单核增生李斯特氏菌检测概述
单增李斯特氏菌及其检测方法
单增李斯特氏菌及其检测方法一、单增李斯特氏菌单增李斯特氏菌，学名Listeria monocytogenes，一种革兰氏阳性菌，是李斯特菌属。
李斯特菌属(Listeria)共分为2个群，7个种：第一群包括单核细胞增生性李斯特菌(L monocytogenes，LM)(亦称产单核细胞李斯特菌)、伊氏李斯特菌(L ivanovii)(亦称绵羊李斯特菌)、英诺克李斯特菌(L innocua)(亦称无害李斯特菌)、韦氏李斯特菌(L welshimei)、塞氏李斯特菌(L seeligeri)，第二群包括格氏李斯特菌(L grayi)和莫氏李斯特菌(L mulTayi)。
其中，单增李斯特菌是唯一能引起疾病的人畜共患病的病原菌。
它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
二、单增李斯特氏菌检测方法1.细菌培养法该菌营养要求不高，兼性厌氧，最适在含有CO2的微需氧环境中生长，生长温度范围-1.5℃-45℃，最适温度为30℃-37℃，能在普通冰箱冷藏室生长，是一种典型的耐冷性细菌，同时还具有耐盐性。
LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。
在血琼脂平板上有β溶血环。
在显色培养基上呈蓝绿色。
2.生化鉴定法该菌主要生化特性如下：①触酶阳性；②氧化酶阴性；③发酵多种糖类；④产酸不产气；⑤不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二塘；⑥不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解；⑦吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性；⑧VP、甲基红试验和精氨酸水解试验阳性；⑨对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20分钟可杀死，70%酒精5min、2.5%石碳酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌。
⑩该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。
3.血清凝集法根据菌体抗原和鞭毛抗原，LM分为16个血清型：1／2a、1／2b、1／2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。
单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究
单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究引言：单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种潜伏在食品中常见的致病菌，能引起严重的食物中毒，威胁着人类的健康与生命安全。
因此，研究和发展一种快速、高效的检测技术对于食品安全至关重要。
本文旨在探讨目前关于单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术的研究进展，并为进一步的研究和应用提供参考。
一、单核细胞增生性李斯特菌简介单核细胞增生性李斯特菌是一种革兰氏阳性菌，能在广泛的温度（0-45℃）和pH（4.4-9.6）范围内生长，且具有金属抗药性。
在食品中，该菌可以通过肉类、蔬菜和奶制品等途径传播，使其成为食品安全的重要隐患之一。
由于该菌对常规的煮沸和加热处理具有一定的抵抗能力，因此需借助有效的检测技术对其进行快速、准确的检测。
二、传统检测方法的局限性目前常用的单核细胞增生性李斯特菌检测方法主要包括传统培养方法、蛋白酶结合效应（ELISA）和分子生物学方法等。
然而，这些方法存在着以下局限性：1. 传统培养方法耗时长，需要较长的培养时间才能获得结果，无法快速检测；2. ELISA方法虽然具有较高的灵敏度和特异性，但其需要复杂的样品处理和实验步骤，使得检测过程繁琐；3. 分子生物学方法虽然能够提供较快的检测结果，但其仪器成本高，技术要求较高，限制了其在实际应用中的推广。
三、快速检测技术的研究进展随着科学技术的发展，研究人员不断探索和开发更为快速、准确的单核细胞增生性李斯特菌检测技术。
以下是几种常见的快速检测技术：1. 荧光定量聚合酶链反应（qPCR）技术：该技术以其高效、精确和快速的特点，被广泛应用于单核细胞增生性李斯特菌的检测。
qPCR技术可以快速扩增和定量样品中的特定基因片段，结合荧光定量技术实现李斯特菌的快速检测和定量。
2. 微生物芯片技术：微生物芯片是基于生物芯片技术的一种新型检测平台，可实现对多种菌种的快速识别和检测。
研究人员通过设计特定的探针，可以在芯片上同时检测多种致病菌，包括单核细胞增生性李斯特菌，提高了检测效率和准确性。
单增李斯特氏菌检测详解
鉴定
血清学检验 菌悬液于80℃水域中加热1h，离心弃上清， 剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清 学玻片凝集试验。
单核细胞增生李斯特氏菌：1/2A，1/2B， 1/2C，3A，3B，3C，4A，4AB，4B，4C， 4D，4E，7
质量控制
每次检验均需用标准阳性菌株和阴性菌株 进行质量控制。 样品制备的同时，在空白对照FB1增菌液中 加入新鲜配制的每毫升含有10个～100个单 核细胞增生李斯特氏菌的稀释液1mL和阴性 培养物，按检验程序进行同步检验。
鉴定
溶血试验
刺种7％羊血琼脂平板，并刺种阳性对照菌（单核
细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性
对照菌（英诺克李斯特氏菌），30℃培养24h～ 48h。
单核细胞增生李斯特氏菌 窄小的β溶血环
西尔李斯特氏菌
窄小的β溶血环
绵羊李斯特氏菌
大的β溶血环
其他
不溶血
鉴定
动力试验 穿刺SIM半固体培养基，于室温（20℃～25℃）
显色培养基
CHROMagarTM Listeria上单细胞增生李斯特 氏菌菌落特征
225mL FB1 30℃±1℃培养25h±1h，吸取 1mL，加入10mL FB2增菌液中30℃±1℃二 次增菌25h±1h。
VIDAS快速筛选（可选）
FB2增菌液进行VIDAS快速筛选。 筛选为阴性的结果可直接报告未检出。 筛选为阳性的结果继续分离培养和鉴定。
分离培养
取增菌液一环，划线分离于选择性培养基 OXA、PALCAM上，35℃±1℃培养24h～48h。
报告结果
协同溶血试验、血清学试验可根据需要进 行，常规检验可不进行这些试验。
报告阳性结果：检出单核细胞增生李斯特 氏菌。
单核细胞增生李斯特菌检验
单核细胞增生李斯特菌检验
一、生物学特性
形态及染色：该菌为革兰氏阳性短 杆菌，大小约0.5um×1.0um～2.0um， 直或稍弯，两端钝圆，常呈v字型排 列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、 无芽胞，一般不形成荚膜，但在营 养丰富的环境中可形成荚膜，在陈 旧培养基中的菌体可呈丝状及革兰 氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛， 但周毛易脱落。
产道感染胎儿或新生儿，栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接解也是本 病传播的可能途径，且有上升趋势。 临床表现，健康成人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者 等表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自 然流产、脑膜炎、败血症直至死亡。
《动物检疫检验技术专业教学资源库》
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单核细胞增生李斯特菌检验
胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA-YE)平板
用 途：用于单增李氏菌分纯 、培养。
原 理：胰蛋白胨、多价胨和 酵母浸粉提供氮源、维生素 和生长因子；氯化钠维持均 衡的渗透压；葡萄糖提供碳 源；磷酸氢二钾为缓冲剂。
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动物性食品微生物检验
单核细胞增生李斯特菌检验
主讲人：王福红
单核细胞增生李斯特菌检验
知识目标：
• 理解单核细胞增生李斯特菌的生物学特性。 • 了解单核细胞增生李斯特菌的致病性。 • 掌握单核细胞增生李斯特菌标准检验方法。
能力目标：
• 会制备单核细胞增生李斯特菌检验用培养基。 • 会对单核细胞增生李斯特菌进行检验。
电镜下的李特氏菌
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单核细胞增生李斯特菌检验
单核增生李斯特氏菌检测概述
单核增生李斯特氏菌检测概述单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性的致病菌，能够在低温下生存繁殖，并在恶劣环境中形成生物被膜，使其对抗不良条件。
该菌可引起人类的李斯特菌病（Listeriosis），也是一种可以通过食品传播的重要病原体。
李斯特菌病在免疫功能低下的人群中很容易引起严重感染，包括孕妇、老年人、免疫抑制患者和新生儿。
检测单核增生李斯特氏菌的方法主要包括传统的培养方法和现代的分子生物学方法。
1.传统培养方法传统的培养方法是检测单核增生李斯特氏菌的主要方法之一、常用的培养基包括PALCAM（Polymyxin, Acriflavine, Lithium chloride and Cycloheximide）和OXOID Listeria Selective Agar等。
培养温度通常在30-37℃之间，因为单核增生李斯特氏菌可以在低温下生长。
在培养过程中，从食品样品或其他可能受污染的样品中提取菌落，并在培养基上进行培养。
培养时间通常为1-2天，培养过程中需要注意去除其他菌落的干扰。
2.分子生物学方法分子生物学方法是现代检测单核增生李斯特氏菌的常用方法，主要包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR等。
这些方法的优势在于其高度敏感性和特异性。
通过检测单核增生李斯特氏菌特有的基因或序列，可以快速准确地鉴定与检测其存在。
3.培养与分子生物学相结合的方法为了更好地检测单核增生李斯特氏菌，有些方法将传统培养与分子生物学相结合。
这种方法通常先进行培养，然后使用PCR或实时荧光定量PCR等技术进行进一步检测和鉴定。
这种方法较为耗时，但能够进一步提高检测的准确性。
需要注意的是，由于单核增生李斯特氏菌能够在低温下生存，因此在食品或样品中的检测非常重要。
常见的食品样品包括生肉、海鲜、冷冻食品、奶制品等。
对于食品企业来说，建立完善的食品安全管理体系和进行规范的监测是防止单核增生李斯特氏菌传播的重要措施。
单核细胞增生李斯特菌检验
单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后 主要表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛存在于自然界 中。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都可被污 染。该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人 类健康的主要病原菌之一。 其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷人群。大 多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为每一百万人2-15例， 死亡率为13-34% 加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌病暴发， 导致十几人死亡。很多国家都已经采取措施来控制食品中的 单增李斯特氏菌，并制定了相应的标准。
MMA 30℃48h菌落 针尖大小、形 态不典型，与 杂菌难区分抑 制性强
PALCAM
OXA
CHROMagar
37℃24h－48h， 30℃24h－ 37℃18h-24h, 2mm灰绿色中 48h,2mm灰黑 蓝色菌落周围 心黑色凹陷， 色菌落周围呈 呈白色晕圈 菌落周围呈棕 棕黑色水解圈 黑色水解圈
按2009年国家食源性疾病检测网的工作手 册 1.定性检测 2.定量检测
检样 25 g(ml)样品+LB1增菌液225 mL，均质
30 ℃±1 ℃，24 h
0.1 mL+10 mL LB2增菌液
30 ℃±1 ℃，18 h～24 h
科玛嘉李斯特菌显色培养基 36 ℃±1 ℃，24 h～48 h
PALCAM琼脂
协同溶血试验 (cAMP): 在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌 (R.equi), 在它们中两者之间垂直接种可疑李斯 特菌, 但不要触及它们, 于30℃培养24h～48 h, 检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金 黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的 溶血增强, 斯氏李斯特菌（L.seeligeri）的溶血 也增强, 而伊氏李斯特菌（L.ivanovii）在马红 球菌附近的溶血增强。
食品微生物检验——单增李斯特菌
食品微生物检验——单增李斯特菌食品中单增李斯特检测技术李斯特氏菌属包括七个种：单核细胞增生李斯特氏菌绵羊李斯特氏菌英诺克李斯特氏菌威尔斯李斯特氏菌西尔李斯特氏菌格氏李斯特氏菌默氏李斯特氏菌其中单核细胞增生李斯特氏菌对人类致病性强，绵羊李斯特氏菌对人类也有一定的致病性，其余李斯特氏菌无致病性。
单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。
它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。
该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх 1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状。
兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性。
该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。
该菌营养要求不高，在20--25℃培养有动力，穿刺培养2－5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。
该菌的生长范围为2--42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培养温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.8－4.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。
在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。
在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。
在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用45度角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。
该菌触酶阳性，氧化酶阴性。
发酵多种糖类，产酸不产气。
如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖。
单核增生李斯特氏菌检测
在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整 齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。 在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色， 刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。 在0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)琼脂上， 用45°角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察， 菌落呈兰色、灰色或兰灰色。
单核增生李斯特氏菌 检测概述
李斯特氏菌属
李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新的分类 学研究表明，其分为六个种： 单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） 绵羊（伊氏）李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 英诺克（无害）李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi） 在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌：单核增生 李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发 病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李 斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检 测意义的是单核增生李斯特氏菌。
LB和BLB
只有选择性没有区别性
LEB是在TSB-YE的基础上加入盐酸吖啶黄、 萘啶酮酸和放线菌酮等选择性因子；加入 的丙酮酸钠，有助于受损细胞的恢复；不 含七叶灵和柠檬酸铁铵，无颜色反应 BLB是在LB基础上加入缓冲体系：磷酸二 氢钾和磷酸氢二钠
检测程序---分离
分离培养基有：OXA、PALCOM、LPM、MOX 等。分离原理主要是基于李斯特氏菌具有β－D－ 葡萄糖苷酶的活性，能水解培养基中的七叶灵， 产生七叶苷，与铁离子产生颜色反应而使菌落为 棕褐色，并带有褐色晕圈，而致病性和非致病性 李斯特氏菌病都能发生这种反应
单核细胞增生李斯特氏菌检验(食品微生物学检验)
食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验1范围本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(L i s t e r i am o n o c y t o g e n e s)的检验方法㊂本标准第一法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检验;第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数;第三法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低(<100C F U/g)而杂菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数,特别是牛奶㊁水以及含干扰菌落计数的颗粒物质的食品㊂2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1冰箱:2ħ~5ħ㊂2.2恒温培养箱:30ħʃ1ħ㊁36ħʃ1ħ㊂2.3均质器㊂2.4显微镜:10x~100x㊂2.5电子天平:感量0.1g㊂2.6锥形瓶:100m L㊁500m L㊂2.7无菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)㊁10m L(具0.1m L刻度)或微量移液器及吸头㊂2.8无菌平皿:直径90mm㊂2.9无菌试管:16mmˑ160mm㊂2.10离心管:30mmˑ100mm㊂2.11无菌注射器:1m L㊂2.12单核细胞增生李斯特氏菌(L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s)A T C C19111或C M C C54004,或其他等效标准菌株㊂2.13英诺克李斯特氏菌(L i s t e r i a i n n o c u a)A T C C33090,或其他等效标准菌株㊂2.14伊氏李斯特氏菌(L i s t e r i a i v a n o v i i)A T C C19119,或其他等效标准菌株㊂2.15斯氏李斯特氏菌(L i s t e r i a s e e l i g e r i)A T C C35967,或其他等效标准菌株㊂2.16金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s)A T C C25923或其他产β-溶血环金葡菌,或其他等效标准菌株㊂2.17马红球菌(R h o d o c o c c u s e q u i)A T C C6939或N C T C1621,或其他等效标准菌株㊂2.18小白鼠:I C R体重18g~22g㊂2.19全自动微生物生化鉴定系统㊂3培养基和试剂3.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(T S B-Y E):见A.1㊂3.2含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(T S A-Y E):见A.2㊂3.3李氏增菌肉汤L B(L B1,L B2):见A.3㊂3.41%盐酸吖啶黄(a c r i f l a v i n eH C l)溶液:见A.3.2.1㊁A.3.2.2㊂3.51%萘啶酮酸钠盐(n a l a d i x i c a c i d)溶液:见A.3.2.1㊁A.3.2.2㊂3.6 P A L C AM琼脂:见A.4㊂3.7革兰氏染液:见A.5㊂3.8S I M动力培养基:见A.6㊂3.9缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(M R)和V-P试验用]:见A.7㊂3.105%~8%羊血琼脂:见A.8㊂3.11糖发酵管:见A.9㊂3.12过氧化氢试剂:见A.10㊂3.13李斯特氏菌显色培养基㊂3.14生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统㊂3.15缓冲蛋白胨水:见A.11㊂第一法单核细胞增生李斯特氏菌定性检验4检验程序单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序见图1㊂图1单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序5操作步骤5.1增菌以无菌操作取样品25g(m L)加入到含有225m LL B1增菌液的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质1m i n~2m i n;或放入盛有225m LL B1增菌液的均质杯中,以8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n㊂于30ħʃ1ħ培养24hʃ2h,移取0.1m L,转种于10m LL B2增菌液内,于30ħʃ1ħ培养24hʃ2h㊂5.2分离取L B2二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色平板和P A L C AM琼脂平板,于36ħʃ1ħ培养24h~48h,观察各个平板上生长的菌落㊂典型菌落在P A L C AM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落,周围有棕黑色水解圈,有些菌落有黑色凹陷;在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征,参照产品说明进行判定㊂5.3初筛自选择性琼脂平板上分别挑取3个~5个典型或可疑菌落,分别接种木糖㊁鼠李糖发酵管,于36ħʃ1ħ培养24hʃ2h,同时在T S A-Y E平板上划线,于36ħʃ1ħ培养18h~24h,然后选择木糖阴性㊁鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定㊂5.4鉴定(或选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等)5.4.1染色镜检:李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌,大小为(0.4μm~0.5μm)ˑ(0.5μm~2.0μm);用生理盐水制成菌悬液,在油镜或相差显微镜下观察,该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动㊂5.4.2动力试验:挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺半固体或S I M动力培养基,于25ħ~30ħ培养48h,李斯特氏菌有动力,在半固体或S I M培养基上方呈伞状生长,如伞状生长不明显,可继续培养5d,再观察结果㊂5.4.3生化鉴定:挑取纯培养的单个可疑菌落,进行过氧化氢酶试验,过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和M R-V P试验㊂单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1㊂5.4.4溶血试验:将新鲜的羊血琼脂平板底面划分为20个~25个小格,挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上,每格刺种一个菌落,并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌㊁伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌),穿刺时尽量接近底部,但不要触到底面,同时避免琼脂破裂, 36ħʃ1ħ培养24h~48h,于明亮处观察,单增李斯特氏菌呈现狭窄㊁清晰㊁明亮的溶血圈,斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生弱的透明溶血圈,英诺克李斯特氏菌无溶血圈,伊氏李斯特氏菌产生宽的㊁轮廓清晰的β-溶血区域,若结果不明显,可置4ħ冰箱24h~48h再观察㊂注:也可用划线接种法㊂5.4.5协同溶血试验c AM P(可选项目):在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌,挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间,垂直线两端不要触及平行线,距离1mm~ 2mm,同时接种单核细胞增生李斯特氏菌㊁英诺克李斯特氏菌㊁伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌,于36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约2mm的β-溶血增强区域,斯氏李斯特氏菌也出现微弱的溶血增强区域,伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌处出现约5mm~10mm的 箭头状 β-溶血增强区域,英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象㊂若结果不明显,可置4ħ冰箱24h~48h再观察㊂注:5%~8%的单核细胞增生李斯特氏菌在马红球菌一端有溶血增强现象㊂表1单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别菌种溶血反应葡萄糖麦芽糖M R-V P甘露醇鼠李糖木糖七叶苷单核细胞增生李斯特氏菌(L.m o n o c y t o g e n e s)++++/+-+-+格氏李斯特氏菌(L.g r a y i)-+++/++--+斯氏李斯特氏菌(L.s e e l i g e r i)++++/+--++威氏李斯特氏菌(L.w e l s h i m e r i)-+++/+-V++伊氏李斯特氏菌(L.i v a n o v i i)++++/+--++英诺克李斯特氏菌(L.i n n o c u a)-+++/+-V-+注:+阳性;-阴性;V反应不定㊂5.5小鼠毒力试验(可选项目)将符合上述特性的纯培养物接种于T S B-Y E中,于36ħʃ1ħ培养24h,4000r/m i n离心5m i n,弃上清液,用无菌生理盐水制备成浓度为1010C F U/m L的菌悬液,取此菌悬液对3只~5只小鼠进行腹腔注射,每只0.5m L,同时观察小鼠死亡情况㊂接种致病株的小鼠于2d~5d内死亡㊂试验设单增李斯特氏菌致病株和灭菌生理盐水对照组㊂单核细胞增生李斯特氏菌㊁伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性㊂5.6结果与报告综合以上生化试验和溶血试验的结果,报告25g(m L)样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌㊂第二法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法6检验程序单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序见图2㊂图2单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序7操作步骤7.1样品的稀释7.1.1以无菌操作称取样品25g(m L),放入盛有225m L缓冲蛋白胨水或无添加剂的L B肉汤的无菌均质袋内(或均质杯)内,在拍击式均质器上连续均质1m i n~2m i n或以8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n㊂液体样品,振荡混匀,制成1ʒ10的样品匀液㊂7.1.2用1m L无菌吸管或微量移液器吸取1ʒ10样品匀液1m L,沿管壁缓慢注于盛有9m L缓冲蛋白胨水或无添加剂的L B肉汤的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1m L无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1ʒ100的样品匀液㊂7.1.3按7.1.2操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液㊂每递增稀释1次,换用1支1m L无菌吸管或吸头㊂7.2样品的接种根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),每个稀释度的样品匀液分别吸取1m L以0.3m L㊁0.3m L㊁0.4m L的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色平板,用无菌L棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘㊂使用前,如琼脂平板表面有水珠,可放在25ħ~50ħ的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失㊂7.3培养7.3.1在通常情况下,涂布后,将平板静置10m i n,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱36ħʃ1ħ培养1h;等样品匀液吸收后翻转平皿,倒置于培养箱,36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂7.4典型菌落计数和确认7.4.1单核细胞增生李斯特氏菌在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征以产品说明为准㊂7.4.2选择有典型单核细胞增生李斯特氏菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在15C F U~150C F U之间的平板,计数典型菌落数㊂如果:a)只有一个稀释度的平板菌落数在15C F U~150C F U之间且有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落;b)所有稀释度的平板菌落数均小于15C F U且有典型菌落,应计数最低稀释度平板上的典型菌落;c ) 某一稀释度的平板菌落数大于150C F U 且有典型菌落,但下一稀释度平板上没有典型菌落,应计数该稀释度平板上的典型菌落;d ) 所有稀释度的平板菌落数大于150C F U 且有典型菌落,应计数最高稀释度平板上的典型菌落;e ) 所有稀释度的平板菌落数均不在15C F U~150C F U 之间且有典型菌落,其中一部分小于15C F U 或大于150C F U 时,应计数最接近15C F U 或150C F U 的稀释度平板上的典型菌落㊂以上按式(1)计算㊂f ) 2个连续稀释度的平板菌落数均在15C F U~150C F U 之间,按式(2)计算㊂7.4.3 从典型菌落中任选5个菌落(小于5个全选),分别按5.3㊁5.4进行鉴定㊂8 结果计数T =A BC d(1)式中:T样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数;A某一稀释度典型菌落的总数;B某一稀释度确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;C某一稀释度用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;d稀释因子㊂T =A 1B 1/C 1+A 2B 2/C 21.1d(2)式中:T样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数;A 1第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数;B 1 第一稀释度(低稀释倍数)确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;C 1 第一稀释度(低稀释倍数)用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;A 2 第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数;B 2 第二稀释度(高稀释倍数)确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;C 2第二稀释度(高稀释倍数)用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;1.1 计算系数;d 稀释因子(第一稀释度)㊂9 结果报告报告每g (m L )样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数,以C F U /g(m L )表示;如T 值为0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告㊂第三法 单核细胞增生李斯特氏菌M P N 计数法10 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌M P N 计数法检验程序见图3㊂图3单核细胞增生李斯特氏菌M P N计数程序11操作步骤11.1样品的稀释按7.1进行㊂11.2接种和培养11.2.1根据对样品污染状况的估计,选取3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),接种于10m LL B1肉汤,每一稀释度接种3管,每管接种1m L(如果接种量需要超过1m L,则用双料L B1增菌液)于30ħʃ1ħ培养24hʃ2h㊂每管各移取0.1m L,转种于10m LL B2增菌液内,于30ħʃ1ħ培养24hʃ2h㊂11.2.2用接种环从各管中移取1环,接种李斯特氏菌显色平板,36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂11.3确证试验自每块平板上挑取5个典型菌落(5个以下全选),按照5.3㊁5.4进行鉴定㊂12结果与报告根据证实为单核细胞增生李斯特氏菌阳性的试管管数,查M P N检索表(见附录B),报告每g(m L)样品中单核细胞增生李斯特氏菌的最可能数,以M P N/g(m L)表示㊂附录A培养基和试剂A.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(T S B-Y E)A.1.1成分胰胨17.0g多价胨3.0g酵母膏6.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5g蒸馏水1000m LA.1.2制法将上述各成分加热搅拌溶解,调节p H至7.2ʃ0.2,分装,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A.2含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(T S A-Y E)A.2.1成分胰胨17.0g多价胨3.0g酵母膏6.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5g琼脂15.0g蒸馏水1000m LA.2.2制法将上述各成分加热搅拌溶解,调节p H至7.2ʃ0.2,分装,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A.3李氏增菌肉汤(L B1,L B2)A.3.1成分胰胨5.0g多价胨5.0g酵母膏5.0g氯化钠20.0g磷酸二氢钾1.4g磷酸氢二钠12.0g七叶苷1.0g蒸馏水1000m LA.3.2制法将上述成分加热溶解,调节p H至7.2ʃ0.2,分装,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A.3.2.1李氏Ⅰ液(L B1)225m L中加入:1%萘啶酮酸(用0.05m o l/L氢氧化钠溶液配制)0.5m L1%吖啶黄(用无菌蒸馏水配制)0.3m LA.3.2.2李氏Ⅱ液(L B2)200m L中加入:1%萘啶酮酸0.4m L1%吖啶黄0.5m LA.4P A L C A M琼脂A.4.1成分酵母膏8.0g葡萄糖0.5g七叶甙0.8g柠檬酸铁铵0.5g甘露醇10.0g酚红0.1g氯化锂15.0g酪蛋白胰酶消化物10.0g心胰酶消化物3.0g玉米淀粉1.0g肉胃酶消化物5.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000m LA.4.2制法将上述成分加热溶解,调节p H至7.2ʃ0.2,分装,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A.4.2.1P A L C A M选择性添加剂多粘菌素B5.0m g盐酸吖啶黄2.5m g头孢他啶10.0m g无菌蒸馏水500m LA.4.2.2制法将P A L C AM基础培养基溶化后冷却到50ħ,加入2m LP A L C AM选择性添加剂,混匀后倾倒在无菌的平皿中,备用㊂A.5革兰氏染色液A.5.1结晶紫染色液A.5.1.1成分结晶紫1.0g95%乙醇20.0m L1%草酸铵水溶液80.0m LA.5.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合㊂A.5.2革兰氏碘液A.5.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300m LA.5.2.2制法将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300m L㊂A.5.3沙黄复染液A.5.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10.0m L蒸馏水90.0m LA.5.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释㊂A.5.4染色法A.5.4.1涂片用火焰固定后滴加结晶紫染液,作用1m i n,水洗㊂A.5.4.2滴加革兰氏碘液,作用1m i n,水洗㊂A.5.4.3滴加95%乙醇脱色,约15s~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗㊂A.5.4.4滴加复染液,复染1m i n,水洗㊁待干㊁镜检㊂A.6S I M动力培养基A.6.1成分胰胨20.0g多价胨6.0gG B 4789.30 201611 硫酸铁铵0.2g 硫代硫酸钠0.2g 琼脂3.5g 蒸馏水1000m L A .6.2 制法将上述各成分加热混匀,调节p H 至7.2ʃ0.2,分装小试管,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A .6.3 试验方法挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到S I M 培养基中,于25ħ~30ħ培养48h ,观察结果㊂A .7 缓冲葡萄糖蛋白胨水(M R 和V P 试验用)A .7.1 成分多价胨7.0g 葡萄糖5.0g 磷酸氢二钾5.0g 蒸馏水1000m L A .7.2 制法溶化后调节p H 至7.0ʃ0.2,分装试管,每管1m L ,121ħ高压灭菌15m i n ,备用㊂A .7.3 甲基红(M R )试验A .7.3.1 甲基红试剂A .7.3.1.1 成分甲基红10m g 95%乙醇30m L 蒸馏水20m LA .7.3.1.2 制法10m g 甲基红溶于30m L95%乙醇中,然后加入20m L 蒸馏水㊂A .7.3.1.3 试验方法取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中,36ħʃ1ħ培养2d ~5d ㊂滴加甲基红试剂一滴,立即观察结果㊂鲜红色为阳性,黄色为阴性㊂A .7.4 V -P 试验A .7.4.1 6%α-萘酚-乙醇溶液成分及制法:取α-萘酚6.0g ,加无水乙醇溶解,定容至100m L ㊂。
30123B VIDAS快速单核细胞增生李斯特菌 (LMX)
REF3012314226B-zh-2009/11 VIDAS快速单核细胞增生李斯特菌(LMX)仅供实验室用VIDAS®快速单核细胞增多李斯特菌（LMX）分析是在VIDAS®上采用酶联荧光免疫分析(ELFA)方法，对人类食品和环境样本的单核细胞增多李斯特菌进行特异性检测。
概述李斯特氏菌属现分为6个种，包括单核细胞增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特、西尔李斯特、威尔斯李斯特菌及格氏李斯特（1）。
单核细胞增生李斯特菌是唯一对人致病的菌。
人类李斯特氏菌病包括脑炎、脑膜炎、败血症和流产。
高危人群包括孕妇、新生儿、免疫损伤患者及老年人（2，3）。
单核细胞增多李斯特菌在环境中分布广泛，对未加工原料、部分加工食品及发酵食品具有潜在危害。
VIDAS®快速单核细胞增生李斯特菌（LMX）试验是一种快速筛选试验，将取代费时的传统方法，可直接筛选人类食品（如肉类、乳制品、海产品和蔬菜）或环境样本中的单核细胞增生李斯特菌。
原理VIDAS®快速单核细胞增生李斯特菌是一种采用自动化VIDAS®系统（参见用户手册）作为酶联荧光免疫分析（ELFA）方法，对李斯特菌抗原进行检测的酶联免疫方法。
固相容器（SPR®）是一个类似于加样头的一次性装置，起加样器的作用。
SPR®内壁用单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体包被。
各种测试试剂为即用型，均预先放置在密封的试剂条内。
VIDAS®系统自动完成全部实验程序。
反应底物在SPR®内外循环数次。
将部分增菌肉汤加于试剂条上，样本中的单增李斯特菌抗原与SPR®内面包被的抗单增李斯特菌抗体结合，未结合的样本则被洗去。
与酶结合的的抗体也在SPR®内外循环，并与固定于SPR内壁的单增李斯特菌抗原结合。
测生物素的存在。
酶复合物由孵育的碱性磷酸酶标记的二抗检测。
最后洗去未结合的酶复合物。
最后在SPR®.中加入荧光底物，磷酸4-甲基伞型物。
单核增生李斯特氏菌检测概述
快速方法 无
GB/T 4789.30-
2003
FDA
USDA
EB （30±1℃，48h）
MMA
蓝色菌落；三糖铁；动力试验；染色 镜检（革兰氏染色、典型运动）；生
LB1 （30±1℃，
24h）
LB2 （30±1℃，
24h）
（30±1℃，24-48h ）
化特性（溶血反应、硝酸盐还原、尿 素酶、MR-VP、糖发酵）；小鼠毒力
同时于tsaye平板划线纯化30鉴定结果报告3624h48hbax系统筛选阴性报告结果01ml99mlmopsbleb3611824h25g225mluvmleb3012224h熟肉制品25gml225ml不含抗生素bleb3014h加抗生素30124h其他食品单核增生李斯特氏菌检测流程单核增生李斯特氏菌检测流程fdafda25g样品225mlbleb基础加入丙酮酸钠加入萘啶酮酸盐酸吖锭黄放线菌酮304hr划线接种oxa平板3024hr和48hr科玛嘉李氏菌显色培养基tsaye分纯3524hr48hr3524hr过氧化氢酶试验革兰氏染色溶血试验糖发apilisteria352448hr报告结果351824hr25g样品225mlfb增菌液303025h25h1h1h1ml转种10mlfb增菌液303025h25h1h1hvidas快速筛选阴性报告结果阳性继续鉴定选择性培养基显色培养基oxapalcam挑选可疑菌落接种tsaye353524h24h接种tsbye报告结果单核增生李斯特氏菌检测流程单核增生李斯特氏菌检测流程sn01841sn20052005api鉴定试验或生化试验尿素酶水解硝酸盐还原葡萄糖甘露醇麦叶苷tsimrvp单核增生李斯特氏菌检测流程单核增生李斯特氏菌检测流程sopsop25g样品225ml半fraser肉汤1ml转种fraser肉汤vidas快速筛选303025h25h1h1h303025h25h1h1h阴性报告结果阳性选择性培养基显色培养基oxapalcamapi鉴定试验报告结果353524h24h挑选可疑菌落接种营养琼脂革兰氏染色溶血试验动力试验353524h24h方法名称一次增菌二次增菌分离鉴定快速方法mbp301824heb302448heb302448heb30148hgbt4789302003lb30124hlb30124hfdablebphy304hblebphy三种抑菌剂302044hoxapalommoxlpm七叶灵fe推荐bcmaloarapidl?monochromagarlisteria蓝色菌落
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血平板
无害李斯特氏菌 ATCC 33090
36h，35℃培养
血平板
伊氏李斯特氏菌 ATCC 19119
24h，35℃培养
单核增生李斯特氏菌检测流程
25g样品+225ml BLEB基础（加入丙酮酸钠）
30℃ 4hr
加入萘啶酮酸、盐酸吖锭黄、放线菌酮
30℃ 24hr和48hr
划线接种OXA平板
• 寄主范围：哺乳动物、鸟类、鱼类、甲壳
类和昆虫
流行病学
• 据报道，有1-10%的人类肠道中存在单核
增生李斯特氏菌，4-8%的水产品、5-10% 的奶及其产品、30%以上的肉制品及15% 以上的家禽均被该菌污染。
• 相关食品：鲜奶、巴氏消毒奶、奶酪（尤
其是软奶酪）、冰激凌、生的蔬菜、发酵 过的生肉制作的香肠、生的和加工过的禽 肉、各种生的肉类、生的和烟熏的鱼肉。 约有85-90%的病例是由被污染的食品引起 的。
实验室危害
• 不是一种普遍的与实验室相关的传染病，
目前只有少数有报道的案例发生；
• 直接摄取是最普遍的一种感染方式，除此
之外，暴露在该菌高浓度的气溶胶中，也 可通过眼睛和破损的皮肤、粘膜进入体内 造成感染。
注意事项
• 生物安全2级，操作时应有相应的防污染设
施，在进行可能产生气溶胶的操作时，应 在生物安全柜内完成；
• 触酶阳性，氧化酶阴性。
• 能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、
乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖 （迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木 糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉 子糖、卫矛醇和纤维二糖。
氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟 氨酸均阴性，V露滴状，但随着菌落的增大， 变得不透明。 白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶 血环。 脂上，用45°角入射光照射菌落，通过解 剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰 色。
• 在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰
• 在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)琼
生物学特性
---生化反应
3b、3c、4a、1/2a和4b,后两型尤多。
生物学特性
---抵抗力
• 该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青
储饲料和食品中能长期存活；
• 对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，
70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、 2.5%福尔马林20min 可杀死此菌；
• 湿热灭菌（121℃，至少15min）和干热灭菌
• 由该菌造成的脑膜炎的致死率可高达70%，败血
• 抗生素治疗，用青霉素或氨苄青霉素注射给药，
感染人群
• 感染剂量未知，但与该菌的毒力和易感人群的年
龄、免疫状态有关。
• 易感者：
孕妇/胎儿—围产期和新生儿的感染； 接受皮质激素、抗癌剂治疗、器官移植 治疗、 艾滋病患者等免疫缺损者； 癌症病人— 尤其是白血病的患者； 不太常见的报道—糖尿病、肝硬化、哮喘和溃疡 性结肠炎的患者； 年纪较大的人； 没有免疫缺陷的健康的人，食用污染该菌尤其是 大量污染该菌的食品后，也有患病的危险。
35℃ 24hr-48hr
科玛嘉李氏菌显色培养基
35℃ 24hr
TSA-YE分纯
35℃ 24-48hr
过氧化氢酶试验、革兰氏染色、溶血试验、糖发 酵试验（木糖、鼠李糖）
35℃ 18-24hr
API Listeria
报告结果
各官方方法比较
方法名称 加 工 一次增菌 MBP 30℃，1824h 二次增菌 EB 30℃，24/48h MMA/ OXA （35℃，24-48h） 分离 鉴定 快速方法 蓝色菌落；典型运动；过氧化氢酶； 革兰氏染色；溶血试验；尿素酶试验； 硝酸盐还原；MR-VP；三糖铁；糖发 酵；动力试验；协同溶血*；血清学 检验*；小鼠毒力试验*
• 储存：在有适当标记的密封容器内储存。
检测程序 ---增菌
目前常用的单核增生李斯特氏菌检测 增菌肉汤主要有半量Fraser肉汤、 Fraser肉 汤（FB）、UVM（Modified University of Vermont broth，也叫UVM1）、LEB （Listeria enrichment broth）和BLEB （buffered Listeria enrichment broth）
半量Fraser肉汤和Fraser肉汤
• 具有选择性和区别性。
• 加入柠檬酸铁铵和七叶灵，起到区别的作用。李斯特
氏菌可以水解七叶灵，与培养基中的铁离子反应，使 培养基变黑，可直观的从培养液的颜色就可以判断是 否有单核李斯特氏菌的生长。
• 氯化锂、吖啶黄和萘啶酮酸作为选择性因子。 • 半量Fraser肉汤与Fraser肉汤所用的添加剂一样
1996年至1999年，因单核增生李斯特氏菌回收的食 品种类（来源：USDA及FDA报告）
致病性及其治疗
• 该病的临床表现，健康成人个体出现轻微类似流
感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼 吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发 热、抽搐、昏迷、自然流产或死婴、脑膜炎、败 血症直至死亡。 症的死亡率达50%，围产期或新生儿感染的死亡 率超过80%，怀孕期妇女的感染，母亲通常能存 活下来。 或与氨基糖苷类抗生素一起用药。
• 只有选择性没有区别性
• LEB是在TSB-YE的基础上加入盐酸吖啶黄、
萘啶酮酸和放线菌酮等选择性因子；加入 的丙酮酸钠，有助于受损细胞的恢复；不 含七叶灵和柠檬酸铁铵，无颜色反应
• BLEB是在LEB基础上加入缓冲体系：磷酸二
氢钾和磷酸氢二钠
检测程序 ---分离
• 分离培养基有：OXA、PALCOM、LPM、MOX等，
• 不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化
生物学特性
---血清型
• 根据菌体（O）抗原和鞭毛(H)抗原，将单
增李氏菌分成13个血清型，分别是1/2a、 1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、 4c、4d、4e 和“7”。
• 致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、
半量Fraser肉汤：萘啶酮酸10mg/L，吖啶黄12.5mg/L Fraser肉汤：萘啶酮酸20mg/L，吖啶黄的25mg/L
UVM
• UVM只有选择性没有区别性 • 加入萘啶酮酸和盐酸吖啶黄，作为选择性
因子。虽然其中含有七叶灵，但是没有添 加柠檬酸铁铵，不能发生黑色的颜色反应。
LEB和BLEB
但首选仍然是OXA。分离原理主要是基于李斯特 氏菌具有β－D－葡萄糖苷酶的活性，能水解培养 基中的七叶灵，产生七叶苷，与铁离子产生颜色 反应而，使菌落为棕褐色，并带有褐色晕圈，而 致病性和非致病性李斯特氏菌病都能发生这种反 应 CHROMagar listeria、Rapid’L. mono等，其原理 主要是检测由毒力基因编码的溶血素，而此种溶 血素只存在于单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特 氏菌中，因而可以很好的将此两种菌同李斯特属 的其他种分开。
• 在直接接触有感染性的材料时，必须穿着
实验服，戴手套和护目镜；
• 怀孕的妇女应避免接触传染物。
操作要求
• 溅洒：使气溶胶沉降，穿着防护服装，用
纸巾轻轻覆盖溅洒处，加入1%次氯酸钠溶 液，由周边向中心加，在清理之前要留充 足的接触时间（30min）；
• 废弃：在废弃前应先采取净化措施，高压
蒸汽灭菌、化学消毒、焚烧等；
动力试验：7天，伞形生长 过氧化氢酶试验：阳性 革兰氏染色：阳性短杆菌 溶血试验：穿刺接种血平板 硝酸盐还原试验：5天，阴性 糖发酵试验：葡萄糖、麦芽糖和七叶灵，李斯特 菌属反应均为阳性，除格氏李斯特甘露醇阴性， 李斯特其他种甘露醇阴性，木糖和鼠李糖最有检 测意义
动 力 试 验
血平板
单核增生李斯特氏 菌 ATCC 19117
单核增生李斯特氏菌 检测概述
张惠媛
2005年6月
内容
• 简介李斯特氏菌属 • 单核增生李斯特氏菌生物学特性 • 流行病学 • 致病性 • 实验室危害及其预防 • 检测程序 • 快速检测方法
李斯特氏菌属
李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新 的分类学研究表明，其分为六个种： 单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） 伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 无害李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi） 在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌：单核 增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动 物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类 的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中 最有检测意义的是单核增生李斯特氏菌。
• 还有一些选择性显色培养基，如BCM、ALOA、
OXA平板
单核增生李斯特氏 菌 ATCC 19117 48h，35℃培养
OXA平板
无害李斯特氏菌 ATCC 33090
48h，35℃培养
检测程序 ---鉴定
• 蓝色菌落检验（Henry illumination） • 典型运动：相差显微镜，轻微旋转或翻跟头 • • • • •
生物学特性
---菌体形态及染色特征
• 革兰氏阳性；
• 小的、类似球形杆菌，0.4~0.5×0.5~2µm，在有
些培养基中稍弯，两端钝圆，单个、成短链、细 胞彼此连成V形，或成群的细胞沿长轴方向平行排 列，在较老的或生长不良的培养物中，可能形成 丝状；
鞭毛或1根鞭毛；
• 20-25℃以4根周生鞭毛运动，在37℃只有较少的 • 无芽孢、无荚膜。