚剂能加快整个酶催化反应,提高底物的去除率。

四种凝聚剂中,含胺基的凝聚剂H E 和壳聚糖的效果最好。

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