李斯特菌检验应用
李斯特菌检验及快检技术
李斯特菌检验及快检技术一、引言1.对李斯特菌的介绍2.李斯特菌的危害性3.检测技术的重要性二、李斯特菌检验技术的基本原理1.传统的检测方法2.分子生物学的检测方法三、李斯特菌快检技术的基本原理1.免疫学快检技术2.核酸检测快检技术四、李斯特菌检验技术的应用1.食品中李斯特菌的检测2.体外环境中李斯特菌的检测五、结论1.总结李斯特菌检测技术的优缺点2.展望李斯特菌检测技术未来的发展方向附注：写论文除了需要提纲，还需要深入调研、资料整理、论文撰写等工作。
如需帮助，欢迎发起新的任务。
第一章：引言李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性的革兰氏杆菌，是一种人畜共患病菌，能够引起严重的人类食源性感染（Listeriosis）。
该菌可以从土壤、水、粪便中分离出来，同时也可以从生食或未经充分加热的食物中分离出来，因此是食品安全领域中的一个相关热点。
根据世界卫生组织的数据，每年全球有超过2000万人感染李斯特菌，其中约70%的患者死亡，还有很多人因为骨髓炎、中枢神经系统炎症等病症而面临长期的治疗和严重的健康风险。
因此，对李斯特菌的检测技术具有极大的现实意义。
第二章：李斯特菌检验技术的基本原理李斯特菌的检测技术可分为传统的检测方法和现代的分子生物学检测方法两种。
1.传统的检测方法传统的李斯特菌检测方法包括了传统的培养法、浸泡法、热激法、膜过滤法、小样品快速检测等。
其中，传统培养法是最常用的方法之一，通过在特定富营养液中定期供气供养菌株，使其持续繁殖，从而可以在培养皿上观察到典型的李斯特菌菌落。
但是，传统的培养法需要数日至数周才能获得结果，无法满足急速检测的要求，此外，还有可能会因为培养条件不当而遗漏不易培养的物种，或者因污染而致假阳性结果。
2.分子生物学的检测方法分子生物学检测法包括了PCR技术、荧光原位杂交技术（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）、核酸芯片技术、蓝色荧光蛋白标记技术（Green Fluorescent Protein, GFP）和基于质谱技术的全扫描方法等。
微生物检验实验室李斯特菌属标准操作规程
微生物检验实验室李斯特菌属标准操作规程1.概述李斯特菌属包括产单核细胞李斯特菌、伊氏李斯特菌、斯氏李斯特菌等菌种，其中产单核细胞李斯特菌对人和动物致病。
2.标本类型血液、脑脊液、尿液、痰、穿刺液、脓液标本。
3.鉴定3.1形态与染色：革兰阳性小杆菌，大小为（0.4~0.5um）×(1~2um),直或微弯，常呈V字形成对排列，偶尔可见双球状；无芽胞，无荚膜，在22~25℃形成周鞭毛，有动力，37℃时鞭毛很少或无。
3.2培养特性：在血琼脂平板上形成较小、圆形、光滑而有狭窄β溶血环的菌落；在液体培养基中呈均匀浑浊生长；在半固体培养基中，动力自穿刺线向四周蔓延生长，呈倒伞状。
3.3生化反应：触酶试验阳性；分解葡萄糖、鼠李糖、水杨苷，不分解蔗糖、木糖、甘露醇；吲哚、尿素酶和硝酸盐还原试验阴性，甲基红、VP和CAMP试验阳性。
3.4鉴别要点：3.4.1本菌特征：革兰阳性短杆菌，菌落较小，有狭窄的℃时无动力；触酶试验阳性，37℃时有动力，25溶血环；β．分解葡萄糖、水杨苷，不分解甘露醇。
3.4.2 与肠球菌的鉴别本菌具有耐盐、耐碱、耐胆汁等特点，易误为粪肠球菌，两者可用触酶试验加以鉴别。
3.4.3 与无乳链球菌的鉴别本菌也可能因培养条件不同而呈链状，37℃培养往往无动力，CAMP试验阳性，常误为B 群链球菌；链球菌触酶试验阴性可与之鉴别。
3.5 操作步骤3.5.1 涂片染色观察菌落特征，在血平板上挑取可以菌落，涂片染色镜检。
3.5.2 触酶试验参见《触酶试验标准操作规程》3.5.3 鉴定从血平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。
4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSI M100-S20最新版本文件.5.质量控制参见《质量控制程序》6.检验结果解释与分析本菌容易被认为是污染的杂菌（类白喉杆菌）而丢弃。
幼龄培养呈革兰阳性，48h后多转为革兰阴性。
因此当遇到25℃培养有动力的杆菌，而按照革兰阴性杆菌鉴定不符时，应考虑到李斯特菌的可能。
单核细胞增生李斯特菌LAMP_检测方法的建立及应用
现场检测。
关键词 单增李斯特菌；环介导等温扩增；ａｃｔＡ 基因
中图分类号 ＴＳ ２０７．４ 文献标识码 Ａ
文章编号 ０５１７－６６１１（２０２３）１０－００７４－０５
摘要 ［目的］建立一种单核细胞增生李斯特菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）环介导等温扩增（ｌｏｏｐ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ） 检
测方法，并对其检测敏感性、特异性进行评价。 ［方法］针对单增李斯特菌的 ａｃｔＡ 基因序列，设计 ６ 条 ＬＡＭＰ 特异性引物，通过对 ＬＡＭＰ
备模拟样本。 挑取参考株 ＣＭＣＣ５４００６ 单菌落接种到 ５ ｍＬ
ＢＨＩ 液体培养基，３７ ℃ ２２０ ｒ ／ ｍｉｎ 增菌直至 ＯＤ６００ 达到 ０．６，吸
取 １００ μＬ 增菌液到 ９００ μＬ ＰＢＳ 缓冲液中进行连续 １０ 倍稀
释，得到 ６．４×１０４ ＣＦＵ ／ ｍＬ 的菌液。
在市场中采集 ３６２ 份速冻肉类及肉加工制品，取 ２５ ｇ 样
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ）、阪崎肠杆菌（ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ）、河流
菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）、创伤弧菌（ Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ），购自中国医
学细菌菌种保藏管理中心。
试验主 要 试 剂： 培 养 基 购 自 北 京 陆 桥 公 司； ＭｇＳＯ４ 、
应用，如荧光定量 ＰＣＲ 技术、重组酶聚合酶扩增技术、ＣＲＩＳＰＲ
果，该试验通过加入 ０．２ μＬ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ （１０×）染料，加入反
listeria李斯特菌的检验
5
4 12 3
4
5 13 3
6
4 12 2
11(91.67)
4(80) 10(71.4) 3(75)
3(25)
3(60) 11(78.5) 2(50)
各类熟食
总计
50
478
18
57
16(88.9)
47(82.5)
13
12
14
14(77.78)
46(80.7)
11(61.1)
30(52.6)
LM的实验室检测方法
单核细胞增生性李斯特菌 分离鉴定
上海市疾病预防控制中心 微生物室 许学斌
分类学
单核细胞增生性李斯特菌（人兽共患病原菌）
无害李斯特菌
绵羊李斯特菌伊氏亚种（偶致动物发病）
绵羊李斯特菌伦敦亚种 威氏李斯特菌 斯氏李斯特菌 格氏李斯特菌 默氏李斯特菌
流行病学
• 单核细胞增生性李斯特菌（简称LM）广 泛存在于自然界中，不易被冻融，在土 壤、地表水、污水、废水、植物、青储 饲料、烂菜中均有存在，易被禽畜类动 物食入或在宰杀过程中污染胴体而形成 人的食源性疾病污染源；乳及含乳类制 品是另一大类较易被污染的食品，近年 来，国外加强了对即食类食品（read-toeat）的LM检测。严防“病从口入”。
李斯特菌属生物学特征
• 李斯特菌属为兼性厌氧菌，不产生 芽孢，无分支，革兰阳性短杆菌， 细胞单生或短链状。 • 最适生长温度为30~37℃，但能在 4℃缓慢生长。
一般培养和生化特征
• 李斯特菌属在较老的或粗糙型培养 物上可能呈6~20μm的丝状菌体，在 28℃培养的菌体有1~5根周鞭毛，可 运动，在营养琼脂上37℃培养1~2d 为1~2mm菌落，在45℃角透射光斜 射下呈蓝灰色。
单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究
单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究引言：单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种潜伏在食品中常见的致病菌，能引起严重的食物中毒，威胁着人类的健康与生命安全。
因此，研究和发展一种快速、高效的检测技术对于食品安全至关重要。
本文旨在探讨目前关于单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术的研究进展，并为进一步的研究和应用提供参考。
一、单核细胞增生性李斯特菌简介单核细胞增生性李斯特菌是一种革兰氏阳性菌，能在广泛的温度（0-45℃）和pH（4.4-9.6）范围内生长，且具有金属抗药性。
在食品中，该菌可以通过肉类、蔬菜和奶制品等途径传播，使其成为食品安全的重要隐患之一。
由于该菌对常规的煮沸和加热处理具有一定的抵抗能力，因此需借助有效的检测技术对其进行快速、准确的检测。
二、传统检测方法的局限性目前常用的单核细胞增生性李斯特菌检测方法主要包括传统培养方法、蛋白酶结合效应（ELISA）和分子生物学方法等。
然而，这些方法存在着以下局限性：1. 传统培养方法耗时长，需要较长的培养时间才能获得结果，无法快速检测；2. ELISA方法虽然具有较高的灵敏度和特异性，但其需要复杂的样品处理和实验步骤，使得检测过程繁琐；3. 分子生物学方法虽然能够提供较快的检测结果，但其仪器成本高，技术要求较高，限制了其在实际应用中的推广。
三、快速检测技术的研究进展随着科学技术的发展，研究人员不断探索和开发更为快速、准确的单核细胞增生性李斯特菌检测技术。
以下是几种常见的快速检测技术：1. 荧光定量聚合酶链反应（qPCR）技术：该技术以其高效、精确和快速的特点，被广泛应用于单核细胞增生性李斯特菌的检测。
qPCR技术可以快速扩增和定量样品中的特定基因片段，结合荧光定量技术实现李斯特菌的快速检测和定量。
2. 微生物芯片技术：微生物芯片是基于生物芯片技术的一种新型检测平台，可实现对多种菌种的快速识别和检测。
研究人员通过设计特定的探针，可以在芯片上同时检测多种致病菌，包括单核细胞增生性李斯特菌，提高了检测效率和准确性。
单核细胞增生李斯特菌检验
血清学分型:
Lm是根据O抗原和H抗原的差异进行血清 学分型.虽然Lm有16种血清型,1/2a、1/2b 、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、 4d、4e、5、6a、6b和7,但只有3种血清型 <1/2a、1/2b、4b>可引起疾病.从食品和患 者中分离的菌株95％以上是1/2a,1/2b,1/2c 和4b等血清型,而3a、3b、3c、4a、4c、4e 、4d和7等血清型在食品中非常少见,也没 有引起李斯特菌病的报道.
溶血反应 ＋ － ＋ － ＋ －
协同溶血
葡萄糖
麦芽糖
MR-VP
甘露醇
鼠李糖
木糖
七叶苷
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V
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V
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动力试验
将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM培 养基中,于30℃培养24h-48h,李斯特菌有动力, 呈伞状生长.
PCR检测方法：〔1取1ml被检样李斯特氏 菌增菌肉汤用于提取DNA的,模板DNA的 制备, 根据试剂盒说明书进行；〔2PCR反 应体系：20μl .
H2O<二馏灭菌水>12.8μl,
10×buffer2.0μl,
Mg2+<25mol/l> 2.0μl,4×dNTP<10mmol/ml> 1.6μl,Primer<30pmol/μl>各0.25μl,
单核增生李斯特氏菌检测概述
单核增生李斯特氏菌检测概述单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性的致病菌，能够在低温下生存繁殖，并在恶劣环境中形成生物被膜，使其对抗不良条件。
该菌可引起人类的李斯特菌病（Listeriosis），也是一种可以通过食品传播的重要病原体。
李斯特菌病在免疫功能低下的人群中很容易引起严重感染，包括孕妇、老年人、免疫抑制患者和新生儿。
检测单核增生李斯特氏菌的方法主要包括传统的培养方法和现代的分子生物学方法。
1.传统培养方法传统的培养方法是检测单核增生李斯特氏菌的主要方法之一、常用的培养基包括PALCAM（Polymyxin, Acriflavine, Lithium chloride and Cycloheximide）和OXOID Listeria Selective Agar等。
培养温度通常在30-37℃之间，因为单核增生李斯特氏菌可以在低温下生长。
在培养过程中，从食品样品或其他可能受污染的样品中提取菌落，并在培养基上进行培养。
培养时间通常为1-2天，培养过程中需要注意去除其他菌落的干扰。
2.分子生物学方法分子生物学方法是现代检测单核增生李斯特氏菌的常用方法，主要包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR等。
这些方法的优势在于其高度敏感性和特异性。
通过检测单核增生李斯特氏菌特有的基因或序列，可以快速准确地鉴定与检测其存在。
3.培养与分子生物学相结合的方法为了更好地检测单核增生李斯特氏菌，有些方法将传统培养与分子生物学相结合。
这种方法通常先进行培养，然后使用PCR或实时荧光定量PCR等技术进行进一步检测和鉴定。
这种方法较为耗时，但能够进一步提高检测的准确性。
需要注意的是，由于单核增生李斯特氏菌能够在低温下生存，因此在食品或样品中的检测非常重要。
常见的食品样品包括生肉、海鲜、冷冻食品、奶制品等。
对于食品企业来说，建立完善的食品安全管理体系和进行规范的监测是防止单核增生李斯特氏菌传播的重要措施。
李斯特菌检验及快检技术
（Ｍ ＦＬＰ） 的 方 法 、 欧 盟 食 品 安 率 。 快 速 检 测 方 法 主 要 包 括 以 下 三 联 荧 光 分 析 法 （ＥＬＦＡ）、 金 标 免 等 检 测 体 系 大 类 检 测 技 术 。
析 技 术 和 流 式 细 胞 技 术 等 。
ｎ＝５，ｃ＝０，０
６６ ｌ 《质量与认证》２０１５·６
（ＧＢ ４７８９） 和 检 验 检 疫 行 业 标 研 究 和 产 品 认 证 体 系 相 对 成 熟 ， 已 与传 统 方法 的检测 结 果无显 著 性差
准 （ＳＮ） 、 国 际 化 标 准 化 组 织 开 发 出 各 种 快 检 系 统 和 自 动 化 仪 别 。
动 力 试 验 ； 染 色 镜 检 （革 兰 氏染 色 、典 型 运 动 ） ；生 化特 性 （Ｍ Ｒ＿ＶＰ、糖发 酵 ） ；溶 血 试 无 验 ；协 同溶血 ；或生化鉴 定试剂 盒或全 自动微 生
物 生 化 鉴 定 系统
李 斯 特 菌 极 新西 兰 货 架 期 长 的冷 藏 食 品
其 他 即食 食 品
易 污 染 食 品 ， 其 中国香港 冷藏食 品 （冷凝食 品除外）或婴儿食品
０／２５ｇ ０／２５１￣
０／２５ｇ ＜ １ＯＯＣＦＵ／ｇ ０／２５ｇ
不 适 用 不 适 用
中 对 冷 藏 食 品 和 中 国 大 陆 即食 肉制 品
■■＿
——
检 测
Ｔｅｓｔ
『＿］
李斯特茵检验及快 检技 术
文 ／陶 文 靖
一一一一
一一一一
。
菌 髓 生 一
李 斯 特 茵 广 泛 存 在 于 环 境 中 ， 即 食 食 品 的 危 害 最 为 严 重 ， 各 国 在 很 多 食 品 中 均 有 检 出 ，该 菌 在 低 均 制 定 了 食 品 中 李 斯 特 菌 的 限 量
李斯特菌检验及快检技术的研究报告
李斯特菌检验及快检技术的研究报告李斯特菌是一种被广泛认为对人体有害的食品中毒病原菌，其分布广泛且传染性较强。
因此，在食品安全控制中尤为重要。
本文主要介绍李斯特菌的检验方法和快检技术的最新进展。
一、李斯特菌的检验方法（一）传统培养法传统的李斯特菌检测方法是通过样品的预处理、富集和分离步骤来完成的。
李斯特菌需要在富集培养基中生长，通常选择一种或多种具有选择性和增菌性的富集培养基，如LPM（리스테리아\r모노사이토제식\r보피드학）和HWA（하모니방법）等。
在此基础上，使用不同的培养基和方法，如PALCAM（Polymyxin A、Acriflavine、Lithium Chloride、Ceftazidime、Aesculin、Mannitol）或Oxford等培养基，可以有效地筛选和鉴定李斯特菌。
（二）分子生物学检测法分子生物学技术对于敏感性和特异性都要求更高，因此被广泛应用于李斯特菌检测。
PCR（聚合酶链式反应）是其中的一个典型应用，它可以在分子水平上鉴定李斯特菌，并且具有快速、灵敏、特异的优势。
与传统的培养方法相比，PCR可以在几个小时内从食品病原菌中检测出李斯特菌，同时避免了富集培养的步骤，具有高度的可重复性和快速性。
二、快速检测技术的研究进展由于李斯特菌的高度危害性和迅速传播性，快速检测技术在食品安全保障方面变得至关重要。
目前，研究者正在寻找各种快速检测方法，以检测李斯特菌的存在和数量。
（一）基于拉曼光谱的检测技术近年来，拉曼光谱技术已经成为基于光谱学的分析方法的重要应用。
对于肉类、水果、蔬菜等样品等食品，无需处理即可直接检测李斯特菌。
使用Raman光谱技术可以获得高质量的特征光谱，并且具有快速、无损伤、可重复性高的优点，因此被视为一种有前途的李斯特菌检测方法。
（二）基于表面增强拉曼光谱的检测技术通过在样品表面添加纳米颗粒，可以增强红外或拉曼光谱的信号，从而提高检测灵敏度。
基于表面增强拉曼光谱技术的引入，为李斯特菌检测技术的集成光谱学提供了新的方法。
李斯特菌检测方法
李斯特菌检测方法
李斯特菌检测方法包括传统的培养方法和分子生物学方法。
传统的培养方法包括：
1. 食物中毒患者粪便、脑脊液、血液等标本的培养：将标本接种于含有富营养的培养基中，如PALCAM、Fraser等培养基，经过24-48小时的培养，观察是否出现李斯特菌的生长。
2. 食品和环境样品的培养：将样品接种于含有富营养的培养基中，如OXOID Brilliance Listeria Agar、PALCAM等培养基，经过24-48小时的培养，观察是否出现李斯特菌的生长。
分子生物学方法包括：
1. PCR检测：通过PCR扩增李斯特菌的DNA序列，检测样品中是否存在李斯特菌。
2. 实时荧光PCR检测：利用实时荧光PCR技术，通过检测PCR反应体系中荧光信号的变化，快速、准确地检测样品中的李斯特菌。
3. 基因芯片检测：利用基因芯片技术，检测样品中李斯特菌的DNA序列，快速、高通量地检测李斯特菌。
4. 免疫学检测：利用抗体对李斯特菌进行检测，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光免疫分析（FIA）等方法。
食品源单增李斯特菌的分离鉴定及耐药性检测
食品源单增李斯特菌的分离鉴定及耐药性检测食品源单增李斯特菌的分离鉴定及耐药性检测引言：李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，可以通过食物传播给人类，并引发李斯特菌感染。
李斯特菌感染是一种严重的食物中毒疾病，可能导致严重的并发症甚至死亡。
因此，对食品中的李斯特菌进行分离鉴定及耐药性检测非常重要，以确保食品的安全性。
分离鉴定方法：1. 样本采集：从怀疑被污染的食品中，选择不同部位的样本进行采集，如肉类、奶制品、蔬菜等。
2. 李斯特菌分离：将样本加入到富营养培养基中，在适宜的温度下（37℃），培养16-24小时。
然后将培养液进行测定，寻找典型的李斯特菌菌落。
3. 形态特点观察：通过显微镜观察菌落的形态特征，如形状、颜色等。
4. 生化性质检测：经过形态观察后，选取具有典型形态特征的菌落用于进一步的生化测试，如靶心李斯特菌鉴定板、鲁埃斯鸟氏培养基等。
5. PCR检测：利用李斯特菌特异性基因进行PCR鉴定，以确认是否为李斯特菌。
耐药性检测方法：1. 选择抗生素：选择常见的抗生素，包括头孢呋辛、青霉素、氨基糖苷类药物等，同时也选择一些非常见的抗生素，以探索其耐药性情况。
2. 可兰霉素敏感测试：可通过培养基中加入不同浓度的可兰霉素，观察菌落的生长情况，确定最低抑菌浓度（MIC）。
3. 扩散法：将李斯特菌涂布在富营养培养基上，然后将不同抗生素药片放置在不同区域，观察菌落生长与否。
4. PCR检测：利用PCR方法检测耐药基因的存在情况，进一步确定李斯特菌的耐药性。
讨论：通过以上的分离鉴定及耐药性检测方法，可以有效地检测食品样本中的李斯特菌，并了解其耐药性情况。
应用这些方法，可以及早发现李斯特菌的污染源，并采取相应的措施来控制和预防李斯特菌感染的发生。
此外，这些方法也可为食品监测部门提供参考，加强对食品安全的监管。
结论：李斯特菌是一种严重的食源性病原菌，对人类健康构成潜在威胁。
食品中单增李斯特菌检验方法的应用分析
食品中单增李斯特菌检验方法的应用分析摘要：目的：单增李斯特菌定性检测结合实时荧光PCR和MPN计数法，在食品源性致病菌检测中快速进行定性和定量检测。
方法：将单增李斯特菌的菌悬液样品依据不同浓度用细菌培养法和实时荧光PCR法进行比较；分别对当日、冷冻2小时和6小时的增菌液进行MPN计数法定量检测，对三种情况下MPN计数结果进行比较。
结果：细菌培养法和实时荧光PCR法检测两者结果一致；MPN计数法定量检测，（1）和（2）结果吻合，与（3）结果有差异。
结论：实时荧光PCR检测和MPN计数法相结合，避免样品细菌培养法检测出阳性结果，定量检测时重新取样而导致的结果差异，减短检验周期和工作量，使工作效率得到提升。
关键词：食品；单增李斯特菌；检验方法连年来，因食品污染单增李斯特菌导致食品中毒的事件逐渐增多，引起社会各界的广泛关注。
单增李斯特菌是一种人畜共患病的病原菌[1]，多存在于土壤、水产品和动物中，食物中涉及较多的是急冻食品、生菜食物和熟食店食物等。
易感人群为新生儿、孕妇和40岁以上的成年人，临床症状表现为发热、化脓性结膜炎和败血症等，死亡率高达30%以上。
本文将从实时荧光定量PCR法和MPN计数法相结合，对单增李斯特菌定量检测进行研究，有关情况如下。
1.材料与方法1.1仪器和试剂标准菌株采用我市提供的50000株单增李斯特菌，使用实时荧光定量PCR仪和离心机，选取实时荧光定量PCR试剂、全自动微生物鉴定仪和革兰氏阳性细菌鉴定卡，培养基选自李氏增菌肉汤等，均在有效期内使用培养基和试剂。
用脑心浸液培养基将80℃标准菌株过夜培养温度控制在30℃，科玛嘉单李斯特显色琼脂平板培养24小时，温度设置为36℃至37℃。
菌落的挑选规格为天蓝色、大小适中和周围有白色晕环，将菌落接种于脑心浸液琼脂平板分纯24小时30℃，菌液的浓度利用生理盐水控制在0.5至0.6麦氏单位，将调整好的菌液作为原液，1ml菌液和9ml无菌生理盐水放在试管中，把试管的液体进行均匀搅拌，制作成10-1菌液，重复上面的步骤，菌液制作成10位系列菌液。
李斯特菌国标检测方法
李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食品中毒致病菌，因此针对食品中的李斯特菌进行检测具有重要意义。
以下是常见的李斯特菌国际标准检测方法：
1.ISO 11290-1和ISO 11290-2标准：这是国际上普遍采用的李斯特菌检测方法标准。
ISO
11290-1标准适用于从食品中检测李斯特菌，而ISO 11290-2标准适用于从环境样品中检测李斯特菌。
这两个标准包括了样品的处理、富集培养、筛选培养和鉴定等多个步骤，具有较高的检测灵敏度和准确性。
2.FDA-BAM方法：美国食品药品监督管理局（FDA）发布了一系列的BAM（Bacteriological
Analytical Manual）方法，其中包括了用于李斯特菌检测的方法。
这些方法通常与ISO 标准方法类似，但在一些具体操作步骤上可能会略有不同。
3.PCR法：聚合酶链式反应（PCR）是一种快速、灵敏的李斯特菌检测方法，可以在较短
的时间内得出检测结果。
PCR方法已被广泛用于食品和环境样品中的李斯特菌检测。
4.基于质谱技术的检测方法：质谱技术如MALDI-TOF质谱法也被用于李斯特菌的快速鉴
定和检测。
需要注意的是，针对不同的样品类型和具体要求，可能会选择不同的检测方法和标准。
在进行李斯特菌的检测时，建议按照相关的国际标准或当地法规要求进行操作，并严格遵循相应的实验室操作规程。
《噬菌体蛋白应用于李斯特菌快速检测技术研究》
《噬菌体蛋白应用于李斯特菌快速检测技术研究》一、引言李斯特菌是一种常见的食源性致病菌，对人类健康构成严重威胁。
其具有极高的耐寒性和耐腐性，广泛存在于各种食品中，如肉类、蔬菜、奶制品等。
因此，快速、准确地检测李斯特菌对于保障食品安全具有重要意义。
近年来，随着生物技术的不断发展，噬菌体蛋白在细菌检测中的应用逐渐受到关注。
本文旨在探讨噬菌体蛋白在李斯特菌快速检测技术中的应用研究。
二、噬菌体蛋白概述噬菌体是一种能够感染和裂解细菌的病毒。
噬菌体蛋白是噬菌体裂解细菌时释放的一种酶类物质，具有很高的特异性。
它们对宿主细菌有极高的亲和力和破坏力，对非宿主细菌则无影响。
因此，利用噬菌体蛋白进行细菌检测具有很高的准确性和特异性。
三、噬菌体蛋白在李斯特菌检测中的应用（一）技术原理利用噬菌体蛋白的特异性识别和裂解功能，当含有李斯特菌的样品与噬菌体蛋白混合时，噬菌体蛋白会迅速识别并裂解李斯特菌，产生特定的反应信号。
通过检测这种信号的强度和变化，可以快速准确地判断样品中是否存在李斯特菌。
（二）实验方法实验方法主要包括样品处理、噬菌体蛋白制备、混合反应及结果检测等步骤。
首先对样品进行预处理，如均质化、离心等，以便更好地提取和分离出目标细菌。
然后制备噬菌体蛋白，将其与处理后的样品混合，进行反应。
最后通过特定的检测方法（如荧光法、PCR法等）检测反应信号，判断样品中是否存在李斯特菌。
（三）技术优势与传统的细菌培养法相比，利用噬菌体蛋白进行李斯特菌检测具有以下优势：一是检测速度快，可以在短时间内完成；二是准确性高，具有很高的特异性和灵敏度；三是操作简便，无需复杂的设备和繁琐的步骤；四是成本低廉，适合大规模应用。
四、实验结果与分析通过实验验证了噬菌体蛋白在李斯特菌检测中的有效性。
实验结果表明，该方法可以在短时间内快速准确地检测出样品中的李斯特菌，且具有较高的特异性和灵敏度。
同时，该方法操作简便、成本低廉，适合大规模应用。
此外，该方法还具有良好的稳定性，能够在不同条件下保持较高的检测性能。
PALCAM平板对李斯特氏菌的检测
PALCAM平板对李斯特氏菌的检测品种名称：PALCAM平板品种编号：029970PALCAM平板用途：用于单增李斯特氏菌的选择性分离培养。
单增李斯特氏菌介绍：单核增生李斯特菌是一种常见的土壤细菌，在土壤中它是一种腐生菌，以死亡的和正在腐烂的有机物为食。
它也是某些食物(主要是鲜奶产品)中的一种污染物，能引起严重食物中毒。
单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。
它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。
培养基使用原理：蛋白胨提供生长必须的碳氮源;酵母膏粉和淀粉提供碳氮源、维生素和生长因子;氯化钠可维持均衡的渗透压;葡萄糖提供碳源;李斯特氏菌水解七叶苷与铁离子反应形成黑色的6,7-二羟基香豆素;甘露醇是可发酵的糖，酚红是pH指示剂;氯化锂和其它的抗生素能抑制革兰氏阴性菌和大多数革兰氏阳性菌;琼脂是培养基的凝固剂。
图：贮存：贮存于4-8℃。
贮存期三个月。
规格：20个/盒PALCAM平板培养基配方(每升)：蛋白胨23.0g淀粉1.0g酵母膏粉3.0g氯化钠5.0gD-葡萄糖0.5gD-甘露醇10.0g柠檬酸铁铵0.5g七叶苷0.8g氯化锂15.0g酚红0.08g琼脂13.0g盐酸吖啶黄素0.5mg硫酸多粘菌素B1mg复达新2.0mg最终pH 7.2±0.2PALCAM平板使用方法：1、取待检菌划线接种于PALCAM平板上，于35℃±1℃培养24h～48h。
2、观察结果。
李斯特氏菌在平板上生长24h后菌落呈黑色，直径为1mm，在其周围形成一个黑色环，培养48h，菌落仍呈黑色，直径2mm～3mm，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。
质量控制：质控菌株接种后于37℃培养24h结果如下：菌名菌号生长状况单核细胞增生李斯特氏菌CMCC(B)54002 良好大肠埃希氏菌 ATCC25922 受抑制粪链球菌CMCC(B)32223 受抑制。
李斯特菌检验应用
李斯特氏菌李斯特菌李斯特菌（也称李氏杆菌）引起的急性传染病，以败血病为主要症状，伴有内脏器官和中枢神经系统病变。
李斯特菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的，为纪念近代消毒手术之父、英国生理学家约瑟夫·李斯特（1827～1912），1940年被第三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。
单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。
它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。
李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。
肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。
李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。
其中单增李斯特菌是唯一能引起人类疾病的。
单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的李斯特菌快速检测试剂盒1、分布广：存在于土壤、水域(地表水、污水、废水)、昆虫、植物、蔬菜、鱼、鸟、野生动物、家禽。
2、生存环境可塑性大：能在2-42℃下生存(也有报道0℃能缓慢生长)能在冰箱冷藏室内较长时间生长繁殖。
3、适应范围大：酸性、碱性条件下都适应。
4、带菌较高的食品有：牛奶和乳制品；肉类(特别是牛肉)；蔬菜；沙拉；海产品；冰淇凌单核细胞李斯特菌在半固体培养基上生长情况李斯特菌具有较强的反抗力，秋冬时期在土壤中能存活5个月以上，在冰块内也可存活3～5个月，许多冷冻肉类都是它的“温床”。
这种细菌对高温的反抗力也比较强，能在100℃下挺15～30分钟，在70℃下可存活30分钟以上。
单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。
食品中李斯特菌的检测原理
食品中李斯特菌的检测原理=================样品采集与处理--------样品采集样品采集应选择有代表性的样品，包括食品的各个部分，尤其是容易受到污染的部分。
采集的样品量应足够进行检测和确认。
样品处理样品采集后应立即进行处理。
根据食品的类型和检测目标，可能需要进行不同的预处理步骤，如粉碎、混合、均质化等。
处理后的样品应妥善保存，以防止细菌的死亡或污染。
增菌培养----增菌培养是检测食品中李斯特菌的重要步骤。
通过在选择性培养基上进行培养，可以增加样品中李斯特菌的数量，使其更容易被检测。
选择性增菌选择性增菌是在特定的培养基中添加一些抑制剂和选择性试剂，以抑制其他细菌的生长，促进李斯特菌的繁殖。
常用的选择性培养基包括麦芽糖选择性培养基和胰蛋白胨大豆琼脂培养基。
富集培养富集培养是一种在非选择性培养基中培养样品的方法，以增加所有细菌的数量。
这可以增加李斯特菌在样品中的比例，使其更容易被检测。
分离培养----分离培养是在选择性培养基上将李斯特菌从其他细菌中分离出来。
常用的显色培养基包括李斯特菌显色培养基和脑心浸液肉汤。
这些培养基可以提供更好的分离效果，并使李斯特菌更容易被观察和识别。
初步鉴定----初步鉴定是通过形态学和生化试验对分离得到的细菌进行初步鉴定。
形态学鉴定包括观察细菌的形状、大小、染色特性等。
生化鉴定包括对细菌进行一系列生化试验，如糖发酵试验、柠檬酸盐利用试验等，以确定其属性和特点。
初步鉴定可以帮助确定分离到的细菌是否为李斯特菌。
最终鉴定----最终鉴定是通过分子生物学和血清学方法对初步鉴定结果进行确认。
分子生物学鉴定包括对细菌进行基因测序或PCR扩增，以确定其特定基因的存在和特征。
血清学鉴定包括使用特定抗体进行免疫反应试验，以确定细菌的抗原-抗体反应特征。
最终鉴定可以提供更准确的结果，并帮助确定食品中是否含有李斯特菌。
结果报告----检测完成后应将结果报告提交给相关机构或客户。
报告应包括以下内容：阳性结果如果检测结果显示食品中存在李斯特菌，则应报告该结果为阳性。
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李斯特氏菌李斯特菌李斯特菌（也称李氏杆菌）引起的急性传染病，以败血病为主要症状，伴有内脏器官和中枢神经系统病变。
李斯特菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的，为纪念近代消毒手术之父、英国生理学家约瑟夫·李斯特（1827～1912），1940年被第三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。
单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。
它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。
李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。
肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。
李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。
其中单增李斯特菌是唯一能引起人类疾病的。
单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的李斯特菌快速检测试剂盒1、分布广：存在于土壤、水域(地表水、污水、废水)、昆虫、植物、蔬菜、鱼、鸟、野生动物、家禽。
2、生存环境可塑性大：能在2-42℃下生存(也有报道0℃能缓慢生长)能在冰箱冷藏室内较长时间生长繁殖。
3、适应范围大：酸性、碱性条件下都适应。
4、带菌较高的食品有：牛奶和乳制品；肉类(特别是牛肉)；蔬菜；沙拉；海产品；冰淇凌单核细胞李斯特菌在半固体培养基上生长情况李斯特菌具有较强的反抗力，秋冬时期在土壤中能存活5个月以上，在冰块内也可存活3～5个月，许多冷冻肉类都是它的“温床”。
这种细菌对高温的反抗力也比较强，能在100℃下挺15～30分钟，在70℃下可存活30分钟以上。
单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。
据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16%,有70%的人可短期带菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。
人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。
该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿,栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有1、形态与染色单核细胞增多性李斯特菌鞭毛染色该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。
2、培养特性该菌营养要求不高，在20--25℃培养有动力，穿刺培养2�5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。
该菌的生长范围为2--42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培养温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.8�4.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。
在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。
在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。
在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用450角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。
3、生化反应电子显微镜下的单核细胞增多性李斯特菌该菌触酶阳性，氧化酶阴性，能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖，不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。
4、血清型根据菌体（O）抗原和鞭毛(H)抗原，将单增李氏菌分成13个血清型，分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“7”13 个血清型。
致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后两型尤多。
5、抵抗力该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和干草内能长期存活，对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔澳洲食物中毒引发高度关注单增李斯特菌进入人体是否得病与菌量和宿主的年龄免疫状态有关，因为该菌是一种细胞内寄生菌，宿主对它的清除主要靠细胞免疫功能，因此，易感者为新生儿、孕妇、40岁以上的成人，免疫功能缺陷者。
潜伏期在感染后3-70天出现症状，健康成人可出现轻微类似流感症状，易感者突然发热，剧烈头痛、恶心、呕吐、腹泻、败血症、脑膜炎、孕妇出现流产。
病性机理单增李氏菌的抗原结构与毒力无关，它的致病性与毒力机理如下：1、寄生物介导的细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞；2、抗活化的巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内的过氧物（为杀菌的毒性游离基团）分解；3、溶血素，即李斯特杆菌溶血素O，可以从培养物上清液中获得，为SH活化的细胞溶素，有α和β两种，为毒力因子。
临床表现单核细胞增多性李斯特菌健康成人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产、脑膜炎、败血症直至死亡。
控制单增李斯特氏菌在一般热加工处理中能存活，热处理已杀灭了竞争性细菌群，使单增李斯特氏菌在没有竞争的环境条件下易于存活，所以在食品加工中，中心温度必须达到70℃持续2分钟以上。
单增李斯特氏菌在自然界中广泛存在，所以即使产品已经过热加工处理充分灭活了单增李斯特氏菌，但有可能造成产品的二次污染，因此蒸煮后防止二次污染是极为重要的。
由于单增李斯特氏菌在4℃下仍然能生长繁殖，所以未加热的冰箱食品增加了食物中毒的危1、增菌培养1. 将未开封的测试片贮藏在<= 8 oC (46 oF)的环境下，并在包装上标示的有效期内使用。
在高湿度的地方，最好在使用前将测试片回复到室温。
取回的样品应在4℃下处理、存放和运送，如果是冷冻样品，则在检验前要保持冷冻状态。
取25mL液体或25g半固体或固体样品放入含有225mL无选择性试剂增菌肉汤（EB）的均质杯中进行均质，然后转入三角瓶中，30℃培养4h，加入选择性试剂吖啶黄素、萘啶酮酸和放线菌酮，继续培养20h和44h.。
2、分离共培养24h和48h后，取EB培养物分别在OXA和LPM或加七叶苷/Fe3 LPM琼脂平板上划线。
PALCAM琼脂可替代LPM琼脂。
将OXA和PALCAM平板置于35℃培养24-48h，LPM平板在30℃培养24-48h。
然后，把LPM平板放于解剖镜载物台上，以450角入射光从平板下面照射平板，通过目镜垂直向下观察寻找可疑菌落。
李斯特氏菌在LPM平板上呈有光泽的兰色或灰色。
用已知阳性菌和阴性菌划线的平板作对照。
2. 已开封的测试片，将开口反折，用胶带封好。
加入七叶苷和Fe3 的LPM平板不用斜射光系统，选择可疑菌落的方法与在OXA上选择可疑菌落的方法相同。
在OXA平板上李斯特氏菌菌落周围有一个黑色环，其它菌也可形成黑色环，但形成时间要在两天以上。
李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相似。
在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5个或更多的典型菌落，分别划线于TSAYE平板上以得到更纯、更典型的单个菌落。
食品检验中在TSAYE平板上纯化是必须的，因为在PALCAM和OXA或LPM平板上分离菌落时可能沾有不可见的受抑微生物。
挑取5个典型菌落的原因是一个样品中可能分离到一种以上的李斯特氏菌。
30℃TSAYE平板培养24-48h，如果不用于动力观察，也可在35℃培养。
3、鉴定步骤3. 为防止暴露于潮湿的环境中，请不要冷藏已开封的测试片。
将胶带封好的测试片贮藏在低温干燥的地方，保持时间不超过1个月。
请勿将测试片放在温度> 25 oC (77 oF)和(或)相对湿度> 50%的环境中。
（1）观察TSAYE平板通过斜射光观察，寻找呈兰灰至兰色菌落。
在TSAYE上用已知菌作对照。
（2）、从30℃或更低温度下培养的TSAYE平板上挑取典型菌落做成湿玻片在油镜下观察。
湿玻片用0.85%生理盐水菌悬液制成。
如果菌量太少，菌体黏附于载玻片上而呈现非运动性。
李斯特氏菌是细短杆菌，可见轻微的旋转及翻滚。
与已知的李斯特氏菌的对照相比，球形、大的杆状且快速泳动的都不是李斯特氏菌。
（3）挑取典型菌落进行过氧化氢酶实验，李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性反应。
（4）取16-24h的培养物进行革兰氏染色，李斯特氏菌呈革兰氏阳性杆菌。
但是陈旧培养物革兰氏染色会发生变化，而且菌体可成球形。
在染色过重的玻片上菌体有呈栅状排列的趋势，易误认为白喉菌而错判。
4. 用涂抹棒、海棉或其它采样设备收集环境样本。
湿润采样设备的液体应<= 10 mL。
湿润剂可以是无菌水、缓冲蛋白胨水(Buffered Peptone Water, BPW)，或中和缓冲液，如Letheen 肉汤或Dey/Engley (DE)中和肉汤。
（5）挑取典型菌落接种于TSBYE肉汤管中，35℃培养24h用做糖类发酵和其它生化项目实验。
TSBYE肉汤管在4℃下可存放几天，也可反复接种。
（6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺种到5%的绵羊血或马血琼脂平板上，刺种时避免触到平板底部和使琼脂破裂，同时设阳性对照（单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性对照（英诺克李斯特氏菌），35℃培养48h。
单核细胞增生李斯特氏菌呈窄小的β-溶血环。
（7）在明亮的光照下，观察经穿刺的血琼脂平板，单核细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌围绕穿刺点产生较清晰的β-溶血环，英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象，而绵羊李斯特氏菌产生界限明显的较大溶血环，在此不要试图进行种间的区分，但要记录下溶血反应的特征，CAMP试验可区分它们间的溶血反应。