氨基酸含量的测定-茚三酮比色法

氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)

茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。

称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。

取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。

储成于棕色瓶中，避光保存。

0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。

茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。

亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。

茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。

茚三酮鉴定氨基酸概述

茚三酮鉴定氨基酸概述1.茚三酮简介茚三酮(Ninhydrine),又称水合茚三酮,水合茚满三酮,为白色或浅黄色结晶性粉末。

茚三酮是一种用于检测氨或者一级胺和二级胺的试剂。

当与这些游离胺反应时，能够产生深蓝色或者紫色的物质，叫做Ruhemann紫。

茚三酮常用来检测指纹，这是由于指纹表面所蜕落的蛋白质和肽中含有的赖氨酸残基，其上的一级胺被茚三酮检测。

在室温条件下，它是一种白色的固体物质，溶于乙醇和丙酮。

茚三酮可以看作是是二氢茚-1，2，3-三酮的水合物。

1901 年,茚三酮被成功研制出来以后主要用于生物医学领域,1954年,瑞典科学家Oden 和Hofsten 将其应用于潜在汗液手印的显现。

茚三酮与汗液中的氨基酸、多肽、蛋白质等发生反应, 生成蓝紫色的手印纹线。

茚三酮也可以用于蛋白质的氨基酸分析。

除去脯氨酸之外的大多数氨基酸，水解之后可与茚三酮反应。

水解中某些氨基酸的侧链也会被降解。

因此对于那些与茚三酮不反应或者发生其他反应的氨基酸需要另作分析。

其余的氨基酸经过色谱分离后可以比色定量。

在分析化学反应的薄层色谱（TLC）中，它可以用于检测所有的胺类，氨基甲酸酯类，在经过充分热处理后可以检测酰胺类物质。

2.实际运用2.1指纹鉴别汗液手印中的汗液成分绝大多数是水(约99%以上),其余是少量的无机物和有机物,有机物中包括了人体所含有的各种氨基酸。

茚三酮与手印汗液中的氨基酸发生显色反应而现出手印。

二氧化碳中的碳原子来源于氨基酸当茚三酮与氨基酸反应时可以释放CO2的羧基碳。

在考古研究中，这个反应用于释放古老骨骼中羧基碳用于稳定同位素分析，以帮助重现古代生物的食物结构。

用一种标记底物处理的土壤，随后利用茚三酮与氨基酸的反应释放羧基胺，可以证明这种底物是否被吸收进微生物蛋白质。

这种方法成功的发现了一些氨氧化细菌（也叫做硝化细菌）利用土壤中的尿素作为碳源。

法医常用茚三酮溶液分析诸如纸张等多孔表面上的潜指纹。

手指所分泌的细微汗液聚集于独特的手指纹路表面，也即含有氨基酸的指纹，经过茚三酮处理可以将氨基酸指尖纹路变为可见的紫色。

茚三酮法测氨基酸

茚三酮法测氨基酸 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。

氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。

第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。

二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。

三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成L 溶液（2），2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。

用pH 检查校正。

（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。

（5）样品液：每毫升含～50μg 氨基酸。

茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入活性炭，轻轻搅拌。

加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。

次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。

还原型茚三酮按下法制备：称取茚三酮，用沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。

将维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。

滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。

乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。

四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取L 的标准氨基酸溶液0，，，，，于试管中，用水补足至1mL。

氨基酸含量的测定-茚三酮比色法

各是什么？
实验九氨基酸含量的测定（茚三酮比色法）
1. 实验原理
凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在 570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基酸含量成正比，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：
（3）通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎后的样品5g～10g或吸取液体样品5mL～10mL，置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和5g左右的活性炭，加热煮沸，过滤。用30mL～40mL热水洗涤活性炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至刻度线，摇匀备用。
6. 思考题（1）茚三酮法测定氨基酸的原理是什么？（2）试比较三种方法测定氨基酸含量的优缺点
2. 实验材料、仪器与试剂材料：酱油仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管。试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。
（3）样品测定
管号
8 9 10 11
样品溶液/mL 0 0.5 0.5 0.5
水/mL
1.6 1.1 1.1 1.1
磷酸盐缓冲液/mL 0.4 0.4 0.4 0.4
茚三酮/mL
0.4 0.4 0.4 0.4
按上表加样后混匀，按标准曲线的步骤进行实验，在相同条件下测定样品的吸光度，并在标准曲线上查（1）该法是微量法，对氨基酸的最低检出量可达0.5μg，其其灵敏度高，重现性好。（2）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，最大吸收波长在440nm处。

氨基酸总量的测定

氨基酸总量的测定(茚三酮比色法)一、方法原理：氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，可产生二酮茚一二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，据此可以比色测定氨基酸含量。

二、试剂：1．2％茚三酮溶液：1g茚三酮(C9H403·2H2O)溶于25ml热水中，加入40mg氯化亚锡；(SnCl2·2H2O)，搅拌溶解，滤去残渣，滹液放在冷暗处过夜，用水定容为50ml，保存声冷暗处。

如茚三酮有微红色，配成的溶液也带红色，将影响比色测定，需将茚三酮重结晶后再用方法是：取5g茚三酮溶于20ml热水中，加入0.2g活性炭，轻轻摇动，放三十分钟后过滤，滤液置冰箱中过夜，次日过滤，用1ml冷水淋洗结晶，然后放在干燥器中干燥，装瓶保存。

2。

磷酸盐缓冲液(pH8.0)：①1／15mol/l磷酸二氢钾溶液：取KH2P04 0.9070g溶于lOOml水中。

②1／15mol/l磷酸氢二钠溶液：取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)23.876g溶于水，加水至1000ml。

取①50ml与②95ml混匀即得。

3．10％醋酸：取lOml冰醋酸加水至lOOml。

4，氨基酸标准溶液(200ppm)：称取干燥的氨基酸(白氨酸，或其它的氨基酸)0.2000g溶解于水，定容为1000ml。

三、仪器：水浴，721分光光度计。

四、操作步骤：(一)标准曲线绘制：分别吸取氨基酸标准溶液(200ppm)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml各置于25ml容量瓶中,加水补充至4.0ml，各加入缓冲液lml，加入茚三酮lml，摇匀。

置沸水浴中加热15分钟，取出迅速冷却至室温，—用水定容。

放置15分钟，在570nm波长下测定，绘制标准曲线。

氨基酸浓度分别为0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.Oppm。

(二)样品测定：l提取样品：称取1.0 ~2.0g植物样品(新鲜样或干样)，加5m1 10％醋酸，在研钵中研碎，用水洗移入lOOml容量瓶，水定容，过滤到三角瓶中，取滤液测定。

氨基酸茚三酮反应

氨基酸茚三酮反应
氨基酸茚三酮反应，也称为米氏试验，是一种检测蛋白质中是否含有氨基酸的化学反应。

这个反应的原理是，当茚三酮在酸性环境下与氨基酸结合时，会发生显色反应，产生紫色或蓝色的化合物。

在实验中，首先要将待测的蛋白质加入一定量的酸性溶液中，使蛋白质分解成氨基酸。

然后加入一定量的茚三酮溶液，让它与氨基酸反应。

如果样品中存在氨基酸，则会发生显色反应，产生紫色或蓝色的化合物，而没有氨基酸的样品则不会出现颜色变化。

茚三酮反应的原理是基于氨基酸中存在α-羰基和氨基两个基团，它们在酸性条件下可以发生酸解离，使α-羰基上的羟基离去，形成不稳定的离子，并与茚三酮中的酮基发生亲核加成反应，生成产物并发生颜色变化。

这种反应的特点是比较敏感，只要氨基酸含量达到一定程度，就能够产生显色反应，因此适用于检测蛋白质中氨基酸含量的多少。

这种检测方法在生物化学实验中经常被使用，是一种常用的方法之一。

食品中氨基酸总量的测定实验报告

食品中氨基酸总量的测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定食品中氨基酸的总量，了解食品中蛋白质的营养价值，并掌握氨基酸总量测定的基本原理和方法。

二、实验原理氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。

食品中的氨基酸可以通过与某些试剂反应，产生可检测的物质，从而进行定量分析。

本实验采用茚三酮比色法测定氨基酸总量。

茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸加热反应，生成蓝紫色化合物，其颜色的深浅与氨基酸的含量成正比。

通过比色测定吸光度，与标准曲线对照，即可计算出样品中氨基酸的总量。

三、实验材料与设备1、实验材料待测食品样品（如鸡蛋、牛奶、肉类等）标准氨基酸溶液（已知浓度）茚三酮试剂磷酸缓冲液（pH 54）乙醇蒸馏水2、实验设备分光光度计恒温水浴锅容量瓶（100 mL、50 mL、25 mL 等）移液管（1 mL、2 mL、5 mL 等）具塞刻度试管（25 mL）漏斗滤纸四、实验步骤1、样品处理称取适量的待测食品样品，精确至 0001 g，置于研钵中研磨成匀浆。

将匀浆转移至容量瓶中，用蒸馏水多次冲洗研钵，洗液并入容量瓶中，定容至刻度，摇匀。

用滤纸过滤上述溶液，滤液备用。

2、标准曲线的绘制分别吸取 00 mL、02 mL、04 mL、06 mL、08 mL、10 mL 标准氨基酸溶液于 25 mL 具塞刻度试管中，用蒸馏水补充至 10 mL。

向各试管中加入 10 mL 磷酸缓冲液（pH 54）和 10 mL 茚三酮试剂，摇匀。

将试管置于沸水浴中加热 15 min，取出后迅速冷却至室温。

用蒸馏水定容至 25 mL，摇匀。

以蒸馏水为空白对照，在 570 nm 波长处测定各溶液的吸光度。

以氨基酸的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

3、样品测定吸取 10 mL 样品滤液于 25 mL 具塞刻度试管中，按照绘制标准曲线的步骤进行操作，测定样品溶液的吸光度。

五、实验结果与计算1、实验结果记录标准曲线各点的浓度和吸光度。

氨基酸的测定方法

肽键
蛋白质水解就是使蛋白质逐渐降成分子量越来越小的肽段，破坏肽键，直到最后成为氨基酸的混合物。（2）氨基酸分离原理氨基酸是两性电解质，在水中既起酸（质子供体）的作用，也起碱（质子受体）的作用。氨基酸在溶液中的存在形式：
氨基酸分离：
（2）氨基酸与茚三酮反应原理
3.试剂除注明外全部试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。（1）6 mol/L（0.5%巯基乙酸）盐酸溶液：优级浓盐酸与水以体积 1 比 1 混合，加入巯基乙酸 5 mL 混匀。（2）0.02 mol/L 的盐酸溶液：吸取 1 mL 的 6 mol/L 盐酸溶液，加入 300 mL 的蒸馏水，混匀即可。（3）BRIJ-35 溶液：25 g 溶于 100 mL 蒸馏水中。（4）缓冲溶液：（参考日立 L-8900 氨基酸自动分析仪）三菱化学公司生产的 MCI○L-8500 系列缓冲溶液，或根据下表配制缓冲溶液
PH-3 B3 0.20 1.02 700 13.31 — 3.74 12.80 4.0 — 5.0 4.00 4.0 1.0 0.1
PH-4 B4 1.20 1.06 700 26.67 — 54.35 6.10 — 5.0 — 4.00 4.9 1.0 0.1
PH-RG B6 0.20 1.00 700 — 8.00 — — 100.0 — — 4.00 1.0 0.1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
蒸馏水（约）柠檬酸钠（二水）氢氧化钠氯化钠柠檬酸（一水）乙醇苯甲醇硫代双乙醇
BRIJ-35 溶液 PH（标称）
总计（校准）辛酸
注：上表仅供参考。根据不同的仪器和不同的色谱柱，需要调整缓冲溶液的配方。（5）茚三酮溶液：日本和光纯药工业公司成套茚三酮试剂，或根据下表配制茚三酮试剂容器步骤试剂乙二醇独甲醚茚三酮氮气起泡，分解硼氢化钠氮气起泡密度蒸馏水醋酸钠冰醋酸乙二醇独甲醚总计氮气起泡密度蒸馏水乙醇总计密度（6）氮气（7）标准溶液配制购买的氨基酸原液（Fluka AAS18）中每种氨基酸的浓度为 2.50 μmol/mL。计量单位

茚三酮鉴定氨基酸概述

茚三酮鉴定氨基酸概述1.茚三酮简介茚三酮(Ninhydrine),又称水合茚三酮,水合茚满三酮,为白色或浅黄色结晶性粉末。

茚三酮是一种用于检测氨或者一级胺和二级胺的试剂。

当与这些游离胺反应时，能够产生深蓝色或者紫色的物质，叫做Ruhemann紫。

茚三酮常用来检测指纹，这是由于指纹表面所蜕落的蛋白质和肽中含有的赖氨酸残基，其上的一级胺被茚三酮检测。

在室温条件下，它是一种白色的固体物质，溶于乙醇和丙酮。

茚三酮可以看作是是二氢茚-1，2，3-三酮的水合物。

1901 年,茚三酮被成功研制出来以后主要用于生物医学领域,1954年,瑞典科学家Oden 和Hofsten 将其应用于潜在汗液手印的显现。

茚三酮与汗液中的氨基酸、多肽、蛋白质等发生反应, 生成蓝紫色的手印纹线。

茚三酮也可以用于蛋白质的氨基酸分析。

除去脯氨酸之外的大多数氨基酸，水解之后可与茚三酮反应。

水解中某些氨基酸的侧链也会被降解。

因此对于那些与茚三酮不反应或者发生其他反应的氨基酸需要另作分析。

其余的氨基酸经过色谱分离后可以比色定量。

在分析化学反应的薄层色谱（TLC）中，它可以用于检测所有的胺类，氨基甲酸酯类，在经过充分热处理后可以检测酰胺类物质。

2.实际运用2.1指纹鉴别汗液手印中的汗液成分绝大多数是水(约99%以上),其余是少量的无机物和有机物,有机物中包括了人体所含有的各种氨基酸。

茚三酮与手印汗液中的氨基酸发生显色反应而现出手印。

二氧化碳中的碳原子来源于氨基酸当茚三酮与氨基酸反应时可以释放CO2的羧基碳。

在考古研究中，这个反应用于释放古老骨骼中羧基碳用于稳定同位素分析，以帮助重现古代生物的食物结构。

用一种标记底物处理的土壤，随后利用茚三酮与氨基酸的反应释放羧基胺，可以证明这种底物是否被吸收进微生物蛋白质。

这种方法成功的发现了一些氨氧化细菌（也叫做硝化细菌）利用土壤中的尿素作为碳源。

法医常用茚三酮溶液分析诸如纸张等多孔表面上的潜指纹。

手指所分泌的细微汗液聚集于独特的手指纹路表面，也即含有氨基酸的指纹，经过茚三酮处理可以将氨基酸指尖纹路变为可见的紫色。

茚三酮显色原理

茚三酮显色原理
在加热条件及弱酸环境下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫蓝色(与天冬酰胺则形成棕色产物。

与脯氨酸或羟脯氨酸反应生成(亮)黄色)化合物及相应的醛和二氧化碳的反应。

茚三酮反应，即:所有氨基酸及具有游离α-氨基和α-羧基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生(亮)黄色物质。

此反应十分灵敏，根据反应所生成的蓝紫色的深浅，用分光光度计在570nm 波长下进行比色就可测定样品中氨基酸的含量(在一定浓度范围内，显色溶液的吸光率与氨基酸的含量成正比)，也可以在分离氨基酸时作为显色剂对氨基酸进行定性或定量分析。

在法医学上，使用茚三酮反应可采集嫌疑犯在犯罪现场留下来的指纹。

因为手汗中含有多种氨基酸，遇茚三酮后起显色反应。

植物生理生化实验【范本模板】

实验一植物组织游离氨基酸含量测定—茚三酮试剂显色法P199原理：游离氨基酸与茚三酮共热时能定量生成二酮茚—二酮茚胺，产物呈蓝紫色，称Rubemans紫.其吸收峰在570nm，且在一定范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量.①微酸、90℃：氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮。

②脱水：还原型茚三酮与另一分子茚三酮和一分子氨进行缩合脱水,生成二酮茚-二酮茚胺.材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。

实验步骤：分别取1g萌发、未萌发水稻于研钵中,加入5ml醋酸(使蛋白质变性,沉淀），研磨成匀浆后,用无氨蒸馏置于沸水中加热15min，取出用冷水迅速冷却并不时摇动，使之呈蓝紫色，用60％乙醇定容20ml，在570nm 波长下测定吸光度。

样品氨基态含氮量(ug/100g鲜重）=CV T/V S W ＊100 ;C=A/k (k=0.103) ; V T=100/2 ；V S=1 ；W=1注意事项：1.测定前所用的玻璃仪器要干燥，所用的蒸馏水必须为无氨水；2.样品要磨匀,用无氨蒸馏水定容，并用干燥滤纸过滤；3.抗坏血酸易被还原;加入的量要严格控制，因为还原剂抗坏血酸会与茚三酮反应；4.水浴锅的液面要高于试管内的液面,使其加热均匀，并在加热后几秒再塞上塞子，水浴锅温度要高于90℃，15min后取出迅速冷却，再加入60%乙醇;5.稀释后要迅速比色;6. 谷物等蛋白质样品可用酸水解法讲蛋白质水解后,用本法测定氨基酸含量，可计算出样品蛋白质含量；7. 反应要在无水、有机、微酸的环境下进行。

最适PH为4。

5,是乙醇-乙酸钠缓冲液和醋酸缓和后的PH。

思考题：1.茚三酮与所有氨基酸的反应产物都相同吗？为什么？不相同，因为有些氨基酸的结构不同，不含游离的氨基，如脯氨酸。

2.测定植物组织中游离氨基酸总量有何意义?可以测定植物对氮的根吸收，测定植物的病理和逆境状态和植物的营养、施肥指标等。

04-02-021茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤(精)

天津现代职业技术学院一、茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤1、试剂a) 茚三酮试剂：称取1.2g茚三酮，加l5mL正丙醇，摇动使其溶解。

然后加入30mL正丁醇，60mL乙二醇，混匀。

再加入9mLpH4.5的乙酸缓冲液，仔细混匀。

保存于棕色瓶中，置于冷凉处。

试剂适用期限为10 d。

b) 4mol/L pH4.5乙酸缓冲液：称取27.2g乙酸钠(NaAc·3H2O)于烧杯中，加80mL水溶解。

在电炉上加热至沸，冷至室温后，用冰乙酸调至pH 4.5，然后用煮沸冷却水稀释至l00mL。

c) 氨基酸标准液：准确称取在80～90℃下烘至恒重的亮氨酸46.8mg或α-丙氨酸31.8mg，加10％异丙醇溶解，并定容至100mL，混匀。

使用时，取此溶液5mL，用水稀释至50mL。

即成5μg氮/mL标准溶液。

d) 10g/L抗坏血酸溶液(制备液仅用一天)。

2、测定步骤标准曲线的绘制：取7支具塞试管，分别加入氨基酸标准液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL，各管均加水至2mL，再加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。

置沸水浴中加热15min。

取出后在间歇摇动下冷却15min。

加热时形成的红色茚满酮在冷却和摇动时被空气中氧氧化而褪色，而茚三酮与氨基酸形成的蓝紫色化合物变得更加鲜明。

以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀。

于580nm波长下测定吸光度。

以氨基氮量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标制绘标准曲线。

样品处理：准确称取新鲜样品0.5g(或干样品0.1g)置研钵中，加5mL10％乙酸溶液研磨至匀浆，然后用水转移到容量瓶中，并定容至100mL。

摇匀后过滤。

样品测定：吸取2mL滤液于具塞试管中，加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。

置沸水浴中加热15min，取出后在间歇摇动下冷却15min。

以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀，以试剂空白为对照，于580nm波长下测定吸光度。

植物生理生化实验

实验一植物组织游离氨基酸含量测定—茚三酮试剂显色法P199原理：游离氨基酸与茚三酮共热时能定量生成二酮茚-二酮茚胺，产物呈蓝紫色，称Rubemans紫。

其吸收峰在570nm，且在一定范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量。

①微酸、90℃：氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮。

②脱水：还原型茚三酮与另一分子茚三酮和一分子氨进行缩合脱水，生成二酮茚-二酮茚胺。

材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。

实验步骤：分别取1g萌发、未萌发水稻于研钵中，加入5ml醋酸（使蛋白质变性，沉淀），研磨成匀浆后，用无置于沸水中加热15min，取出用冷水迅速冷却并不时摇动，使之呈蓝紫色，用60%乙醇定容20ml，在570nm 波长下测定吸光度。

样品氨基态含氮量（ug/100g鲜重）=CV T/V S W *100 ；C=A/k (k=0.103) ；V T=100/2 ；V S=1 ；W=1注意事项：1.测定前所用的玻璃仪器要干燥，所用的蒸馏水必须为无氨水；2.样品要磨匀，用无氨蒸馏水定容，并用干燥滤纸过滤；3.抗坏血酸易被还原；加入的量要严格控制，因为还原剂抗坏血酸会与茚三酮反应；4.水浴锅的液面要高于试管内的液面，使其加热均匀，并在加热后几秒再塞上塞子，水浴锅温度要高于90℃，15min后取出迅速冷却，再加入60%乙醇；5.稀释后要迅速比色；6. 谷物等蛋白质样品可用酸水解法讲蛋白质水解后，用本法测定氨基酸含量，可计算出样品蛋白质含量；7. 反应要在无水、有机、微酸的环境下进行。

最适PH为4.5，是乙醇-乙酸钠缓冲液和醋酸缓和后的PH。

思考题：1.茚三酮与所有氨基酸的反应产物都相同吗？为什么？不相同，因为有些氨基酸的结构不同，不含游离的氨基，如脯氨酸。

2.测定植物组织中游离氨基酸总量有何意义？可以测定植物对氮的根吸收，测定植物的病理和逆境状态和植物的营养、施肥指标等。

测氨基酸含量的方法

测氨基酸含量的方法测氨基酸含量可不是一件简单的事儿呢。

有一种方法是茚三酮显色法。

这就像是一场神奇的化学反应魔法。

茚三酮这种东西就像一个侦探，专门和氨基酸打交道。

当它遇到氨基酸的时候，就会发生反应，然后变色。

我们可以把含有氨基酸的样品和茚三酮放在一起，在一定的条件下，比如说合适的温度、酸碱度这些，让它们充分反应。

反应完了之后，就会出现颜色变化。

然后我们可以用一个仪器，就像一个专门看颜色深浅的眼睛，去测量颜色的深浅程度。

颜色越深，就说明氨基酸的含量越高。

这就好像颜色是氨基酸含量的信号，我们通过解读这个信号来知道氨基酸有多少。

还有高效液相色谱法。

想象一下高效液相色谱仪就像一个超级复杂的赛道。

氨基酸们就像一个个小小的运动员，在这个赛道上奔跑。

我们把样品注射到这个仪器里，然后通过各种设置，比如流动相的选择、流速的控制等等，让氨基酸在赛道上按照不同的速度前进。

最后它们会一个一个地到达终点，被检测出来。

不同的氨基酸在这个过程中会有不同的表现，我们可以根据这些表现来计算出每种氨基酸的含量。

这就像一场精确的赛跑比赛，我们通过观察运动员的成绩来统计数据。

再说说氨基酸自动分析仪法。

这个仪器就像一个专门处理氨基酸的小工厂。

我们把样品送进去，它就会自动地进行一系列的操作。

它里面有各种复杂的部件，就像工厂里的机器一样。

这些部件会把氨基酸分离出来，然后进行检测。

它能非常精确地测量出氨基酸的含量，就像一个经验丰富的工人，能够把工作做得又快又好。

我记得在一个实验室里，他们要检测一种植物里的氨基酸含量。

他们先用茚三酮显色法做了一个初步的检测。

把植物样品处理好之后，和茚三酮混合在一起，然后在特定的温度下反应了一段时间。

等反应结束后，他们用分光光度计去测量颜色的变化。

通过颜色的深浅，他们大概知道了氨基酸的含量范围。

然后他们又用高效液相色谱法进行了更精确的测量。

他们仔细地准备样品，调整仪器的各种参数，让氨基酸在色谱柱里好好地“跑”一趟。

茚三酮比色法测定冻干药膳鸡汤中氨基酸含量

茚三酮比色法测定冻干药膳鸡汤中氨基酸含量◎侯旭南杨妍林川犇刘徐青霞本文利用茚三酮反应产生特征颜色，改变溶液的吸光度，采用可见光分光光度法对药膳鸡汤及其冻干粉中的氨基酸含量进行分析，建立快速评价冻干药膳鸡汤的新方法。

测定结果表明，茚三酮法测定冻干粉中氨基酸含量具有良好的线性（R2=0.9996），准确性（回收率98.51%～101.61%）。

12种冻干药膳鸡汤中氨基酸含量介于540～2510μg/ml之间；冻干药膳鸡汤中氨基酸含量随其煎煮时长和食盐的增加而提高。

中医药膳学是在中医理论指导下研究食药两用食材的理论及应用的学科，是中医学的一个重要组成部分，是在长期实践中积累逐渐形成的经验学科。

由于食疗药膳的传统烹饪方式商品化程度过低，无法满足快节奏时代的需要，导致其在现代社会的推广受限。

随着真空冷冻干燥技术成本的降低，冻干药膳产品有望实现产业化。

药膳鸡汤作为受众人群最为广泛的食疗药膳，是以药食两用的中药与鸡肉及天然调料熬煮而成。

《内经》记载，药膳鸡汤有益气温中、填精补虚、健脾胃、益五脏、强筋壮骨的功效，适用于营养不良、畏寒肢冷、易疲劳、月经不调等症状。

鸡肉营养丰富，蛋白质含量高，含有多种人体必须氨基酸。

以鸡肉为基础开发药膳鸡汤，并以现代冻干技术制备方便快捷的药膳鸡汤冻干粉可以实现营养、功能和便捷性的高度融合。

药膳冻干鸡汤的开发有利于药膳的推广和工业化生产，是药膳鸡汤未来研究和发展的趋势。

谷氨酸是酸性氨基酸，分子内含两个羧基增加了其在极性溶剂中的溶解能力，因此微溶于水。

谷氨酸几乎不溶于乙醚等非极性溶剂，也不溶于甲醇和乙醇。

谷氨酸作为食品行业常见的呈鲜物质之一，对鸡汤鲜味具有重要的贡献。

L-谷氨酸可作为药品参与大脑的蛋白质代谢，促进氧化，是人脑中重要的兴奋性神经递质。

本实验以谷氨酸为研究目标，利用谷氨酸与茚三酮反应生成特征颜色的原理，采用可见光分光光度法测定570nm 波长下溶液的吸光度，根据朗伯-比尔定律计算其中的游离氨基酸的含量。

氨基测定的实验报告

一、实验目的1. 掌握食品中氨基酸含量的测定方法。

2. 学习氨基酸提取、分离和检测的基本原理及操作技能。

3. 了解氨基酸在食品中的营养价值及对人体健康的重要性。

二、实验原理氨基酸是构成蛋白质的基本单元，对人体具有重要作用。

食品中氨基酸含量的测定方法有多种，本实验采用茚三酮比色法进行测定。

茚三酮比色法原理：氨基酸与茚三酮在碱性条件下发生反应，生成紫色复合物。

该复合物在特定波长下有最大吸收峰，其吸光度与氨基酸含量成正比。

通过测定吸光度，可以计算出食品中氨基酸的含量。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：食品样品（如鸡蛋、牛奶、豆腐等）、茚三酮试剂、NaOH溶液、标准氨基酸溶液等。

2. 仪器：紫外-可见分光光度计、电子天平、离心机、恒温水浴锅、移液器、试管等。

四、实验步骤1. 样品处理（1）称取适量食品样品，用蒸馏水溶解，配制成一定浓度的溶液。

（2）将溶液离心，取上清液备用。

2. 标准曲线绘制（1）取6个试管，分别加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的氨基酸标准溶液，加入1.0mL的NaOH溶液，混匀。

（2）向各试管中加入2.0mL的茚三酮试剂，混匀，置于恒温水浴锅中加热10分钟。

（3）取出试管，冷却至室温，用蒸馏水定容至10.0mL。

（4）以蒸馏水为空白，在570nm波长下测定各试管吸光度。

（5）以氨基酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 样品测定（1）取6个试管，分别加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的样品溶液，加入1.0mL的NaOH溶液，混匀。

（2）按照步骤2的操作，测定各试管吸光度。

（3）根据标准曲线，计算样品中氨基酸含量。

五、结果与分析1. 标准曲线绘制：以氨基酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，线性范围为0.0～1.0mg/mL。

2. 样品测定：根据标准曲线，计算样品中氨基酸含量，结果如下：（1）鸡蛋：氨基酸含量为2.5mg/g（2）牛奶：氨基酸含量为1.8mg/g（3）豆腐：氨基酸含量为3.0mg/g六、讨论与结论1. 实验结果表明，茚三酮比色法是一种简单、快速、准确的测定食品中氨基酸含量的方法。

氨基酸的茚三酮反应的原理

氨基酸的茚三酮反应的原理
氨基酸的茚三酮反应是一种常用的氨基酸分析方法，该方法能够测定氨基酸中的羧基含量。

该反应的原理是在碱性条件下，茚三酮（ninhydrin）与氨基酸的醛胺基（或酮胺基）发生氧化和加成反应，生成紫色或蓝色的产物。

茚三酮在这个反应中充当氧化剂和指示剂的角色。

具体反应机制如下：
1. 氨基酸的醛胺基（或酮胺基）与茚三酮发生加成反应，形成稳定的产物。

2. 茚三酮还同时氧化醛胺基（或酮胺基）为羧基。

3. 新生成的产物在碱性条件下呈现紫色或蓝色。

根据反应生成的紫色或蓝色产物的含量，可以间接测量氨基酸中的羧基含量。

该方法常用于氨基酸的定量分析、蛋白质含量测定等实验中。

氨基酸的测定实验报告

一、实验目的1. 了解氨基酸的基本性质和分类。

2. 掌握氨基酸的测定方法，包括茚三酮比色法和纸层析法。

3. 通过实验，学会运用化学分析方法测定氨基酸的含量。

二、实验原理氨基酸是构成蛋白质的基本单位，具有酸碱两性。

在酸性条件下，氨基酸可以与茚三酮反应生成紫色产物，通过比色法测定氨基酸含量。

纸层析法是一种分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，通过分析氨基酸在层析纸上的迁移距离，可以判断氨基酸的种类。

三、实验材料与仪器1. 试剂：茚三酮、氨基酸标准品、盐酸、无水乙醇等。

2. 仪器：分光光度计、电子天平、移液器、层析缸、层析滤纸等。

四、实验步骤1. 茚三酮比色法测定氨基酸含量（1）配制标准溶液：准确称取一定量的氨基酸标准品，用无水乙醇溶解，配制成一定浓度的标准溶液。

（2）样品处理：准确称取一定量的待测样品，用盐酸溶解，配制成一定浓度的样品溶液。

（3）反应：将标准溶液和样品溶液分别加入反应管中，加入等量的茚三酮，置于沸水浴中加热5分钟。

（4）比色：用分光光度计在570nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

（5）计算：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得氨基酸含量。

2. 纸层析法分离氨基酸（1）点样：将标准氨基酸和待测样品分别点在层析滤纸的原点处。

（2）层析：将点样的滤纸放入层析缸中，加入适量层析溶剂，使溶剂前沿距离滤纸底部约2cm。

（3）观察：待溶剂前沿到达滤纸底部后，取出滤纸，晾干，观察氨基酸在滤纸上的迁移距离。

（4）分析：根据氨基酸在滤纸上的迁移距离，判断氨基酸的种类。

五、实验结果与分析1. 茚三酮比色法测定氨基酸含量通过实验，得到了标准曲线，根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得氨基酸含量。

2. 纸层析法分离氨基酸通过实验，得到了标准氨基酸和待测样品在层析滤纸上的迁移距离，分析了氨基酸的种类。

六、实验总结1. 本实验成功掌握了氨基酸的测定方法，包括茚三酮比色法和纸层析法。

2. 通过实验，加深了对氨基酸性质和分类的认识。

氨基酸的茚三酮反应名词解释

氨基酸的茚三酮反应名词解释
茚三酮反应：
1. 概念：
茚三酮反应是一种有机化学反应，是将含氨基酸官能团的酸性脱氢物
与含有亚磷酰腙的有机物通过催化剂的作用，在低温下进行的反应。

这种反应可反映出氨基酸的酸性，可测定氨基酸的含量，也可以用来
鉴定氨基酸、比较氨基酸种类和含量。

2. 条件：
茚三酮反应一般要求反应温度低于80℃，最常用的温度一般很低，在25℃-60℃之间。

反应中所用催化剂一般都是硫酸钴和硫酸铝等酸性催
化剂，其中以硫酸钴为主。

3. 原理：
茚三酮反应的原理是氨基酸与含亚磷酰腙基团的有机反应制备茚三酮
类衍生物的反应机理。

该反应利用亚磷酰腙基团与氨基酸中苯丙氨酸
基团发生构象，dNAA及其他一般氨基酸发生酰脱氢作用，从而生成
茚三酮类衍生物，并在反应过程中形成一定量的硝酸盐、磷酸二氢钙，从而形成茚三酮衍生物。

4. 特点：
（1）反应过程简单，可以迅速完成。

（2）这种反应具有一定的特异性，只有酸性氨基酸和亚磷酰腙正确结合才能发生反应。

（3）反应过程可以温和控制，反应时间相对比较短，能有效地避免氨基酸的酶分解。

（4）还可以用于鉴定、定量分析复杂的氨基酸和蛋白质。

（5）反应产物可以通过波长廓线谱识别和酸度测定，可快速准确地测定含氨基酸的含量。