冬瓜SSR-PCR体系优化及引物筛选

合集下载

航天搭载紫花苜蓿SSR-PCR反应体系的优化以及引物的筛选

供试材料．
试验材料为神州二号卫星搭载的４个紫花苜蓿品
种，别是得福（，宝（）阿尔刚金（，得利分Ａ）德Ｂ，Ｃ）三
（。这４个苜蓿品种均为卫星搭载后的当代植株，Ｄ）
（．肃农业大学草业学院，肃兰州７０７；．１甘甘３００２中国农业大学动物科技学院草业科学系，
北京１０９；３甘肃省天水市农科所，肃天水０１３．甘７１０）４００
摘要：航天育种的变异频率高、变异幅度大、益变异多、定性强，势明显。依据正交试验设计有稳优
苜蓿（ｃａｏａｉａ是世界上种植面积最大的Ｍｅｉｇｔ）ｃｓｖ豆科牧草，面积近３３０万ｈ［。具有优质高产，０ｍ］】粗蛋白质含量高，应性广等特点，调整种植业结构，适是
合，大程度的缩短了育种时间。ＳＲ（ｉｌＳ — 很ＳＳｍｐｅｅｑｅｃｅｅｔ由几个碱基组成的基序（ｔ）ｕｎｅＲｐａ）Ｍｏｉ串联重ｆ复而成的ＤＮＡ序列，由于ＳＲ标记呈共显性遗传，Ｓ符
提高土壤肥力，解家畜蛋白质供需矛盾的理想牧缓
草［。目前，国的苜蓿育种主要采用常规育种方法，２］我其应用广泛，于利用不同生态区优良的种质资源培便育出适合当地种植的优良新品种。航天育种的变异频率高、幅度大、有益变异多、定性强，势明显。航天稳优

ssrpcr的原理及应用

SSRPCR的原理及应用1. SSRPCR的概述SSRPCR是一种基于单分子串联递归聚合的扩增方法，具有高效、高精度和高通量等特点。

它利用PCB催化剂和循环反应链（CRC）技术，能够在无需酶的情况下，实现高效的PCR扩增。

SSRPCR的原理及应用正在被广泛研究和应用。

2. SSRPCR的原理SSRPCR的原理基于PCB催化剂和循环反应链技术。

PCB催化剂是一种新型的催化剂，具有高活性和高选择性。

在SSRPCR反应中，PCB催化剂能够在低温下启动PCR扩增反应，并实现高效的循环反应链形成。

循环反应链（CRC）技术是一种用于生成催化剂链的方法，利用PCR反应中的短片段和引物，在每个循环中扩增并连接新的催化剂链。

通过不断扩增和连接催化剂链，形成具有高活性和高选择性的循环反应链。

综合应用PCB催化剂和CRC技术，SSRPCR能够在低温下实现高效的PCR扩增，具有高效、高精度和高通量的特点。

3. SSRPCR的应用SSRPCR在基因分析、疾病诊断和药物研发等领域具有广泛的应用价值。

以下是SSRPCR的主要应用：•基因分析：SSRPCR可以用于基因定位、基因测序和基因突变分析等。

它具有高通量和高精度的特点，能够快速准确地进行基因分析。

•疾病诊断：SSRPCR可以用于疾病的早期诊断和基因检测。

通过对患者样本进行SSRPCR扩增，可以检测出可疑基因突变，从而实现疾病的早期诊断。

•药物研发：SSRPCR可以用于药物的研发和药物靶点的筛选。

通过对药物作用靶点的PCR扩增，可以筛选出具有高活性的药物靶点。

•环境检测：SSRPCR可以用于环境污染物的检测和监测。

通过对环境样本进行SSRPCR扩增，可以快速准确地检测出环境中的污染物。

•食品安全：SSRPCR可以用于食品安全的检测和监测。

通过对食品样本进行SSRPCR扩增，可以检测出食品中的有害物质和微生物，保障食品安全。

4. SSRPCR的优势SSRPCR作为一种新型的PCR扩增方法，具有以下优势：•高效性：SSRPCR在无需酶的情况下，能够实现高效的PCR扩增，节省了酶的使用成本和时间。

油梨基因组DNA提取,SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

油梨基因组ＤＮＡ提取ＳＳＲ－ＰＣＲ反应
体系优化及引物筛选
旨在建立稳定可靠的油梨（ＰｅｒｓｅａＡｍｅｒｉｃａｎａＭｉｌ１）叶片ＤＮＡ的提取方法和ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系及筛选出稳定的油梨ＳＳＲ多态性引物，为开展油梨种质ＳＳＲ分子标记提供遗传研究的基础。以油梨叶片为试材，比较３种油梨叶片ＤＮＡ提取方法；利用Ｌ（４）正交实验设计对油梨ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系进行优化；利用优化的反应体系筛选引物；同时，选取５对多态性引物对４５份油梨种质进行ＰＣＲ扩增，进一步检测该优化体系的稳定性。结果表明，常规２×ＣＴＡＢ法、改良２×ＣＴＡＢ法和植物ＤＮＡ提取试剂盒法等３种ＤＮＡ提取方法中，改良２×ＣＴＡＢ法对油梨基因组ＤＮＡ的提取效果最佳；获得最优反应体系为：２０Ｌ总反应体系中，含约４０ｎｇＤＮＡ模板、１．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇ、０．１５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、Ｏ．５ＵＴａｑＤＮＡ聚合酶、０．５ｍｏｌ／Ｌ引物；以此体系为基础进行引物筛选，从７３对油梨ＳＳＲ引物中筛选出了３０对扩增条带清晰的多态性引物，说明该反应体系可用于油梨ＳＳＲ标记的进一步研究；稳定性检测获得的谱带清晰，表明该优化反应体系是稳定可靠的。由此可见，改良的２×ＣＴＡＢ法可用于油梨叶片ＤＮＡ的大量样本提取，优化后的ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系及筛选出的３０对多态性引物可用于油梨ＳＳＲ标记的进一步研究。【刊】／周海兰（海南大学园艺园林学院热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点

小豆SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

进行合成，另外３０对引物从小豆近缘作物绿豆ＳＳＲ引物中
选择并合成。选用引物Ｘ５７（Ｆ：５一ＣＡＣＡＣＴＹＣＡＡＧＧＡＡＣ —
ＣＴＣＡＡＧ一３，Ｒ：５～ＧＴＡＧＧＣＡＡＣＣＴＣＣＡＴＹＧＡＡＣ一３）为
响小豆ＳＳＲ—ＰＣＲ反应的５个因素（Ｍｇ “浓度、ｄＮＴＰｓ浓度、Ｔａｑ用量、引物浓度、模板ＤＮＡ用量），利用优化后的
ＳＳＲ— ＰＣＲ体系，以ｌ０份小豆种质为模板，对８Ｏ对小豆（５Ｏ对）和绿豆（３０对）的ＳＳＲ引物进行多态性筛选，得出小豆ＳＳＲ—ＰＣＲ的最佳反应体系（２０Ｌ）：Ｍｇ２浓度２．５ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰｓ浓度１．０ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ活性１．５Ｕ，引物浓度０．６￣ｍｏｌ／Ｌ，模板ＤＮＡ用量３０ｎｇ。利用优化后的体系在小豆和绿豆引物中筛选出３１对条带清晰、多态性丰富、重复性好的ＳＳＲ引物，有效扩增率为３８．７５％。小豆ＳＳＲ—ＰＣＲ优化体系的建立及多态性引物的筛选为进一步开展小豆遗传育种研究奠定了基础，为小豆遗传多样性分析和遗传图谱库构建等研究提供了技术参数和理论依据。
ＤＮＡ用量）的最优条件，同时运用优化后的体系进行引物筛
选，旨在建立高效、稳定的小豆ＳＳＲ—ＰＣＲ反应体系，为小豆

SSR引物筛选实验步骤

一.CTAB法提取DNA1.取0.1g嫩叶于研钵中，加少量碳酸钙研磨成浆，加入800μL 65℃预热的CTAB，转移至离心管；2.将离心管置于65℃水浴锅中水浴1h,期间摇5次，混匀；3.取800μL氯仿∶异戊醇（24∶1）加入离心管中，上下颠倒10min,12000rpm离心15min；4.吸取上清液（600~700μL）转移至新的离心管，再加入1/10体积的NaAc（3mol/L）;5.加入等体积-20℃预冷无水乙醇（或异丙醇），轻摇，置于-20℃中10min;6.12000rpm离心10min后弃上清；7.清洗两次：加入500μL 75%乙醇，轻弹，离心5min,再倒出上清液8.清洗两次后晾干，加100μL ddH2O溶解（一般溶解一晚上）；9.溶解后测浓度。

二.8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳1.PCR：测定DNA浓度后将其稀释至100-200（ng/μL）;配10μL PCR体系：4.6μL ddH2O 、2.4μL Mix、2μL DNA模板、1μL引物（引物需稀释10倍；前后引物各0.5μL）PCR温度设置：94℃ 2 m94℃ 30s }50℃ 30s } 35cycles72℃ 30s }4℃ ∞PCR结束后将结果置于-4℃2.各溶液配置：（1）8%非变性聚丙烯酰胺凝胶母液:120ML:40% Acr 24mL2% Bis 13mL10×TBE 12mLddH2O 71mL（2）10×TBE：Tris 108g硼酸55gEDTA 7.44g超纯水定容至1L（3）10% AP:称取10g过硫酸铵，ddH2O溶解，定容至100mL（4）电泳缓冲液：1×TBE：取100mL 10×TBE稀释至1L（5）银染液：1g AgNO3加蒸馏水至1L（6）显影液：20g NaOH+0.4g无水Na2CO3+4mL甲醛，加蒸馏水至1L3.清洗玻璃板、胶条与梳子，擦干表面水分；用无水乙醇按一个方向擦拭玻璃板两遍后，将胶条置于大玻璃板底部，将小玻璃板整齐置于大玻璃板上，确保平整后用夹子固定两边及底部；4.制胶：45mL母液+45μL TEMED+450μL 10% AP搅拌后沿着玻璃板一侧匀速灌胶，保证无气泡，放梳子时留2-3mm在外面，注意别产生气泡；凝40min后缓缓拔出梳子；用1×TBE冲洗胶槽，冲洗后移去夹子和胶条，将玻璃板固定于电泳仪器上，在上下槽加入电泳缓冲液。

杜仲SSR-PCR反应体系建立及引物筛选本科答辩

2 材料与方法
2.1 材料
• 试验材料来自安徽省巢湖市庐江县汤池镇杜仲散生植株，选取健康树16株，每个样本树相距10 m以上。从每株样本树木采集嫩叶，将灰尘脏物擦拭干净，编号，与硅胶装入塑料袋中，带回实验室并保存于-70℃冰箱。
2.2 方法
2.2.1叶片DNA提取
• 从每个样本取20～50 mg冷冻叶片，采用试剂盒DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN，德国)提取杜仲基因组DNA,取 5.0 μL抽提产物，在浓度为0.8 % 琼脂糖凝胶上电泳30 min，经EB染色后在紫外灯下拍照检测是否有DNA条带。利用微量分光光度计NanoDrop ND-1000检测DNA质量，其浓度为70 ng/μL，纯度OD值(A260/A280)为1.9，然后将DNA按1:100稀释，置于-20℃冰箱保存。
杜仲基因组DNA：
图1 杜仲基因组DNA Figure 1 Genomic DNA of E. ulmoides
2.2.2 SSR-PCR反应体系建立、优化及引物筛选
• 为了确定影响PCR 反应的的5个因素(Mg2+浓度、 dNTP浓度、Taq 酶浓度、引物浓度和模板DNA 浓度),采用了L16 ( 45 )的正交设计, 在4个水平上进行了优化试验。因素水平表见表1, L16 ( 45 )设计方案。正交表中的16个试验均重复3次。
• 应用上述最佳反应体系, 用引物引物TUGMS11[26] 对16份杜仲的DNA 进行SSR 扩增,将PCR产物分
别进行琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，显示，引物对大部分DNA 样品均扩增出清晰的目的片断, 说明该体系稳定, 适用于杜仲的SSR 反应。
3.3 SSR引物筛选

山东鹅观草SSR-PCR反应体系的优化和验证

性试验结果表明该反应体系有一定通用性，但扩增效果及ＰＲ产量有差异。Ｃ
关键词：东鹅观草；ＳＲＰＲ；化；证山Ｓ —Ｃ优验中图分类号：９５７Ｑ４．９文献标识码：Ｂ文章编号：０５—１３（０２００９０２９７６２１）２— ０１— ４
ＯｐｉｉａｉｎａｅｔｎｇｆｒＳＲ－ｔｍｚｔｏｎｄｔｓｉｏＳＰＣＲｙｔｍｆＲｏｇｅｉｈｎｏｇｎｉｓｓｅｏｅｎｒａｓａｄｎｅｓｓＰＮｈｎＩｕｎｌＷＡＧＨｎ —ｕｎＹＮＸｅｂｎＴＡｉｈｎ，Ｉｉ—ｉＥＧＣｅｇ，ＬＵＱａ — ｎ，Ｎｏｇｇａｇ，Ａｕ —ｉｇ，ＩＮＪｃｕ。ＬＵＢｎｂｎａ —
Ａｂｔａｔｓｒｃ：Ｔｈｒｅｔｔｅｅｒｐｅｅｔｏｅｔｌｅｅｐｏｒｉｒｖｍｅｔｏｒｐｕｈａｈａ，ｒｅａｄｂｒｅ．Ｒｅｎｒｈｎｅｔｂｒｉａｅｒｓｎｓａｐｔｎｉｎｏｌｆｍｐｏｅｎｆｏｓｓｃｓｗｅｔｙｎａｌｙｉｉｃａｇｏｃｏｇｅｉｓａ — ａｄｎｅｓｓａｔｔｐｏｄｓｅｉｓｗｄｌｉｔｂｔｇｉｈｓｅｎｐｒｏｈｎ．ＴｅｓｅｉｓｃｎａｎｅｉｔｎｅｔｈａｅｌｗｄａｏｇｎｉｉｅｒｌｉｐｃｅｉｅｙｄｓｒｕｉｎｔｅＥａｔｒａｔｆＣｉａｈｐｃｅｏｔｉｓｒｓａｃｏｗｅｔｌｗｒｓａｉｎｓｙｏｆ

南瓜SCoT—PCR反应体系的优化与引物筛选

Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｓｙｓｔｅｍｗａｓａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ａｔｏｔａｌｖｏｌｕｍｅｏｆ２０ｔｘＬｉｎｃｌｕｄｉｎｇ２．５０ｍｍｏｌ・ＬＭｇ．０．４０ｍｍｏｌ・Ｌ～ｄＮＴＰｓ。０．５０ＵＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，１．００Ｉ￣ｍｏｌ・Ｌ～ｐｉｒｍｅｒａｎｄ３０ｎｇＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅ．２０ｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅ５１ｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｔｅｓｔｗｉｔｈｃｌｅａｒｂａｎｄｐａｔｔｅｒｎｓａｎｄａｂｕｎｄａｎｔｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ．Ｔｈｅｍｏｓｔｓｕｉｔａｂｌｅａｎｎｅａｌｉｎｇ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ．ＴｈｅＳＣｏＴ— ＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｆｏｒＳＣｏＴｍａｒｋｅｒｓｏｆｐｕｍｐｋｉｎｃｏｕｌｄｂｅａｐｐｌｉｅｄｉｎ
中国瓜菜
｛验研究 § ｎｎｎ＿
南瓜ＳＣｏＴ — ＰＣＲ反应体系的优化与引物筛选

SSR引物的筛选步骤

SSR引物的筛选步骤（1）利用琼脂糖凝胶电泳对引物可扩增性进行筛选摸索PCR反应体系和扩增条件，确定以下程序进行扩增。

25µl反应体系：30 ng DNA样品，2.0 mM MgCl2，0.2 mM dNTP，0.1 µM引物，1.0U Taq DNA聚合酶，1 × PCR缓冲溶液。

扩增条件：94℃预变性2.5min，随后94℃30s，45℃～60℃（依引物的退火温度而定）30s，72℃30s，循环30～40次，最后在72℃延伸20 min。

（可根据自己的实验改变反应条件）利用以上扩增产条件，选取三个居群的三个体，对引物的可扩增性进行筛选，并经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

（2）利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对引物的多态性进行筛选试剂配制：8%非变性聚丙烯酰胺凝胶配制（25ml）：15ml的去离子水H2O，5ml 的5×TBE，5ml 的40%（W/V）聚丙烯酰胺溶液，180ul的10%（W/V）过硫酸铵（APS），16 ul的TEMED。

5×TBE的配制：54g的Tris base，27.5g的硼酸，20ml0.5 mol/L的EDTA，最后定容至1L。

40%（W/V）聚丙烯酰胺的配制（100ml）：38.5g丙烯酰胺（Acrylamide），1.5g甲叉双丙烯酰胺（Bis-acrylamide），加100ml去离子水搅拌溶解，棕色瓶4℃保存。

10%（W/V）过硫酸铵（APS）的配制（20ml）：2gAPS加20ml去离子水后搅拌溶解，于4℃保存，可保存2周，超过期限会失去催化作用。

实验步骤：顺序安装聚丙烯酰胺凝胶电泳仪各部件，灌胶并凝聚2小时。

在电压105V，电流43mA条件下电泳3.5个小时，取下凝胶并进行以下步骤。

（1）固定10分钟，后水洗1次。

（固定液：360ml水，40ml乙醇，2ml乙酸）（2）银染3-10分钟，后水洗1次。

（银染液：400ml水，4ml 20%AgNO3）（3）脱色15-60秒，后水洗2次。

苦荞SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

苦荞SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选王耀文;夏楠;韩瑞霞;李艳琴;王安虎;蔡光泽【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2011(039)004【摘要】为了保证SSR-PCR的重复性,快速找到最优的水平组合,采用交互正交设计L27(312)对苦荞SSR-PCR反应体系进行了5因素(Mg2+、dNTP、Taq酶、模板DNA和引物)3水平优化试验,并对148对SSR引物进行了筛选.结果表明:5个单因素和2个交互作用(Mg2+×dNTP、Mg2+×Taq酶)对苦荞SSR-PCR均有极显著影响;最佳反应体系为:20μL总体积,Mg2+I mmol/L,dNTP 0.3mmol/L,Taq酶1.5 U,模板DNA 30 ng,引物0.25/μmol/L,10×buffer 2μL.运用该体系对7份苦荞材料进行扩增,电泳结果显示,扩增条带清晰,重复性好.利用148对SSR引物对滇宁一号、九江苦荞、野苦荞进行扩增,选出具有多态性的引物26对,可用于苦荞遗传多样性分析及遗传图谱构建.【总页数】5页(P4-8)【作者】王耀文;夏楠;韩瑞霞;李艳琴;王安虎;蔡光泽【作者单位】山西大学,生物技术研究所,化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西,太原,030006;山西大学,生物技术研究所,化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西,太原,030006;山西大学,生物技术研究所,化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西,太原,030006;山西大学,生物技术研究所,化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西,太原,030006;西昌学院,四川,西昌,615013;西昌学院,四川,西昌,615013【正文语种】中文【中图分类】S519【相关文献】1.小豆SSR-PCR反应体系优化及引物筛选 [J], 赵雅楠;王颖;张东杰;姜多2.油料植物光皮树SSR-PCR反应体系优化及引物筛选 [J], 张路红;蒋丽娟;陈景震;易诗明;黄蓉;夏栗3.藜麦SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选 [J], 左皓南; 张书苗; 高森; 陈翠萍; 闫殿海; 刘洋4.二月兰SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选 [J], 贾新平;孙晓波;梁丽建;苏家乐;邓衍明5.油梨基因组DNA提取，SSR-PCR反应体系优化及引物筛选 [J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

虉草ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选

虉草ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选张永亮;刘鹏;骆秀梅;刘杨【摘要】22个虉草基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用单因素试验方法,对影响PCR扩增体系中dNTP、引物浓度、Taq酶和模板DNA用量4个因素及引物退火温度进行梯度试验,优化得到最佳的ISSR-PCR反应体系,即20μL反应体系中分别加入0.3μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL),2μL 10×PCRBuffer(mg2+ plus),1.5 μL dNTP (2.5 mmol/L),1.5 μL引物(10 pmol/μL),50 ng模板DNA,ddH2O补足体积.以此体系对24条引物进行筛选,最终获得了多态性高,重复性好的引物12条.引物UBC808、809、811、815、818、820、826的适宜退火温度为55℃,引物835,841和842的适宜退火温度为56℃,而引物810和834的适且退火温度分别为52℃和54℃.12条引物共扩增总条带数192条,其中,多态性条带数173条,多态位点百分率89.81％.【期刊名称】《草原与草坪》【年(卷),期】2016(036)003【总页数】7页(P1-6,11)【关键词】虉草;ISSR-PCR反应体系;引物筛选【作者】张永亮;刘鹏;骆秀梅;刘杨【作者单位】内蒙古民族大学,内蒙古通辽028042;内蒙古民族大学,内蒙古通辽028042;内蒙古民族大学,内蒙古通辽028042;内蒙古民族大学,内蒙古通辽028042【正文语种】中文【中图分类】S543;Q786虉草(Phalaris arundinacea)，属于禾本科(Gramineae)、虉草属植物，别名草芦、园草芦。

主要分布于欧洲、北美和亚洲，在我国主要分布于东北、华北、华中、华东等地区。

虉草耐盐碱、耐湿涝，又耐旱，生长快，营养繁殖能力强，产草量高、叶量丰富，蛋白质含量高，被广泛用于饲草、人工湿地植物、生物能源材料或造纸原料等[1-2]。

SSR引物筛选实验步骤

SSR引物筛选实验步骤一.CTAB法提取DNA1.取0.1g嫩叶于研钵中，加少量碳酸钙研磨成浆，加入800μL 65℃预热的CTAB，转移至离心管；2.将离心管置于65℃水浴锅中水浴1h,期间摇5次，混匀；3.取800μL氯仿∶异戊醇（24∶1）加入离心管中，上下颠倒10min,12000rpm离心15min；4.吸取上清液（600~700μL）转移至新的离心管，再加入1/10体积的NaAc（3mol/L）;5.加入等体积-20℃预冷无水乙醇（或异丙醇），轻摇，置于-20℃中10min;6.12000rpm离心10min后弃上清；7.清洗两次：加入500μL 75%乙醇，轻弹，离心5min,再倒出上清液8.清洗两次后晾干，加100μL ddH2O溶解（一般溶解一晚上）；9.溶解后测浓度。

二.8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳1.PCR：测定DNA浓度后将其稀释至100-200（ng/μL）;配10μL PCR体系：4.6μL ddH2O、2.4μL Mix、2μL DNA模板、1μL引物（引物需稀释10倍；前后引物各0.5μL）PCR温度设置：94℃ 2 m94℃ 30s }50℃ 30s } 35cycles72℃ 30s }4℃ ∞PCR结束后将结果置于-4℃2.各溶液配置：（1）8%非变性聚丙烯酰胺凝胶母液:120ML:40% Acr 24mL2% Bis 13mL10×TBE 12mLddH2O 71mL（2）10×TBE：Tris 108g硼酸55gEDTA 7.44g超纯水定容至1L（3）10% AP:称取10g过硫酸铵，ddH2O溶解，定容至100mL （4）电泳缓冲液：1×TBE：取100mL 10×TBE稀释至1L（5）银染液：1g AgNO3加蒸馏水至1L（6）显影液：20g NaOH+0.4g无水Na2CO3+4mL甲醛，加蒸馏水至1L3.清洗玻璃板、胶条与梳子，擦干表面水分；用无水乙醇按一个方向擦拭玻璃板两遍后，将胶条置于大玻璃板底部，将小玻璃板整齐置于大玻璃板上，确保平整后用夹子固定两边及底部；4.制胶：45mL母液+45μL TEMED+450μL 10% AP搅拌后沿着玻璃板一侧匀速灌胶，保证无气泡，放梳子时留2-3mm在外面，注意别产生气泡；凝40min后缓缓拔出梳子；用1×TBE冲洗胶槽，冲洗后移去夹子和胶条，将玻璃板固定于电泳仪器上，在上下槽加入电泳缓冲液。

籽用西瓜SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

籽用西瓜SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选杨静;王萍;石磊【摘要】采用L25(56)正交试验设计,对影响目标起始密码子多态性-聚合酶链式反应(SCoT-PCR)的5个因素(Taq酶用量、Mg2浓度、模板DNA用量、dNTPs浓度和引物浓度)进行优化试验,建立了籽用西瓜SCoT-PCR反应体系:Mg2+2.5 mmol·L-1、dNTPs 0.15 mmol·L-1、Taq酶1.5U、引物0.5μmol· L-1、模板DNA 20 ng,总体积20μL.比较各因素对扩增反应的结果,其中以Mg2+浓度的影响最大,Taq酶用量的影响最小.应用22个籽用西瓜品种验证该体系稳定可靠,并从41个SCoT引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的22个引物,并逐一筛选出最适退火温度.该反应体系的建立为今后利用SCoT标记技术对籽用西瓜种质遗传多样性评价、指纹图谱构建、种质鉴定、分子标记辅助选择育种等研究提供了新的技术手段.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2016(025)006【总页数】8页(P889-896)【关键词】籽用西瓜;SCoT-PCR;体系优化;正交设计【作者】杨静;王萍;石磊【作者单位】内蒙古农业大学农学院,内蒙古野生蔬菜种质资源与创新重点实验室,呼和浩特 010019;内蒙古农业大学农学院,内蒙古野生蔬菜种质资源与创新重点实验室,呼和浩特 010019;内蒙古农业大学农学院,内蒙古野生蔬菜种质资源与创新重点实验室,呼和浩特 010019【正文语种】中文【中图分类】S651籽用西瓜(Citrullus lanatus var.megulasnemus Lin et Chao)[1],属于葫芦科普通西瓜亚种中的籽瓜变种,俗称“打瓜”“瓜籽瓜”,主要以种子为食用器官。

籽用西瓜在植物学上有不同分类，依其种子颜色可以分为红籽瓜和黑籽瓜2种,依其板型则分为大板、中板、小板[2]。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

火温度降低１ ℃，７２ ℃延伸１ｍｉｎ，９４ ℃变性３０Ｓ，５０ ℃ 复性３０Ｓ，７２ ℃延伸１ｍｉｎ，共３０个循环，７２ ℃延仲７ｍｉｎ。本研究建立了适合冬瓜的ＳＳＲ反应体系和引物多态性筛选程序。关键词冬瓜，ＳＳＲ．ＰＣＲ，体系优化，引物筛选
ｅｍｐｌｏｙｅｄｏｕｆｒｌｅｖｅｌｓａｎｄｉｆｖｅｆａｃｔｏｒｓ（Ｂｕｆｅｒ（Ｍｇｚ＋），ｄＮＴＰ，ＤＮＡ，ｐｒｉｍｅｒ，ｒＴ￣ｑ），ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＢｕｆｅｒ（５４）正交试验设计研究了影响冬瓜ＳＳＲ．ＰＣＲ的五个因子（１０ｘＢｕｆｅｒ（含Ｍｇ２ｆ），ｄＮＴＰ，
ＤＮＡ，引物，ｒ），研究结果表明Ｂｕｆｅｒ（含ＭｇＥ￣）￣ＮｒＴａｑ对ＰＣＲ影响最明显，最终筛选出最佳反应体系：１０ｘＢｕｆｅｒ２．０ＸＩＬ（１ｘＢｕｆｅｒ），ｄＮＴＰ２．０Ｌ（２００ｘＩｍｏｌ／ｉｘＬ），ＤＮＡ０．６ＸＩＬ（６ｎｇ／ｘｉＬ），引物０．４Ｌ（０．２ｘＩｍｏｌ／Ｌ）。体系体
ａｎｄｒＴａｑｈａｖｅａｍｏｓｔｏｂｖｉｏｕｓｉｎｌｆｕｅｎｃｅｏｎＰＣＲ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｌＯｘＢｕｆｅｒ２．０ｕＬ（１ ×ＢＵ —
技术主题
ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＦｅａｔｕｒｅ
冬瓜ＳＳＲ．ＰＣＲ体系优化及引物筛选
潘珍珍吴才君刘文睿：，ｓ江彪ｚ，谢大森，３
１江西农业大学，南昌，３０００４５；２广东省农业科学院蔬菜研究所，广州，５１０６４０；３广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广州，５１０６４０通讯作者，ｘｉｅｄａｓｅｎ＠１２６．ｔｏｍ
积为２０Ｌ，循环数为３５。引物筛选程序为：９４￣Ｃ预变性３ｍｉｎ，９４￣Ｃ变性４５Ｓ，５８￣Ｃ～６８￣Ｃ复性３０Ｓ，５个循
环，每个循环退火温度降２￣Ｃ，７２￣Ｃ延伸１ｍｉｎ，９４￣Ｃ变性３０Ｓ，５０ ℃～５８￣Ｃ复性１ｍｉｎ，８个循环，每个循环退
ＳＳＲ— ＰＣＲＳｙｓｔｅｍＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎａｎｄＳｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆＰｒｉｍｅｒｓｉｎＷａｘＧｏｕｒｄ
ＰａｎＺｈｅｎｚｈｅｎ，ＷｕＣａｉｊｕｎＬｉｕＷｅｎｒｕｉ。ＪｉａｎｇＢｉａｏ，ＸｉｅＤａｓｅｎ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｘｉｅｄａｓｅｎ＠１２６．ｔｏｍＤＯＩ：１０．１３２７１￣．ｍｐｂ．０１３．０００８９８ＡｂｓｔｒａｃｔＡｎｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｆｏｒｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇｔｈｅＳＳＲ．ＰＣＲｓｙｓｔｅｍｉｎＷａｘｇｏｕｒｄ，ｗｈｉｃｈ
分子植物育种，２０１５年，第１３卷，第４期，第８９８～９０２页
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２０１５，Ｖｏ１．１３，Ｎｏ．４，８９８ — ９０２
１ＪｉａｎｇｘｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ，３０００４５；２ＶｅｇｅｔａｂｌｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ５１０６４０；３ＧｕａｎｇｄｏｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＮｅｗＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅｓ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，５１０６４０