第四章 动物细胞制药1
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第4章生物技术制药
2、悬浮细胞
细胞的生长不依赖支持物表面，可在培 养液中呈悬浮状态生长。
3、兼性贴壁细胞
兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性 贴壁细胞。如CHO细胞、小鼠L929细胞。 贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤 维细胞的形态，而当悬浮于培养基中生长 时则呈圆形。
二、动物细胞的生理特点
1、细胞的分裂周期
2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选 （1）DNA导入动物细胞方法
融合法
细胞融合法化学法物源自法病毒法重组逆转录病毒
DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法
脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法
原生质融合法 染色体介导法
显微注射法 重组DNA病毒
基因枪法 多瘤病毒样颗粒
2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
四、基因工程细胞的构建和筛选
1. 真核细胞基因表达载体的构建 2. 基因载体的导入和高效表达工 程细胞株的筛选
1、真核细胞基因表达载体的构建
（1）载体种类： 病毒载体： 牛痘病毒：广泛用于构建成多价疫苗， 腺病毒：基因治疗载体 逆转录病毒：基因治疗载体 杆状病毒：成功地用于1000多种外源基 因的高效表达。
② 其次是对选出的细胞进行克隆和亚克隆使其纯化 ③ 最后利用其扩增系统，不断增加其基因拷贝数， 从而获得高效表达而稳定的工程细胞株。
五、细胞库的建立
1. 除原代细胞外，其它的细胞株、细胞系都 需要建细胞库加以保存。 2. 按照我国和美国FDA的规定，用于生产的 工程细胞必须建立两个细胞库： ① 原始细胞库（master cell bank， MCB） ② 生产用细胞库（manufacture's working cell bank，MWCB）或称工作细胞库（working cell bank， WCB）。
细胞的生长不依赖支持物表面，可在培 养液中呈悬浮状态生长。
3、兼性贴壁细胞
兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性 贴壁细胞。如CHO细胞、小鼠L929细胞。 贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤 维细胞的形态，而当悬浮于培养基中生长 时则呈圆形。
二、动物细胞的生理特点
1、细胞的分裂周期
2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选 （1）DNA导入动物细胞方法
融合法
细胞融合法化学法物源自法病毒法重组逆转录病毒
DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法
脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法
原生质融合法 染色体介导法
显微注射法 重组DNA病毒
基因枪法 多瘤病毒样颗粒
2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
四、基因工程细胞的构建和筛选
1. 真核细胞基因表达载体的构建 2. 基因载体的导入和高效表达工 程细胞株的筛选
1、真核细胞基因表达载体的构建
（1）载体种类： 病毒载体： 牛痘病毒：广泛用于构建成多价疫苗， 腺病毒：基因治疗载体 逆转录病毒：基因治疗载体 杆状病毒：成功地用于1000多种外源基 因的高效表达。
② 其次是对选出的细胞进行克隆和亚克隆使其纯化 ③ 最后利用其扩增系统，不断增加其基因拷贝数， 从而获得高效表达而稳定的工程细胞株。
五、细胞库的建立
1. 除原代细胞外，其它的细胞株、细胞系都 需要建细胞库加以保存。 2. 按照我国和美国FDA的规定，用于生产的 工程细胞必须建立两个细胞库： ① 原始细胞库（master cell bank， MCB） ② 生产用细胞库（manufacture's working cell bank，MWCB）或称工作细胞库（working cell bank， WCB）。
第四章 动物细胞制药
1、 贴壁培养 分散的贴壁依赖性细胞悬浮在培养瓶中很快(几十 分钟至几小时)就贴附在瓶壁上， 称为细胞贴壁， 贴壁后的细胞形态形成多态性， 呈单层生长， 所以此法又叫单层细胞培养。单层培养的细胞保 持接触抑制的特性。 优点：适用的细胞种类多；可采用灌流方式进行 高密度培养。 缺点：需较大面积和贴附材料；培养条件难以均 衡。传代培养时需用胰酶等将细胞从基质上消化 下来。
脂质体介导法：
DNA导入动物细胞的常用方法
融合法 细胞融合法 化 学 法 DNA—磷酸钙 沉淀法 脂质体介导法 DEAE—葡 聚糖法 原生质融合法 染色体介导法 微细胞介导法 鬼影红细胞介导法 物 理 法 电穿孔法 显微注射法 基因枪法 病 毒 法 重组逆转录病毒 介导法 重组DNA 病毒介导法 多瘤病毒样 颗粒介导法
2、二倍体细胞系：细胞群中染色体数 目与原供体二倍体细胞相同或基本相 同，可进行有限培养，具有贴壁依赖 性和接触抑制现象，无致瘤性。
３、转化细胞系：即无限细胞系 自发或诱导形成：正常细胞的培养传 代过程中发生染色体断裂或异倍化； 或人为地应用某些病毒和化学试剂诱 导获得。 由肿瘤细胞建立的细胞系全部为转化 细胞。 培养条件和要求简单，繁殖快，利于 大规模生产。
灭菌： 物理消毒：紫外线、干热、高压高温、过 滤等 化学消毒：消毒剂、抗菌素等 目的: 防止微生物污染。
2、水的处理： 方法：蒸馏、离子交换、电渗析、中空纤维过 滤等 目的：去除有毒元素、金属离子、微生物 3、pH的调整： 理想的pH应为7.2~7.4，整个培养过程不高于 7.6，低于6.8可限制细胞增殖。 控制pH的方法：使用pH电极； 使用各种缓冲 液系统。
1962年 动物细胞大规模培养技术起步 1975年 Sato无血清培养细胞获得成功 1975年 Kohler和Milstein成功构建了 杂交瘤细胞 1989年 Konstantinovti首次提出大规 模细胞培养过程中生理状态控制
动物细胞工程制药
动物细胞工程制药导语动物细胞工程制药是一种利用动物细胞进行生物制药的技术。
该技术已经取得了显著的进展，并在医药领域发挥着重要作用。
本文将介绍动物细胞工程制药的原理、应用和前景。
一、动物细胞工程制药的原理动物细胞工程制药是利用动物细胞系统表达和生产药物的一种技术。
其主要原理包括以下几个步骤：1.动物细胞培养：首先需要选择合适的动物细胞系，并进行培养。
常见的动物细胞系包括CHO细胞、HEK293细胞等。
细胞培养的条件包括培养基、培养温度、培养时间等。
2.基因克隆和转染：将药物的基因通过基因克隆技术导入到动物细胞中，使其具有产生目标药物的能力。
转染的方式包括质粒转染、病毒转染等。
3.细胞培养和增殖：转染后的细胞需要在培养条件下进行生长和增殖。
通常会添加适当的生长因子和培养基来促进细胞的生长。
4.产物分离和提纯：最后，通过适当的方法分离和提纯目标药物，可以使用离心、超滤、层析等技术进行分离纯化。
二、动物细胞工程制药的应用动物细胞工程制药已经广泛应用于医药领域，为药物的研发和生产提供了重要的技术支持。
其主要应用包括以下几个方面：1.蛋白质药物生产：利用动物细胞工程制药技术可以生产多种重要的蛋白质药物，如抗体、细胞因子等。
这些蛋白质药物在治疗癌症、免疫性疾病等方面具有重要作用。
2.疫苗生产：动物细胞工程制药技术也可以用于疫苗的生产。
通过导入相应的病原体基因到动物细胞中，使其产生病原体相关的抗原，从而制备疫苗。
3.基因治疗：动物细胞工程制药技术还可以用于基因治疗。
通过将目标基因导入到患者的细胞中，实现对基因相关疾病的治疗。
4.抗病毒药物：某些动物细胞工程技术还可以用于抗病毒药物的生产。
通过将抗病毒基因导入到动物细胞中，使其产生抗病毒蛋白，从而对抗病毒感染。
三、动物细胞工程制药的前景随着基因工程和生物技术的不断发展，动物细胞工程制药在未来的前景十分广阔。
以下是动物细胞工程制药的一些未来发展趋势：1.技术的进一步成熟：随着技术的不断发展，动物细胞工程制药技术将变得更加成熟，能够更准确、高效地生产药物。
生物技术Biotechniques.pdf
流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有 毒废物的积累。
细胞培养制药工艺
细胞系
3、蛋白质糖基化与分泌表达
蛋白质合成场所：粗糙内质网上的核糖体
糖基化场所：内质网合成各种糖类，粗糙内质 网腔内和高尔基体，加工修饰。
不同细胞系糖基化特征不同，选择适宜细胞 系。
对于分泌型蛋白，分泌泡与细胞膜融合，释放 到胞外，完成了蛋白质的分泌表达。
细胞培养制药工艺
细胞系
4.1.3 生产用细胞系
1. 人源细胞系
Namalwa：
类淋巴母细胞，非整体，悬浮生长。
英国Wellcome公司：Sendai病毒诱导，大规模生产 α干扰素，批准上市。产品逐渐淘汰。
细胞培养制药工艺
细胞系
动物细胞培养的应用
作为反应器用于制药：EPO，tPA 作为宿主细胞用于制药：病毒性疫苗 杂交瘤细胞：单克隆抗体，诊断、治疗 组织再生与器官移植（个体克隆）： 本身作为产品：皮肤移植，干细胞治疗 药学研究应用：分子与细胞药理、毒理、代谢 生命科学研究：器官发生，细胞、分子、遗传学
细胞培养制药工艺
细胞系
3.有限细胞系Finite cell line
概念:生长和寿命有限的细胞系。二倍体细胞系 特点：多次传代培养，失去增殖能力，老化死亡。 寿命：取决于细胞来源的物种和年龄、器官。 人细胞最高培养次数为50－60代。 胚成纤维细胞：人，50代；鸡胚，30代；小鼠，8代。
细胞培养制药工艺
生产特征
3.天然结构与活性的药物
完善的翻译后蛋白质修饰功能 游离核糖体：合成细胞质基质内的蛋白质。 与膜结合的核糖体：合成分泌性和膜整合蛋 白，多数为糖蛋白。 修饰：内质网加工，高尔基体加工、转运、分 泌，糖链。糖基化、磷酸化、酰胺化等。 活性分子：装配折叠形成精确的三维结构。
细胞培养制药工艺
细胞系
3、蛋白质糖基化与分泌表达
蛋白质合成场所：粗糙内质网上的核糖体
糖基化场所：内质网合成各种糖类，粗糙内质 网腔内和高尔基体，加工修饰。
不同细胞系糖基化特征不同，选择适宜细胞 系。
对于分泌型蛋白，分泌泡与细胞膜融合，释放 到胞外，完成了蛋白质的分泌表达。
细胞培养制药工艺
细胞系
4.1.3 生产用细胞系
1. 人源细胞系
Namalwa：
类淋巴母细胞，非整体，悬浮生长。
英国Wellcome公司：Sendai病毒诱导，大规模生产 α干扰素，批准上市。产品逐渐淘汰。
细胞培养制药工艺
细胞系
动物细胞培养的应用
作为反应器用于制药：EPO，tPA 作为宿主细胞用于制药：病毒性疫苗 杂交瘤细胞：单克隆抗体，诊断、治疗 组织再生与器官移植（个体克隆）： 本身作为产品：皮肤移植，干细胞治疗 药学研究应用：分子与细胞药理、毒理、代谢 生命科学研究：器官发生，细胞、分子、遗传学
细胞培养制药工艺
细胞系
3.有限细胞系Finite cell line
概念:生长和寿命有限的细胞系。二倍体细胞系 特点：多次传代培养，失去增殖能力，老化死亡。 寿命：取决于细胞来源的物种和年龄、器官。 人细胞最高培养次数为50－60代。 胚成纤维细胞：人，50代；鸡胚，30代；小鼠，8代。
细胞培养制药工艺
生产特征
3.天然结构与活性的药物
完善的翻译后蛋白质修饰功能 游离核糖体：合成细胞质基质内的蛋白质。 与膜结合的核糖体：合成分泌性和膜整合蛋 白，多数为糖蛋白。 修饰：内质网加工，高尔基体加工、转运、分 泌，糖链。糖基化、磷酸化、酰胺化等。 活性分子：装配折叠形成精确的三维结构。
《动物细胞制药》课件
1 挑战
动物细胞培养的成本较高，细胞污染和变异性是制约其应用的主要问题。
2 机遇
随着技术的进步，细胞培养和基因工程的发展给动物细胞制药带来了创新机遇。
动物细胞制药的未来发展趋势
个性化药物
动物细胞制药将越来越多地 用于个体化治疗，根据患者 的基因组信息生产定制药物。
细胞工程技术
细胞工程技术的发展将为动 物细胞制药提供更多的途径 和方法，不断拓展其应用领 域。
纳米技术
纳米技术的应用将改变药物 的传输和释放方式，提高药 物的疗效和安全性。
动物细胞制药的潜在风险和监管措施
1
风险
动物细胞制药可能存在风险，如免疫
监管措施
2
原性、感染风险等，需加强监测和安 全评估。
相关监管机构应加强动物细胞制药的
监管，确保其质量和安全性。
3
关键因素
成功的动物细胞培养需要控制细胞密度、培养基组分、培养温度、培养pH值等 多个关键因素。
动物细胞制药的应用领域
生物药物
动物细胞制药在生物药物生产中起着重要作用，包括抗体、疫苗、生长因子等。
诊断试剂
动物细胞制药广泛应用于制备各种诊断试剂，如血清学试剂、酶联免疫吸附试剂等。
基因工程产品
动物细胞制药在基因工程产品的生产中具有重要意义，如重组蛋白、基因治疗等。
பைடு நூலகம்
常见的动物细胞制药产品
单克隆抗体
单克隆抗体是一类重要的生物 药物，常用于治疗癌症、自身 免疫性疾病等。
重组蛋白
重组蛋白是通过基因工程技术 制备的蛋白质，用于治疗多种 疾病，如糖尿病、血友病等。
疫苗
疫苗是预防传染病的重要手段， 动物细胞制药可用于生产多种 疫苗，如流感疫苗、乙肝疫苗 等。
动物细胞培养的成本较高，细胞污染和变异性是制约其应用的主要问题。
2 机遇
随着技术的进步，细胞培养和基因工程的发展给动物细胞制药带来了创新机遇。
动物细胞制药的未来发展趋势
个性化药物
动物细胞制药将越来越多地 用于个体化治疗，根据患者 的基因组信息生产定制药物。
细胞工程技术
细胞工程技术的发展将为动 物细胞制药提供更多的途径 和方法，不断拓展其应用领 域。
纳米技术
纳米技术的应用将改变药物 的传输和释放方式，提高药 物的疗效和安全性。
动物细胞制药的潜在风险和监管措施
1
风险
动物细胞制药可能存在风险，如免疫
监管措施
2
原性、感染风险等，需加强监测和安 全评估。
相关监管机构应加强动物细胞制药的
监管，确保其质量和安全性。
3
关键因素
成功的动物细胞培养需要控制细胞密度、培养基组分、培养温度、培养pH值等 多个关键因素。
动物细胞制药的应用领域
生物药物
动物细胞制药在生物药物生产中起着重要作用，包括抗体、疫苗、生长因子等。
诊断试剂
动物细胞制药广泛应用于制备各种诊断试剂，如血清学试剂、酶联免疫吸附试剂等。
基因工程产品
动物细胞制药在基因工程产品的生产中具有重要意义，如重组蛋白、基因治疗等。
பைடு நூலகம்
常见的动物细胞制药产品
单克隆抗体
单克隆抗体是一类重要的生物 药物，常用于治疗癌症、自身 免疫性疾病等。
重组蛋白
重组蛋白是通过基因工程技术 制备的蛋白质，用于治疗多种 疾病，如糖尿病、血友病等。
疫苗
疫苗是预防传染病的重要手段， 动物细胞制药可用于生产多种 疫苗，如流感疫苗、乙肝疫苗 等。
生物制药工程：第四章-动物细胞工程制药
② 必须有足够的营养供应，绝对不可有有害的物质， 避免即使是极微量的有害离子的掺入；
③ 保证有适量的氧气供应； ④ 需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物； ⑤ 有良好的适于生存的外界环境； ⑥ 及时分种，保持合适的细胞密度；
一、动物细胞的培养条件
1. 器材的清洗和消毒
Sterilization, disinfection: • Spraying Alcohol • UV light • Autoclave • Irradiation • Dry heating • Bleaching?
该细胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用 BME （Eagle’s basal medium）加小牛血清，pH控 制 在7.2。细胞的倍增时间为24h，有限寿命为50 代， 上世纪60年代被广泛用于制备疫苗。
（2）BHK-21：
1961年从5只生长1天的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。 现在广泛采用的是1963年用单细胞分离的方法经 13次的克隆的细胞。
2.基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
DNA导入动物细胞的常用方法
融合法
化学法
物理法
病毒法
细胞融合法 DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法
脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法 显微注射法
原生质融合法 染色体介导法
基因枪法
微细胞介导法
鬼影红细胞介导法
细胞融合法: cell fusion 脂质体介导法: liposome mediated gene transfer 原生质融合法: protoplast fusion 微细胞介导法: microcell mediated method 鬼影红细胞介导法: ghost mediated method
成纤维细胞,通常用的培养基 为DMEM培养基，添加7%胎 牛血清。过去多用于增殖病毒， 包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和 狂犬病疫苗，现在已被用于构 建工程细胞。
③ 保证有适量的氧气供应； ④ 需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物； ⑤ 有良好的适于生存的外界环境； ⑥ 及时分种，保持合适的细胞密度；
一、动物细胞的培养条件
1. 器材的清洗和消毒
Sterilization, disinfection: • Spraying Alcohol • UV light • Autoclave • Irradiation • Dry heating • Bleaching?
该细胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用 BME （Eagle’s basal medium）加小牛血清，pH控 制 在7.2。细胞的倍增时间为24h，有限寿命为50 代， 上世纪60年代被广泛用于制备疫苗。
（2）BHK-21：
1961年从5只生长1天的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。 现在广泛采用的是1963年用单细胞分离的方法经 13次的克隆的细胞。
2.基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
DNA导入动物细胞的常用方法
融合法
化学法
物理法
病毒法
细胞融合法 DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法
脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法 显微注射法
原生质融合法 染色体介导法
基因枪法
微细胞介导法
鬼影红细胞介导法
细胞融合法: cell fusion 脂质体介导法: liposome mediated gene transfer 原生质融合法: protoplast fusion 微细胞介导法: microcell mediated method 鬼影红细胞介导法: ghost mediated method
成纤维细胞,通常用的培养基 为DMEM培养基，添加7%胎 牛血清。过去多用于增殖病毒， 包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和 狂犬病疫苗，现在已被用于构 建工程细胞。
项目四 章动物细胞制药
传代培养：将培养细胞从培养器中取出，把 一部分移至新的培养器中再进行培养。 原代培养形成的单层细胞汇合以后，需 要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不 足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将 影响细胞的生长 。 1、有限细胞系 2、连续细胞系
四、动物细胞培养的营养条件 特点： 1、细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养 时需要抗生素； 2、动物细胞较微生物大得多，无细胞壁， 机械强度低，适应环境能力差； 3、培养过程需氧量少，且不耐受强力通风 与搅拌；
第一节 ห้องสมุดไป่ตู้胞培养技术
细胞培养条件： 1、营养 2、生长环境
（一）动物细胞培养技术
动物细胞体外培养具有明显的表达产物 方面的优点，为传统的微生物发酵技术所 无法替代。其中以它们转录后修饰和产物 胞外分泌表达最为人们所感兴趣。
二、动物细胞培养特征
贴壁依赖性细胞 非贴壁依赖性细胞 兼性贴壁依赖性细胞
4、在机体中，细胞相互粘连以集群形式存 在，培养过程具有群体效应、锚地依赖性、 接触抑制性及功能全能性； 5、培养过程产物分布于细胞内外，反应过 程成本较高，但产品价格昂贵 6、大规模培养时，不可套用微生物反应的 经验： 7、原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。
培养基组成 1、天然培养基 血清 水解乳蛋白 胚胎浸液等 2、合成培养基 氨基酸 维生素 糖 无机盐等 加10%-20%血清 血清的优点？ 缺点？ 无血清培养基
单抗人源化 主要困难 （1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细 胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细 胞不稳定，易丧失抗体分泌能力； （2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说， 高度免疫获得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行 的； （3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交 瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的， 但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。
生物技术制药_04-动物细胞工程制药
动物细胞工程制药
动物细胞培养技术
动物细胞培养器具
动物细胞工程制药
动物细胞培养技术
动物细胞的培养条件
清洁无菌、无污染的环境 —— 无菌操作要求高 适宜的温度 —— 细胞对温度变化敏感 溶解氧、CO2、pH 值 —— 影响细胞内的酸碱平衡 营养成分 —— 培养基成分复杂
细胞质（cytoplasm）
细胞核（nucleus）
胞外基质（extracellular matrix）
动物细胞工程制药
动物细胞的生理特性
细胞的全能性（totipotency）
分化的细胞保留着全部的核基因组，具有全套遗传信息，具 有发育成完整个体的潜能
证明：克隆羊 Dolly 的诞生
动物细胞工程制药
细胞核移植技术
体细胞克隆 —— Dolly 的诞生
取一只 6 岁大的妊娠 Finn Dorset 母羊乳腺细胞作为核供体， 体外培养 3～6 代
注射促性腺素释放激素（GnRH）促使 Scottish Blackface 母 羊排卵，于注射后 28～33 h 取卵母细胞，尽快去核，并在特 定缓冲液中恢复，然后转入 37 oC 的 M2 培养基中，在 5 天内 使培养基中血清从 10% 降到 0.5%，使细胞停止在 G0 期
优点
容易更换培养液，毋需过滤 便于采用灌流式培养，能提高细胞密度 细胞能更加高效表达产品 扩大培养较困难 传代必须采用蛋白酶等消化处理 不能有效监测细胞生长
缺点
动物细胞工程制药
细胞工程制药[优质内容]
![细胞工程制药[优质内容]](https://img.taocdn.com/s3/m/e2dd725dc1c708a1294a4440.png)
二氧化碳的作用：细胞生长 需要、维持pH值。
精制课件
16
（4）倒置显微镜
精制课件
17
（5）纯化水装置
精制课件
18
动物细胞的培养基
动物细胞的培养基组成----氨基酸、葡萄糖、蛋白质、核酸类 物质、维生素、辅酶、激素、生长因子、微量元素、缓冲系统。
1、培养细胞的生存环境和培养液要求 2、天然培养基 3、合成培养基 4、无血清培养基
合成培养基--是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成 的。如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
优点--标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。
缺点--缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。目前常用合成培养 基＋血清来培养细胞
合成培养基的类型： （A）Eagle培养基（内含13种氨基酸、9种维生素、多种无机盐） （B）Ham氏F10培养基（内含20种氨基酸、多种维生素、10种无机盐） （C）199培养基 （D）Waymouth氏MB752/1培养基 （E）NCTC109培养基
精制课件
2
微生物、动物、植物细胞培养特性
细胞种类
细胞大小（um）
微生物细胞
1~10
植物细胞
20~300
动物细胞
10~100
倍增时间（h）
0.3~5
大于12
大于15
营养要求
简单
复杂
复杂
对剪切力
不敏感
敏感
敏感
光照要求
不要求
要求
不要求
主要产物
氨基酸、抗生素、 色素、次生代 疫苗、抗体、多
核苷酸、有机酸 谢产物
精制课件
12
动物细胞培养所需 仪器设备
精制课件
16
（4）倒置显微镜
精制课件
17
（5）纯化水装置
精制课件
18
动物细胞的培养基
动物细胞的培养基组成----氨基酸、葡萄糖、蛋白质、核酸类 物质、维生素、辅酶、激素、生长因子、微量元素、缓冲系统。
1、培养细胞的生存环境和培养液要求 2、天然培养基 3、合成培养基 4、无血清培养基
合成培养基--是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成 的。如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
优点--标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。
缺点--缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。目前常用合成培养 基＋血清来培养细胞
合成培养基的类型： （A）Eagle培养基（内含13种氨基酸、9种维生素、多种无机盐） （B）Ham氏F10培养基（内含20种氨基酸、多种维生素、10种无机盐） （C）199培养基 （D）Waymouth氏MB752/1培养基 （E）NCTC109培养基
精制课件
2
微生物、动物、植物细胞培养特性
细胞种类
细胞大小（um）
微生物细胞
1~10
植物细胞
20~300
动物细胞
10~100
倍增时间（h）
0.3~5
大于12
大于15
营养要求
简单
复杂
复杂
对剪切力
不敏感
敏感
敏感
光照要求
不要求
要求
不要求
主要产物
氨基酸、抗生素、 色素、次生代 疫苗、抗体、多
核苷酸、有机酸 谢产物
精制课件
12
动物细胞培养所需 仪器设备
第四章动物细胞工程制药(1)_生物技术制药
二、生产用动物细胞的获得
1. 2. 3. 4. 5.
原代细胞 二倍体细胞 转化细胞系 融合细胞系 重组工程细胞系
原代细胞
最无争议的细胞，但费时，费力，成本高，如： 鸡胚细胞，原代兔肾或鼠肾细胞，淋巴细胞等；
2. 二倍体细胞 二倍体细胞：
原代细胞的驯化产物，仍具正常细胞的特点： 2n核型，贴壁依赖，接触抑制，有限增殖（50 代以内），无致瘤性。代表性细胞株：WI－ 38， MRC-5，2BS；
各类细胞周期时间表
细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象： 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象： 在玻璃、塑料等基质上生长，与电荷、 在玻璃、塑料等基质上生长，与电荷、钙镁 离子、贴附因子（ 离子、贴附因子（collagen， Fibronectin） ， ） 有关。 有关。 无血清培养基： 无血清培养基：少！
使用前处理
灭活处理，即56℃ 30分钟。灭活的目的使去除血清中的补体成分。
储存条件
血清一般储存在 -20℃，同时应避免反复冻融。购买大包装的血清后 首先要灭活处理，然后分装成小包装，储存于-20℃ ，使用前融化。 融化时最好现置于 4℃ 。融化后的血清在 4℃不宜长时间存放，应尽 快使用。
细胞质 细胞壁 代表生物
第二节 动物细胞的形态与生理特性
1. 贴壁细胞的生长特征
成纤维细胞
人胃腺癌细胞
2. 悬浮细胞的生长特征
白细胞细胞：K562
腹水瘤细胞：Ehrlich腹水瘤细胞EAC
3. 兼性贴壁细胞
CHO-K1
CHO－K1
动物细胞的化学组成与代谢
大分子： 蛋白质 核酸 糖 脂质
大分子代谢的三个阶段
原始细胞库：master cell bank, MCB 生产细胞库: manufacturer’s working bank, MFWB; Working cell bank (WCB)
7第四章 动物细胞工程制药(一)
• 特点：染色体组型是2n核型；有明显 的贴壁和接触抑制特性；有限的增殖 能力（可传代培养50代）；无致瘤性。
第四章 动物细胞制药（一） 21
转化细胞系
• 通过转化形成，变成了异倍体，有无限增 殖能力。 • 转化可自发，在传代过程中自己转变成可 无限增殖的细胞； • 也可人为转化，采用某些试剂处理，或从 动物的肿瘤组织中建立的细胞系。 • 优点：无限传代、倍增时间短、对培养条 件和生长因子的要求低，适合于大规模工 业化生产。
第四章 动物细胞制药（一） 28
常用生产用动物细胞的特性 • SP2/0-Ag14：通过融合的方法，从
有羊抗红细胞活性的BALB/c小鼠的脾 细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合杂 交瘤SP2/NL-Ag亚克隆中分离获得。 • 能耐受8氮鸟嘌呤 20μg/ml,但在含 HAT 选择培养基中不能存活。 • 通常用培养基为DMEM，添加10%胎牛血 清。 • 用于生产单抗杂交瘤细胞和抗体。
第四章 动物细胞制药（一） 30
基因工程细胞的构建和筛选
• 在生产中采用更多的更有前景的是 融合细胞及采用基因工程构建的各 种工程细胞。 • 被用构建工程细胞的动物细胞有： CHO-dhfr 、BHK-21、 Namalwa、 Vero、 SP2/0、 Sf-9 等细胞。
第四章 动物细胞制药（一） 31
第四章 动物细胞制药（一） 39
细胞库的建立 • 除原代细胞外，其他细胞株、 细胞系，包括二倍体、转化细 胞、融合细胞和工程细胞都需 建立细胞库保存。
第四章 动物细胞制药（一）
40
细胞库的建立
• 按照我国和美国FDA的规定，用于生产的工 程细胞必须建立两个细胞库：原始细胞库 和生产用细胞库。 • 原始细胞库应有详细档案包括： 1、该细胞系的历史：来源、动物的年龄 和性别、细胞分离的方法和所用的培养材 料。 2、该细胞的特性：形态、生长特性。 3、对各种有害因子的检查结果，细菌、 真菌、支原体和各种病毒。
第四章 动物细胞制药（一） 21
转化细胞系
• 通过转化形成，变成了异倍体，有无限增 殖能力。 • 转化可自发，在传代过程中自己转变成可 无限增殖的细胞； • 也可人为转化，采用某些试剂处理，或从 动物的肿瘤组织中建立的细胞系。 • 优点：无限传代、倍增时间短、对培养条 件和生长因子的要求低，适合于大规模工 业化生产。
第四章 动物细胞制药（一） 28
常用生产用动物细胞的特性 • SP2/0-Ag14：通过融合的方法，从
有羊抗红细胞活性的BALB/c小鼠的脾 细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合杂 交瘤SP2/NL-Ag亚克隆中分离获得。 • 能耐受8氮鸟嘌呤 20μg/ml,但在含 HAT 选择培养基中不能存活。 • 通常用培养基为DMEM，添加10%胎牛血 清。 • 用于生产单抗杂交瘤细胞和抗体。
第四章 动物细胞制药（一） 30
基因工程细胞的构建和筛选
• 在生产中采用更多的更有前景的是 融合细胞及采用基因工程构建的各 种工程细胞。 • 被用构建工程细胞的动物细胞有： CHO-dhfr 、BHK-21、 Namalwa、 Vero、 SP2/0、 Sf-9 等细胞。
第四章 动物细胞制药（一） 31
第四章 动物细胞制药（一） 39
细胞库的建立 • 除原代细胞外，其他细胞株、 细胞系，包括二倍体、转化细 胞、融合细胞和工程细胞都需 建立细胞库保存。
第四章 动物细胞制药（一）
40
细胞库的建立
• 按照我国和美国FDA的规定，用于生产的工 程细胞必须建立两个细胞库：原始细胞库 和生产用细胞库。 • 原始细胞库应有详细档案包括： 1、该细胞系的历史：来源、动物的年龄 和性别、细胞分离的方法和所用的培养材 料。 2、该细胞的特性：形态、生长特性。 3、对各种有害因子的检查结果，细菌、 真菌、支原体和各种病毒。
生物技术制药 (动物细胞制药) ppt课件
②细胞学说的建立：19世纪中期，1838和1839年，德国科学家 Schleiden和Schwann建立了细胞学说，是19世纪自然科学三大发现 之一。
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③细胞的早期体外培养实验：19世纪末至20世纪初，1885年~1907 年，用生理盐水培养鸡胚组织，用血清和血浆培养血液中和结缔组织 中的细胞，用淋巴液培养蛙神经组织中的细胞。
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3、兼性贴壁细胞 有些细胞并不严格地依赖支持物，即可以贴附于支持物表面生长，还 可以在培养基中呈悬浮状态良好地生长，这类细胞称兼性贴壁细胞。 在贴壁生长时呈上皮样或纤维样细胞的形态，而悬浮生长时呈圆形。 如：中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞等。
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二、动物细胞的生理特点
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二、生产用动物细胞的获得 用于生产的动物细胞主要有：原代细胞、二倍体细胞系、可无限传代 的异倍体转化细胞系（Continuous Cell Line）、以及用这些细胞进 行融合和重组的工程细胞系（genetially-engineered cell line）
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1、原代细胞 是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬浮液。 由于组织块内常有多种细胞组成，而真正生产需要的只是其中的一小 部分。因此，用原代细胞来生产生物制品常需要大量的动物，费钱费 劳力。 常用的有鸡胚、兔肾或鼠肾原代细胞，以及血液的淋巴细胞。
④无致癌性。
一般从动物的胚胎组织中获取，广泛应用的有WI-38、MRC-5、2BS 等。
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3、异倍体转化细胞系 这类细胞是通过某个转化过程，由于染色体的断裂变成异倍体，从而 失去了正常细胞的特点，而获得了无限增殖能力。 （1）自发的转化过程：正常细胞在传代过程中，大部分细胞随着传 代次数的增加寿命逐渐终结，但其中有个别细胞可自发地转化而形成 有无限生命力的细胞系。这种转化多发生在啮齿动物。
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第四章 动物细胞制药
第一节 概
细胞学说的建立 组织培养和细胞培养
述
细胞工程学
第二节动物细胞的形态和生理特点
一、动物细胞的形态 适应功能,形态各异。 the inner life of the cell.flv
离体培养细胞分两类：
⒈贴壁细胞
生长须有贴附的支持物表面，依靠贴 附因子生长。
包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞均属于这一类。
两种形态： 成纤维细胞型 上皮细胞型
⒉悬浮细胞
生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。
●非贴壁依赖型细胞：无需附着于固相表面即可生 长，包括血液、淋巴组织细胞、许多肿瘤细胞及某些转化 细胞。 如血液淋巴细胞、
生产干扰素的Namalwa(那马瓦)细胞。
⒊兼性贴壁细胞 生长不严格依赖支持物
⒉基因载体的导入和高效表达工程
细胞株的筛选
五、细胞库的建立
必须建立两个细胞库： ⒈原始细胞库 ⒉生产用细胞库
⒍动物细胞蛋白质的合成途径 和修饰功能与细菌不同
蛋白质的合成部位：游离核糖体
粗面内质网的核糖体
三、动物细胞制药特点
缺点: 培养条件高、成本贵、产量低。
优点: 多半分泌在胞外，收集纯化方便；
得到了较完善的翻译后修饰，特别是 糖基化，故与天然产品一致，更适于临床。
第三节 生产用动物细胞的要求和获得 一、生产用动物细胞的要求
培养基为DMEM加7%胎牛血清。
用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄 疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已 用于工程细胞构建。
C127细胞：
RⅢ小鼠乳腺肿瘤细胞，适于带有牛乳 头瘤病毒载体的转染。 hGH 、EPO
CHO-K1：
从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞。 核型： 2n=20～22。 组织纤溶酶原激活剂 t-PA、EPO、 HBsAg疫苗、G-CSF、治甲型血友病的凝 血因子Ⅷ等。
④多角体蛋白基因有非常强的
启动子，产生的蛋白质可占全
部蛋白质的20%～30%；
⑤用光学显微镜可看到多角体，可以此作 为标记物，选阳性克隆。
⑥如用家蚕杆状病毒，
还可在蚕体表达外源基因。
㈡质粒载体
基本成分：
①允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。
②含有使基因表达的调控元件。
③能用以筛选出外源基因已整合的 选择标记。 ④有时还带有选择性增加拷贝数的 扩增系统。
安全，用于制备疫苗
MRC-5：
正常男性肺组织中的二倍体细胞系。核型 为2n=46的成纤维细胞。 增殖速度较WI-38快，对不良环境敏感 性较WI-38低。 对人的病毒敏感，用于生产疫苗。
Namalwa：
从肯尼亚患有淋巴瘤病人获取建成 的人类淋巴母细胞。 用于生产α干扰素。
Vero：
从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。 为贴壁依赖的成纤维细胞，核型2n=60；
用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰 质炎、狂犬病毒。
鼠骨髓瘤细胞：
特点： 专业分泌细胞，可高产Ig，易转染， 易生长。 能对蛋白质进行糖基化修饰 高效表达Ig的基因调控成分明确，有 利于表达载体的增强子和启动子的合理 设计。
四、基因工程细胞构建和筛选
被用以构建工程细胞的动物细胞有：
CHO-K1 、C127、BHK-21、 Namalwa、MDCK、Vero、 COS、SP2/0、 Sf-9 和多种骨髓瘤细胞。
⒊转化细胞系
通过某个转化过程形成的，常 由于染色体断裂变成异倍体，失去正 常细胞特点，而获得无限增殖能力。
Namalwa、CHO、BHK-21、Vero等。
4.融合细胞系
动--动 动--植
人—胡萝卜融合而成的 腹水癌细胞—原生质体
三、常用生产用动物细胞的特性
BHK-21:
生长1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的成纤 维样细胞,核型为2n=44;
原代细胞 二倍体细胞系
传代细胞系
二、生产用动物细胞的获得
⒈原代细胞
直接取自动物组织器官获得的细胞悬液。 需要大量动物，费钱费劳力。
鸡胚细胞、 原代兔肾细胞、 鼠肾细胞、 淋巴细胞。
⒉二倍体细胞系
原代细胞经过传代筛选克隆，从 多种细胞成分的组织中，挑选并纯化 出某种具有一定特征的细胞株。
WI-38、MRC-5、2BS等
如中国地仓鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。
二、动物细胞的生理特点
⒈ 细胞的分裂周期长 ⒉细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制 现象。
⒊正常二倍体细胞的生长寿命是有限的
⒋动物细胞对周围环境十分敏感
渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量 元素等。
⒌动物细胞对培养基要求高
必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元 素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。
COS细胞：
复制起点缺失SV40的基因组DNA转化 非洲绿猴肾细胞CV-1获得。 3个细胞系：COS1、COS3、COS7 广泛用于瞬时表达系统。
MDCK细胞：
成年雌性西班牙长耳狗的肾脏分离的 上皮细胞。
能支持多种病毒的载体，广泛用于 生产兽用疫苗。
WI-38：
正常人胚肺组织二倍体细胞系。 核型为2n=46的成纤维细胞
⒈真核细胞基因表达载体的构建
使用的载体有两类： ㈠病毒载体 牛痘病毒：构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒：用于基因治疗 杆状病毒：用于外源基因表达
其作为载体的优点：
①双链DNA，易重组 ②插入7～8kb DNA不影响正常病毒粒子的 形成。
③多角体蛋白和病毒粒子的形成无 直接关系，因此用外源基因更换多 角体蛋白基因，仍能形成有感染力 病毒粒子；
第一节 概
细胞学说的建立 组织培养和细胞培养
述
细胞工程学
第二节动物细胞的形态和生理特点
一、动物细胞的形态 适应功能,形态各异。 the inner life of the cell.flv
离体培养细胞分两类：
⒈贴壁细胞
生长须有贴附的支持物表面，依靠贴 附因子生长。
包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞均属于这一类。
两种形态： 成纤维细胞型 上皮细胞型
⒉悬浮细胞
生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。
●非贴壁依赖型细胞：无需附着于固相表面即可生 长，包括血液、淋巴组织细胞、许多肿瘤细胞及某些转化 细胞。 如血液淋巴细胞、
生产干扰素的Namalwa(那马瓦)细胞。
⒊兼性贴壁细胞 生长不严格依赖支持物
⒉基因载体的导入和高效表达工程
细胞株的筛选
五、细胞库的建立
必须建立两个细胞库： ⒈原始细胞库 ⒉生产用细胞库
⒍动物细胞蛋白质的合成途径 和修饰功能与细菌不同
蛋白质的合成部位：游离核糖体
粗面内质网的核糖体
三、动物细胞制药特点
缺点: 培养条件高、成本贵、产量低。
优点: 多半分泌在胞外，收集纯化方便；
得到了较完善的翻译后修饰，特别是 糖基化，故与天然产品一致，更适于临床。
第三节 生产用动物细胞的要求和获得 一、生产用动物细胞的要求
培养基为DMEM加7%胎牛血清。
用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄 疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已 用于工程细胞构建。
C127细胞：
RⅢ小鼠乳腺肿瘤细胞，适于带有牛乳 头瘤病毒载体的转染。 hGH 、EPO
CHO-K1：
从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞。 核型： 2n=20～22。 组织纤溶酶原激活剂 t-PA、EPO、 HBsAg疫苗、G-CSF、治甲型血友病的凝 血因子Ⅷ等。
④多角体蛋白基因有非常强的
启动子，产生的蛋白质可占全
部蛋白质的20%～30%；
⑤用光学显微镜可看到多角体，可以此作 为标记物，选阳性克隆。
⑥如用家蚕杆状病毒，
还可在蚕体表达外源基因。
㈡质粒载体
基本成分：
①允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。
②含有使基因表达的调控元件。
③能用以筛选出外源基因已整合的 选择标记。 ④有时还带有选择性增加拷贝数的 扩增系统。
安全，用于制备疫苗
MRC-5：
正常男性肺组织中的二倍体细胞系。核型 为2n=46的成纤维细胞。 增殖速度较WI-38快，对不良环境敏感 性较WI-38低。 对人的病毒敏感，用于生产疫苗。
Namalwa：
从肯尼亚患有淋巴瘤病人获取建成 的人类淋巴母细胞。 用于生产α干扰素。
Vero：
从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。 为贴壁依赖的成纤维细胞，核型2n=60；
用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰 质炎、狂犬病毒。
鼠骨髓瘤细胞：
特点： 专业分泌细胞，可高产Ig，易转染， 易生长。 能对蛋白质进行糖基化修饰 高效表达Ig的基因调控成分明确，有 利于表达载体的增强子和启动子的合理 设计。
四、基因工程细胞构建和筛选
被用以构建工程细胞的动物细胞有：
CHO-K1 、C127、BHK-21、 Namalwa、MDCK、Vero、 COS、SP2/0、 Sf-9 和多种骨髓瘤细胞。
⒊转化细胞系
通过某个转化过程形成的，常 由于染色体断裂变成异倍体，失去正 常细胞特点，而获得无限增殖能力。
Namalwa、CHO、BHK-21、Vero等。
4.融合细胞系
动--动 动--植
人—胡萝卜融合而成的 腹水癌细胞—原生质体
三、常用生产用动物细胞的特性
BHK-21:
生长1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的成纤 维样细胞,核型为2n=44;
原代细胞 二倍体细胞系
传代细胞系
二、生产用动物细胞的获得
⒈原代细胞
直接取自动物组织器官获得的细胞悬液。 需要大量动物，费钱费劳力。
鸡胚细胞、 原代兔肾细胞、 鼠肾细胞、 淋巴细胞。
⒉二倍体细胞系
原代细胞经过传代筛选克隆，从 多种细胞成分的组织中，挑选并纯化 出某种具有一定特征的细胞株。
WI-38、MRC-5、2BS等
如中国地仓鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。
二、动物细胞的生理特点
⒈ 细胞的分裂周期长 ⒉细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制 现象。
⒊正常二倍体细胞的生长寿命是有限的
⒋动物细胞对周围环境十分敏感
渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量 元素等。
⒌动物细胞对培养基要求高
必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元 素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。
COS细胞：
复制起点缺失SV40的基因组DNA转化 非洲绿猴肾细胞CV-1获得。 3个细胞系：COS1、COS3、COS7 广泛用于瞬时表达系统。
MDCK细胞：
成年雌性西班牙长耳狗的肾脏分离的 上皮细胞。
能支持多种病毒的载体，广泛用于 生产兽用疫苗。
WI-38：
正常人胚肺组织二倍体细胞系。 核型为2n=46的成纤维细胞
⒈真核细胞基因表达载体的构建
使用的载体有两类： ㈠病毒载体 牛痘病毒：构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒：用于基因治疗 杆状病毒：用于外源基因表达
其作为载体的优点：
①双链DNA，易重组 ②插入7～8kb DNA不影响正常病毒粒子的 形成。
③多角体蛋白和病毒粒子的形成无 直接关系，因此用外源基因更换多 角体蛋白基因，仍能形成有感染力 病毒粒子；