生物化学实验实验二-cam电泳 凝胶层析课件
合集下载
凝胶电泳-PPT
琼脂糖凝胶电泳优点
（ 1 ）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占 98 %～ 99 %），近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸 收吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 （ 2 ）琼脂糖呈透明状，无紫外吸收，电泳后的样品可直接 用紫外检测；电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测 定。 （ 3 ）操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行 电泳
3.染色和倒胶。 染色剂用goldview，其分辨率较EB稍差，但安全 性更高。使用时避免其接触皮肤和眼睛。根据经 验30ml的胶加4.5μL、50ml加7.5μL、100ml加 10μL。待锥形瓶中凝胶溶液冷却至60℃左右时（ 不烫手），将goldview加入其中，摇匀，然后将 凝胶溶液倒入置胶板上。避免气泡。
常用的凝胶电泳有两类 ： 琼脂糖凝胶电泳：分辨率稍低，适于较大分子 。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨率高，适于较小分子。
凝胶电泳的检测灵敏度
与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的检测灵敏度在0.2～50Kb之间; 聚丙烯酰胺的检测灵敏度在1～1000bp之间
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷 ，是一种很好的电泳支持物。DNA在 碱性条件下（pH8.0 的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动 ，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳 动速率液不同。溴化乙 锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对 间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带 ，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。
问题 可能原因 核酸酶污染
DNA Marker降解 保存不当 琼脂糖质量差 DNA Marker无法 电泳缓冲液多次使用后失 正确分离 效 核酸浓度过低 核酸降解 条带黯淡 DNA条带被示踪染料掩盖
《凝胶层析法》课件
改进方向
提高分离速度
通过改进凝胶介质或优化操作条件，提高凝 胶层析法的分离速度。
减少小分子物质的损失
研究新型的凝胶介质和操作条件，减少小分 子物质的损失。
增强对大分子的分离效果
开发新型凝胶介质，提高对大分子物质的分 辨率。
提高温度稳定性
通过改进凝胶介质或优化操作条件，提高凝 胶层析法对温度变化的稳定性。
装柱
将凝胶颗粒装入层析柱中，确 保填充均匀。
上样
将待分离样品加入层析柱的顶 部，确保样品与凝胶颗粒充分 接触。
检测
对洗脱液进行检测，观察分离 效果。
结果分析
对收集到的洗脱液进行定性和定量分 析，确定各组分的含量和纯度。
比较实验结果与预期结果，分析实验 误差和影响因素，总结实验结论。
03
CATALOGUE
告撰写非常重要。
采用适当的统计方法处理数据
对于实验数据，应采用适当的统计方法进行处理和分析， 以得出可靠的结论。
备份实验数据
为了防止数据丢失，应将实验数据备份并保存在安全的地 方。
04
CATALOGUE
凝胶层析法实验案例
实验一：分离蛋白质
总结词
通过凝胶层析法分离蛋白质，可以获得高纯度的蛋白质样品，为后续的生化分析提供高 质量的原料。
原理
基于分子大小和形状差异，利用凝胶孔径对不同大小分子进行选择性分离，大 分子不能进入凝胶孔洞，而小分子可以进入凝胶孔洞，从而实现大小分子的分 离。
发展历程
起源
现状
凝胶层析法起源于20世纪40年代，最 初用于蛋白质的分离。
目前，凝胶层析法已成为一种广泛应 用于分离纯化技术领域的进和分离技术 的提高，凝胶层析法逐渐应用于更多 领域，如生物技术、制药、环境科学 等。
凝胶电泳及其应用ppt课件
，进行电泳。 8.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝 胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染 色液，染色1小时左右。 9.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色 液脱色，直到蛋白质区带清晰。 10.实验结果分析
按下式计算相对迁移率：
影响电泳速度的因素：
样品本身：带电量，分子大小，形状 电场强度：电压 缓冲液：成分， pH ，离子强度 支持介质：电渗作用，吸附作用 温度
SUCCESS
THANK YOU
2019/5/6
ddH2O 30%Acr Buffer
10%SDS 10%Ap TEMED
配胶
分离胶(10% 10ml) 浓缩胶(5% 10ml)
4.05ml
6.8ml
3.3ml
1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5ml
100µl
1.7ml
0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25ml
凝胶电泳及其应用
主要内容
1
凝胶电泳相关概念
2
凝胶电泳的原理
3
凝胶电泳的应用
4
聚丙烯酰胺凝胶电泳
2
凝胶电泳相关概念
凝胶：凝胶是胶体体系的一种存在形式，它是由胶体体系中分散相颗 粒相互联结，搭成具有三维结构的骨架后形成的，具有空间网状结构 体系，胶体体系中原有的分散介质（液体）充填在网状结构的空隙之 中。
凝胶电泳原理图
电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。
凝胶电泳装置图
垂直式电泳装置
水平式电泳装置
影响凝胶电泳的因素
影响电泳速度的因素：
样品本身：带电量，分子大小，形状 电场强度：电压 缓冲液：成分， pH ，离子强度 支持介质：电渗作用，吸附作用 温度
按下式计算相对迁移率：
影响电泳速度的因素：
样品本身：带电量，分子大小，形状 电场强度：电压 缓冲液：成分， pH ，离子强度 支持介质：电渗作用，吸附作用 温度
SUCCESS
THANK YOU
2019/5/6
ddH2O 30%Acr Buffer
10%SDS 10%Ap TEMED
配胶
分离胶(10% 10ml) 浓缩胶(5% 10ml)
4.05ml
6.8ml
3.3ml
1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5ml
100µl
1.7ml
0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25ml
凝胶电泳及其应用
主要内容
1
凝胶电泳相关概念
2
凝胶电泳的原理
3
凝胶电泳的应用
4
聚丙烯酰胺凝胶电泳
2
凝胶电泳相关概念
凝胶：凝胶是胶体体系的一种存在形式，它是由胶体体系中分散相颗 粒相互联结，搭成具有三维结构的骨架后形成的，具有空间网状结构 体系，胶体体系中原有的分散介质（液体）充填在网状结构的空隙之 中。
凝胶电泳原理图
电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。
凝胶电泳装置图
垂直式电泳装置
水平式电泳装置
影响凝胶电泳的因素
影响电泳速度的因素：
样品本身：带电量，分子大小，形状 电场强度：电压 缓冲液：成分， pH ，离子强度 支持介质：电渗作用，吸附作用 温度
《生化实验电泳》课件
用于施加电场和控制电泳 运行过程。
电泳胶
选择不同类型的电泳胶， 用于分离不同大小和性质 的生物大分子。
探针和引物
用于检测目标分子，如DNA 探针和引物。
实验电泳的安全操作和注意事项
1
安全操作
佩戴实验室服装和个人防护装备，正确操作电泳设备。
2
注意事项
遵守实验室规章制度，定期检查和维护设备，妥善处理和处理废弃物。
《生化实验电泳》PPT课 件
生化实验电泳是一种常用的分离和分析生物大分子的技术。它利用电场作用 力，将带电的生物大分子分离成不同迁移率的带。
实验电泳的原理和步骤
1
原理
实验电泳基于生物大分子在电场下迁移速率不同的特性，来实现分离和分析。
2
步骤
样品制备、准备电泳胶、装载样品、施加电场、电泳运行和能 和相互作用。
PCR检测
用于快速检测和鉴定特定基 因序列。
实验电泳的优点和局限性
1 优点
2 局限性
高分辨率、高灵敏度、简单易行、成本 低。可用于多种样品类型的分离和分析。
对于较大分子的分离效果较差，无法直 接获得分离物的结构和功能信息。
实验电泳的相关设备和材料
电泳仪
3
急救措施
处理漏电和电击事故，及时洗眼和冲洗皮肤，寻求医疗救助。
3
注意事项
保持实验环境清洁，避免污染样品和胶液，正确选择电场条件和电泳胶的浓度。
常见的实验电泳技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳
用于分离和分析蛋白质和核酸等生物大分子。
琼脂糖凝胶电泳
用于分离和分析DNA等较大分子。
薄层凝胶电泳
用于快速分离和检测小分子化合物。
实验电泳的应用领域
基因分型
应用于DNA分析和基因分型， 如法医学、亲子鉴定等。
电泳胶
选择不同类型的电泳胶， 用于分离不同大小和性质 的生物大分子。
探针和引物
用于检测目标分子，如DNA 探针和引物。
实验电泳的安全操作和注意事项
1
安全操作
佩戴实验室服装和个人防护装备，正确操作电泳设备。
2
注意事项
遵守实验室规章制度，定期检查和维护设备，妥善处理和处理废弃物。
《生化实验电泳》PPT课 件
生化实验电泳是一种常用的分离和分析生物大分子的技术。它利用电场作用 力，将带电的生物大分子分离成不同迁移率的带。
实验电泳的原理和步骤
1
原理
实验电泳基于生物大分子在电场下迁移速率不同的特性，来实现分离和分析。
2
步骤
样品制备、准备电泳胶、装载样品、施加电场、电泳运行和能 和相互作用。
PCR检测
用于快速检测和鉴定特定基 因序列。
实验电泳的优点和局限性
1 优点
2 局限性
高分辨率、高灵敏度、简单易行、成本 低。可用于多种样品类型的分离和分析。
对于较大分子的分离效果较差，无法直 接获得分离物的结构和功能信息。
实验电泳的相关设备和材料
电泳仪
3
急救措施
处理漏电和电击事故，及时洗眼和冲洗皮肤，寻求医疗救助。
3
注意事项
保持实验环境清洁，避免污染样品和胶液，正确选择电场条件和电泳胶的浓度。
常见的实验电泳技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳
用于分离和分析蛋白质和核酸等生物大分子。
琼脂糖凝胶电泳
用于分离和分析DNA等较大分子。
薄层凝胶电泳
用于快速分离和检测小分子化合物。
实验电泳的应用领域
基因分型
应用于DNA分析和基因分型， 如法医学、亲子鉴定等。
凝胶电泳技术课件
提高灵敏度：通过改进检测 方法、优化实验条件等方法 提高灵敏度，以便更好地检 测低丰度的DNA片段。
降低成本：通过优化实验 方案、改进实验设备等方 法降低成本，以便更好地 推广凝胶电泳技术。
应用领域拓展
生物制药：蛋白质、核酸等 生物大分子的分离和纯化
基因工程：DNA片段的克 隆和测序
食品安全：食品添加剂、微 生物检测
凝胶电泳技术课件
目录
01. 凝胶电泳技术概述 02. 凝胶电泳实验步骤 03. 凝胶电泳结果分析 04. 凝胶电泳技术发展
凝胶电泳原理
凝胶电泳技术是一种利用凝胶介质对不同分子量 的DNA、RNA或蛋白质进行分离和检测的技术。
凝胶电泳的原理是利用电场对不同分子量的DNA、 RNA或蛋白质进行分离和检测。
04
06
确定分子量：根 据迁移率和分子 量之间的关系确 定分子量
确定电泳条件： 根据结果分析 确定合适的电 泳条件
技术改进方向
提高分辨率：通过优化凝胶 配方、改进电泳技术等方法 提高分辨率，以便更好地区 分不同大小的DNA片段。
提高速度：通过优化电泳 技术、改进实验流程等方 法提高速度，以便更快地 完成实验。
凝胶电泳技术主要包括凝胶制备、样品处理、电 泳、染色和检测等步骤。
凝胶电泳技术在分子生物学、生物化学、遗传学、 医学等领域具有广泛的应用。
凝胶电泳类型
聚丙烯酰胺凝胶电 泳（PAGE）：根 据分子量进行分离
毛细管凝胶电泳 （CGE）：根据分 子大小和电荷进行
分离
琼脂糖凝胶电泳 （AGE）：根据分
子大小进行分离
03
电泳方向：观 察电泳方向的 正负，判断样 品的电荷和分 子量
04
电泳时间：观 察电泳时间的 长短，判断样 品的电荷和分 子量
《凝胶电泳》课件
《凝胶电泳》PPT课件
目录
• 凝胶电泳简介 • 凝胶电泳实验操作 • 凝胶电泳的优缺点 • 凝胶电泳的发展趋势与展望 • 凝胶电泳与其他分离方法的比较
01
凝胶电泳简介
定义与原理
定义
凝胶电泳是一种利用凝胶作为支持介质的电泳技术，用于分离和检测生物分子 。
原理
利用电场的作用，使带电分子在凝胶介质中迁移，从而实现分离和检测。
减少污染
通过改进实验操作和加强实验室管理，减少 凝胶电泳过程中的污染。
缩短实验时间
研究更有效的染色和检测方法，缩短凝胶电 泳的实验时间。
拓展应用范围
进一步探索凝胶电泳在其他领域的应用，如 医学、生物工程等。
04
凝胶电泳的发展趋势与展望
研究方向
新型凝胶材料的研发
探索具有优异分离性能和稳定性的新型凝胶材料，以提高凝胶电 泳的分离效果和检测灵敏度。
应用广泛
高灵敏度
凝胶电泳不仅可以用于DNA和RNA的分析 ，还可以用于蛋白质分离和纯化等，应用 范围广泛。
通过现代化的染色和检测技术，凝胶电泳 可以检测到低浓度的DNA或RNA，灵敏度 高。
缺点
01
时间长
凝胶电泳通常需要几小时甚至更 长时间才能完成分离，对于需要 快速得到结果的实验不太适用。
03
易受污染
。
标准化与规范化
随着凝胶电泳技术的普及和应用 ，标准化和规范化的需求将逐渐 凸显，需要制定相关标准和规范
，促进技术的健康发展。
05
凝胶电泳与其他分离方法的 比较
离心分离
离心分离是通过离心力将不同 密度的物质进行分离的方法。
离心分离的优点是操作简便、 分离速度快，适用于大量样品 的分离。
目录
• 凝胶电泳简介 • 凝胶电泳实验操作 • 凝胶电泳的优缺点 • 凝胶电泳的发展趋势与展望 • 凝胶电泳与其他分离方法的比较
01
凝胶电泳简介
定义与原理
定义
凝胶电泳是一种利用凝胶作为支持介质的电泳技术，用于分离和检测生物分子 。
原理
利用电场的作用，使带电分子在凝胶介质中迁移，从而实现分离和检测。
减少污染
通过改进实验操作和加强实验室管理，减少 凝胶电泳过程中的污染。
缩短实验时间
研究更有效的染色和检测方法，缩短凝胶电 泳的实验时间。
拓展应用范围
进一步探索凝胶电泳在其他领域的应用，如 医学、生物工程等。
04
凝胶电泳的发展趋势与展望
研究方向
新型凝胶材料的研发
探索具有优异分离性能和稳定性的新型凝胶材料，以提高凝胶电 泳的分离效果和检测灵敏度。
应用广泛
高灵敏度
凝胶电泳不仅可以用于DNA和RNA的分析 ，还可以用于蛋白质分离和纯化等，应用 范围广泛。
通过现代化的染色和检测技术，凝胶电泳 可以检测到低浓度的DNA或RNA，灵敏度 高。
缺点
01
时间长
凝胶电泳通常需要几小时甚至更 长时间才能完成分离，对于需要 快速得到结果的实验不太适用。
03
易受污染
。
标准化与规范化
随着凝胶电泳技术的普及和应用 ，标准化和规范化的需求将逐渐 凸显，需要制定相关标准和规范
，促进技术的健康发展。
05
凝胶电泳与其他分离方法的 比较
离心分离
离心分离是通过离心力将不同 密度的物质进行分离的方法。
离心分离的优点是操作简便、 分离速度快，适用于大量样品 的分离。
《凝胶层析技术》课件
样品上样
将过滤后的样品加入层析柱中，确保样品均匀分布在凝胶颗 粒表面。
洗脱与分离
01
02
03
洗脱液的选择
根据待分离组分的性质选 择合适的洗脱液，如缓冲 液、有机溶剂等。
洗脱速度的控制
根据分离效果和分离时间 的要求，调整洗脱液的流 速。
洗脱分馏
通过控制洗脱液的流速和 组分的吸附特性，使不同 组分依次从凝胶层析柱中 洗脱出来。
蛋白质分离
凝胶层析技术可用于分离和纯化 蛋白质，通过凝胶颗粒的孔径大 小和电荷性质，将不同大小的蛋
白质分子进行分离。
去除杂质
凝胶层析技术可以用于去除蛋白质 样品中的杂质，如盐、DNA、 RNA等，提高蛋白质的纯度。
蛋白质定量
凝胶层析技术还可以用于蛋白质的 定量分析，通过测量洗脱液中蛋白 质的浓度，计算蛋白质的含量。
高分辨率与高灵敏度
为了满足更精细的分离需求，凝胶层析技术将向 高分辨率和高灵敏度方向发展。这需要研发新型 凝胶介质和优化分离条件，以提高分离效果。
多功能化与集成化
随着应用领域的拓展，凝胶层析技术将向多功能 化和集成化方向发展。这包括与其他分离技术的 结合，以及在微流控芯片上的集成应用，以满足 复杂样品处理的需求。
自动化与智能化
随着机器人技术和人工智能的进步，凝胶层析技 术的自动化和智能化将成为未来的重要发展趋势 。这不仅可以提高分离效率，减少人为误差，还 能大幅减少人力成本。
高通量与快速分离
高通量和快速分离是凝胶层析技术的另一重要发 展趋势。通过改进凝胶介质和优化分离流程，可 以实现更高流速下的高效分离，缩短分离时间。
凝胶的清洗与再生
清洗
在每次使用后，用适量的 溶剂清洗凝胶层析柱，去 除残留的杂质和洗脱液。
将过滤后的样品加入层析柱中，确保样品均匀分布在凝胶颗 粒表面。
洗脱与分离
01
02
03
洗脱液的选择
根据待分离组分的性质选 择合适的洗脱液，如缓冲 液、有机溶剂等。
洗脱速度的控制
根据分离效果和分离时间 的要求，调整洗脱液的流 速。
洗脱分馏
通过控制洗脱液的流速和 组分的吸附特性，使不同 组分依次从凝胶层析柱中 洗脱出来。
蛋白质分离
凝胶层析技术可用于分离和纯化 蛋白质，通过凝胶颗粒的孔径大 小和电荷性质，将不同大小的蛋
白质分子进行分离。
去除杂质
凝胶层析技术可以用于去除蛋白质 样品中的杂质，如盐、DNA、 RNA等，提高蛋白质的纯度。
蛋白质定量
凝胶层析技术还可以用于蛋白质的 定量分析，通过测量洗脱液中蛋白 质的浓度，计算蛋白质的含量。
高分辨率与高灵敏度
为了满足更精细的分离需求，凝胶层析技术将向 高分辨率和高灵敏度方向发展。这需要研发新型 凝胶介质和优化分离条件，以提高分离效果。
多功能化与集成化
随着应用领域的拓展，凝胶层析技术将向多功能 化和集成化方向发展。这包括与其他分离技术的 结合，以及在微流控芯片上的集成应用，以满足 复杂样品处理的需求。
自动化与智能化
随着机器人技术和人工智能的进步，凝胶层析技 术的自动化和智能化将成为未来的重要发展趋势 。这不仅可以提高分离效率，减少人为误差，还 能大幅减少人力成本。
高通量与快速分离
高通量和快速分离是凝胶层析技术的另一重要发 展趋势。通过改进凝胶介质和优化分离流程，可 以实现更高流速下的高效分离，缩短分离时间。
凝胶的清洗与再生
清洗
在每次使用后，用适量的 溶剂清洗凝胶层析柱，去 除残留的杂质和洗脱液。
凝胶层析(生化实验)PPT课件
Proteins that are applied will migrate until the pH = pI, then they will cease to migrate
-
13
-
14
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
Electrophoresis
Electrophoresis is an analytic method to analyze the purity of proteins. It is can also be used to estimate molecular weight of proteins.
生物大分子的分离生物大分子的分离凝胶层析分离蛋白质凝胶层析分离蛋白质生物化学实验生物化学实验上海交通大学生命科学技术学院上海交通大学生命科学技术学院实验目的实验目的了解凝胶柱层析的原理及应用掌握凝胶柱层析的基本操作技术进一步了解和掌握其他层析技术purificationmultistepprocedure
上海交通大学生命科学技术学院
生物化学实验
生物大分子的分离 —— 凝胶层析分离蛋白质
实验目的
1. 了解生物大分子分离、纯化的方法 2. 了解凝胶柱层析的原理及应用，掌握凝
胶柱层析的基本操作技术 3. 进一步了解和掌握其他层析技术
-
2
Purification is a multi-step procedure.
1. Dialysis and ultrafiltration 2. Gel electrophoresis 3. Gel filtration chromatography 4. Ultracentrifugation
-
13
-
14
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
Electrophoresis
Electrophoresis is an analytic method to analyze the purity of proteins. It is can also be used to estimate molecular weight of proteins.
生物大分子的分离生物大分子的分离凝胶层析分离蛋白质凝胶层析分离蛋白质生物化学实验生物化学实验上海交通大学生命科学技术学院上海交通大学生命科学技术学院实验目的实验目的了解凝胶柱层析的原理及应用掌握凝胶柱层析的基本操作技术进一步了解和掌握其他层析技术purificationmultistepprocedure
上海交通大学生命科学技术学院
生物化学实验
生物大分子的分离 —— 凝胶层析分离蛋白质
实验目的
1. 了解生物大分子分离、纯化的方法 2. 了解凝胶柱层析的原理及应用，掌握凝
胶柱层析的基本操作技术 3. 进一步了解和掌握其他层析技术
-
2
Purification is a multi-step procedure.
1. Dialysis and ultrafiltration 2. Gel electrophoresis 3. Gel filtration chromatography 4. Ultracentrifugation
实验二 琼脂糖凝胶电泳PPT课件
实验二
琼脂糖凝胶电泳的制备 及核酸检测
精选ppt
2010
分 子实 生验
物 1学
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳一 般分为自由界面电泳和区带电泳两大类:自由界面电泳 不需支持物，这类电泳目前已很少使用;而区带电泳则 需用各种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、 醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶 -G薄层等，分子生物学领域中最常用的是琼脂糖凝胶 电泳其优点主要在于操作简单、快速、灵敏。
Tris 108g ，硼酸 55g ， EDTA.2H2O 7.44g,
加蒸馏水定容至1000ml ）
EB：5 µl / 100 ml TBE
电泳样品：标准分子量核酸（DL2000）
精选ppt
2010
分 子实 生验
物 9学
四. 操作步骤
（1）制胶（以20 mL为例）
准备： 将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，
精选ppt
2010
分 子实 生验
物 7学
2．溴化乙锭（EB）：致癌剂，操作时应戴手套，尽
量减少台面污染。
3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚
蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯青（
xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝
少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。
泳槽中。
精选ppt
2010
分 子实 生验
物 10 学
（2）点样：用微量移液器取1－2µl载样液，和5 µl质粒混匀 ， 加入点样孔。
（3）电泳：打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm(约100－ 120 V), 可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约25分钟 即可观察结果。
琼脂糖凝胶电泳的制备 及核酸检测
精选ppt
2010
分 子实 生验
物 1学
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳一 般分为自由界面电泳和区带电泳两大类:自由界面电泳 不需支持物，这类电泳目前已很少使用;而区带电泳则 需用各种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、 醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶 -G薄层等，分子生物学领域中最常用的是琼脂糖凝胶 电泳其优点主要在于操作简单、快速、灵敏。
Tris 108g ，硼酸 55g ， EDTA.2H2O 7.44g,
加蒸馏水定容至1000ml ）
EB：5 µl / 100 ml TBE
电泳样品：标准分子量核酸（DL2000）
精选ppt
2010
分 子实 生验
物 9学
四. 操作步骤
（1）制胶（以20 mL为例）
准备： 将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，
精选ppt
2010
分 子实 生验
物 7学
2．溴化乙锭（EB）：致癌剂，操作时应戴手套，尽
量减少台面污染。
3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚
蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯青（
xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝
少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。
泳槽中。
精选ppt
2010
分 子实 生验
物 10 学
（2）点样：用微量移液器取1－2µl载样液，和5 µl质粒混匀 ， 加入点样孔。
（3）电泳：打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm(约100－ 120 V), 可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约25分钟 即可观察结果。
cam电泳 凝胶层析
三、操作步骤：
Sephadex G-50的准备
装柱15-20cm
1、洗净的层析柱保持垂直。 2、向柱中加入上样缓冲液（本实验为蒸馏水），排砂芯
下空气，在柱内仍留有5-10mL液体时，加入搅拌均匀
的Sephadex G50悬液，调节流速10滴/min，使凝胶均 匀沉降；不断补充凝胶，直至凝胶积层达到15-20cm洗脱液洗涤1-2个柱体积，为下次
实验做准备。
凝胶必须回收到烧杯中！！！
六、注意事项：
凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏 。 加样分离时，滴速越慢，分离效果越好。
★将看到的现象以图示
的方法画到你的实验报 告上。并分析实验结果。
层析实验讨论
1.
2.
3. 4.
5.
试述G值与交联度的关系，如何根据柱床体积估算SP凝 胶干粉用量？ 如果凝胶表面不平整，采用什么方法使其平整？ 为什么加样的时候，胶柱表面的水层只保持1~2mm? 加样后可以立刻加水吗？为什么？ 柱子不垂直会有什么后果？怎样算垂直？
注意：床面上要保持少许上样缓冲液，防止胶床露出
液面。如胶面不平，可用玻棒轻轻的搅动，让凝胶自 然沉降，使表面平整。
加样与洗脱
1、加样：在胶床即将露出液面之时，用滴管将样品小心迅 速地加在床面上，在柱内形成一薄层 2、洗脱：样品溶液渗入凝胶之后，用一个样品体积的洗脱 液（本实验也为蒸馏水）洗凝胶表面1次 。注意不断轻 轻地加入洗脱液，严防凝胶床面露出水面！！ 3、观察：红色的血红蛋白和黄色的DNP-胰糜蛋白酶的分离， 一直观察到有色溶液全部流出。两者相对分子质量为： 67kD和13.5kD。
电泳实验讨论
1.
讨论影响电泳结果分辨率的主要操作？
凝胶层析法课件
聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线 的流速依赖性
1．流速为0.65ml/min； 2．流速为2.0ml/min溶剂为甲
苯
14
（三）流动分离理论
红细胞在毛血细管中流动时比血浆 流得快。
较大的分子较先通过或绕过这个填 料颗粒，使溶质能按其大小进行分 离。
15
第十五页，本课件共有133页
分离过程
三种不同分子量物质的 混合样品用某种规格的 凝胶柱进行分离。
32
第三十二页，本课件共有133页
国产Sephadex LH－20可用于分子筛层析、吸附层析 和分配层析。很适用于脂肪酸、甘油脂、类固醇、维生素、 激素类生化产品的分离。洗脱剂可用单一有机溶剂如甲醇、 氯仿等，也可用混合溶剂如氯仿与甲醇的混合液。
第三十三页，本课件共有133页
（二）葡聚糖凝胶离子交换剂
骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟丙基，使 呈亲脂性，同时保留亲水性。
这种凝胶既亲脂又亲水，可在多种有机溶剂中膨胀。 这种凝胶在pH＞2的不含氧化剂的溶液中稳定。用低级醇 为溶剂时，对芳香族、杂环族化合物仍有吸附作用。但用 氯仿时则可去除对上述化合物的吸附作用，而对含羟基与 羧基的化合物却有吸附作用 。
样品加入，以水或其他 溶液进行洗脱，即得洗 脱曲线 。
16
第十六页，本课件共有133页
分离过程
最先流出物质A，A分子量最大，完全不能进入颗粒
内部，只能从颗粒间隙流过， “全排阻”。其 流经体积最小，等于外水体积V0。
最后流出物质C，它分子量最小，其分子可以自
由进出凝胶颗粒， “全渗入”。流经体积是外水
（一）平衡排除理论
当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶质 分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Sephadex G25、 G50 、G75、G100、G200。 G值代表每10克干胶的吸水量
实验步骤及注意事项
装柱 垂直固定凝胶柱，加入蒸馏水，打开出口，排净气泡，
关闭出口。 将凝胶轻轻搅动均匀，连续地倒入柱中，待凝胶沉降 约2-3cm后，打开出口，调节流速约10滴/min，继续装柱至15-20cm高， 关闭出口。 装柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。
血清蛋白的性质
蛋白名称 清蛋白
等电点(pI) 4.88
分子量 69 000
1
5.06
20 000
2
5.06
30 000
5.12
90 000-150 000
6.85-7.50
156 000-300 000
按泳动快慢顺序，由正极到负极依次为
清蛋白 1- 2- - -球蛋白
点样
+
–
三、操作步骤：
四、实验结果：
**将看到的现象以图示的方法画到你的实验报告上。 并分析实验结果。
凝胶是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收一 定量溶液后溶胀成一种柔软、富有弹性、不带电荷、不与 溶质相互作用的惰性颗粒，而且每个颗粒的微结构及筛孔 直径均匀一致。
＊大分子物质直径大于凝胶网孔，不能进入凝胶内部，沿凝胶
颗粒间的间隙随流动相向下移动，流程短、流速快，首先流 出层析柱。 ＊小分子物质直径小于凝胶网孔，能自由出入凝胶网孔，因而 流程长、洗脱时间长，最后流出层析柱。
电泳分离蛋白质的原理?
蛋白质分子表面带有的电荷
蛋白质分子量的大小
pH及蛋白质分子量大小对电泳的影响
-
pI
Mr.(kD)
-
pI=4.2
80
-
- pI=4.7 40
-பைடு நூலகம்
-
pI=4.7
15
-
pI=4.7
40
-
- pI=6.9 70
-
+ + + + + + + + + pH=8.6 +
二、实验原理：
以乙酸纤维素薄膜作为支持体的一种电泳方法。 缓冲液pH值为8.6，血清蛋白质在缓冲液中 均带负电荷（血清蛋白的pI大多在7.5以下）。 带电荷多、分子量相对小的泳动速度快； 带电荷少、分子量相对大的泳动速度慢。
回收 凝胶用过后，用5个柱长的蒸馏水洗后回收。
凝胶面上必须始终保持有一定的洗脱液
注意事项：
1、装柱时，将小烧杯内的凝胶轻轻搅动均匀，连续地倒入柱中。 2、加样分离时的滴速要控制好，凝胶面上必须始终保持有一定 的洗脱液，以免凝胶柱裂开。 3、加样完用缓冲液（蒸馏水）洗脱时，沿管壁缓慢滴入蒸馏水。 4、凝胶用过后，用5个柱长的蒸馏水洗后回收。
加样 慢慢打开出口，使洗脱液缓缓流出，至液面与床面几乎平齐
（不可使床面干掉），关闭出口。 用长滴管将样品小心加至柱床表面， 避免将凝胶冲起。 打开出口，使样品溶液进入凝胶内，当样品溶液 恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭出口。
洗脱
沿管壁缓慢滴入蒸馏水，使高出床表面3～5cm，打开出口， 开始洗脱，直至两条色带分开。仔细观察样品在层析柱内的分离现象。
实验13 ：凝胶柱层析分离血红 蛋白和DNP-胰糜蛋白酶
实验14：血清蛋白质乙酸纤维素 薄膜电泳
生物化学与分子生物学系
实验14 血清蛋白质乙酸纤
维素薄膜电泳
P58
一、目的与要求：
1、掌握CAM电泳的基本原理 2、学习CAM电泳的操作技术
电泳
带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电 极移动，利用带电粒子在电场中移动速度不同而 达到分离的技术称为电泳技术。
6. 浸洗：依次浸洗液浸洗3次，每次5-10min。 依次
四、注意事项：
1. 区分电泳箱正负极，玻璃片密封，集体电泳。 2. 沾适量样本垂直点样，点在距膜端 1.5-2cm处，一 定要标记好，注意保持膜半干燥。 3. 点样处放在电泳箱的负极端，并保持膜水平。 4. 浸洗液依次漂洗染色膜。 5. 先切断电源再取膜。
1. 装置电泳箱。
快
2. 点样：浸于巴比妥溶液中的乙酸纤维素薄膜，滤纸轻轻吸
干----半干燥态。铅笔标记；点样器沾适量新鲜血清，在
距膜端 1.5~2cm处垂直点样。
区分正负极
3. 放入电泳槽。点样端位于负极，保持膜直；不下垂。
4. 通电：180伏，50-60min。断电后，取膜。
安全
5. 染色：氨基黑染色10min（轻轻振晃）。
五、实验结果
醋酸纤维素薄膜
albumin 1 2 标记出每条条带的名称
实验13 凝胶柱层析分离血红 蛋白和DNP-胰糜蛋白酶
P57
一、目的与要求
掌握凝胶层析的原理、熟练掌握实验操作。
二、实验原理
凝胶层析法是指混合物随流动相，经过凝胶层析柱 时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
分 子 筛 效 应
样品性质
血红蛋白
红色，分子量 67 kD， 分子直径大于颗粒网孔，只能在胶粒外部空隙间流动， 所受胶粒的阻力小，流速快，首先被洗脱下来
DNP-胰糜蛋白酶
黄色，分子量 13.5 kD， 分子直径小于胶粒网孔，完全进入胶粒内部，在内部流动， 受到阻力大，后被洗脱下来
葡聚糖凝胶（Sephadex)
实验步骤及注意事项
装柱 垂直固定凝胶柱，加入蒸馏水，打开出口，排净气泡，
关闭出口。 将凝胶轻轻搅动均匀，连续地倒入柱中，待凝胶沉降 约2-3cm后，打开出口，调节流速约10滴/min，继续装柱至15-20cm高， 关闭出口。 装柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。
血清蛋白的性质
蛋白名称 清蛋白
等电点(pI) 4.88
分子量 69 000
1
5.06
20 000
2
5.06
30 000
5.12
90 000-150 000
6.85-7.50
156 000-300 000
按泳动快慢顺序，由正极到负极依次为
清蛋白 1- 2- - -球蛋白
点样
+
–
三、操作步骤：
四、实验结果：
**将看到的现象以图示的方法画到你的实验报告上。 并分析实验结果。
凝胶是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收一 定量溶液后溶胀成一种柔软、富有弹性、不带电荷、不与 溶质相互作用的惰性颗粒，而且每个颗粒的微结构及筛孔 直径均匀一致。
＊大分子物质直径大于凝胶网孔，不能进入凝胶内部，沿凝胶
颗粒间的间隙随流动相向下移动，流程短、流速快，首先流 出层析柱。 ＊小分子物质直径小于凝胶网孔，能自由出入凝胶网孔，因而 流程长、洗脱时间长，最后流出层析柱。
电泳分离蛋白质的原理?
蛋白质分子表面带有的电荷
蛋白质分子量的大小
pH及蛋白质分子量大小对电泳的影响
-
pI
Mr.(kD)
-
pI=4.2
80
-
- pI=4.7 40
-பைடு நூலகம்
-
pI=4.7
15
-
pI=4.7
40
-
- pI=6.9 70
-
+ + + + + + + + + pH=8.6 +
二、实验原理：
以乙酸纤维素薄膜作为支持体的一种电泳方法。 缓冲液pH值为8.6，血清蛋白质在缓冲液中 均带负电荷（血清蛋白的pI大多在7.5以下）。 带电荷多、分子量相对小的泳动速度快； 带电荷少、分子量相对大的泳动速度慢。
回收 凝胶用过后，用5个柱长的蒸馏水洗后回收。
凝胶面上必须始终保持有一定的洗脱液
注意事项：
1、装柱时，将小烧杯内的凝胶轻轻搅动均匀，连续地倒入柱中。 2、加样分离时的滴速要控制好，凝胶面上必须始终保持有一定 的洗脱液，以免凝胶柱裂开。 3、加样完用缓冲液（蒸馏水）洗脱时，沿管壁缓慢滴入蒸馏水。 4、凝胶用过后，用5个柱长的蒸馏水洗后回收。
加样 慢慢打开出口，使洗脱液缓缓流出，至液面与床面几乎平齐
（不可使床面干掉），关闭出口。 用长滴管将样品小心加至柱床表面， 避免将凝胶冲起。 打开出口，使样品溶液进入凝胶内，当样品溶液 恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭出口。
洗脱
沿管壁缓慢滴入蒸馏水，使高出床表面3～5cm，打开出口， 开始洗脱，直至两条色带分开。仔细观察样品在层析柱内的分离现象。
实验13 ：凝胶柱层析分离血红 蛋白和DNP-胰糜蛋白酶
实验14：血清蛋白质乙酸纤维素 薄膜电泳
生物化学与分子生物学系
实验14 血清蛋白质乙酸纤
维素薄膜电泳
P58
一、目的与要求：
1、掌握CAM电泳的基本原理 2、学习CAM电泳的操作技术
电泳
带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电 极移动，利用带电粒子在电场中移动速度不同而 达到分离的技术称为电泳技术。
6. 浸洗：依次浸洗液浸洗3次，每次5-10min。 依次
四、注意事项：
1. 区分电泳箱正负极，玻璃片密封，集体电泳。 2. 沾适量样本垂直点样，点在距膜端 1.5-2cm处，一 定要标记好，注意保持膜半干燥。 3. 点样处放在电泳箱的负极端，并保持膜水平。 4. 浸洗液依次漂洗染色膜。 5. 先切断电源再取膜。
1. 装置电泳箱。
快
2. 点样：浸于巴比妥溶液中的乙酸纤维素薄膜，滤纸轻轻吸
干----半干燥态。铅笔标记；点样器沾适量新鲜血清，在
距膜端 1.5~2cm处垂直点样。
区分正负极
3. 放入电泳槽。点样端位于负极，保持膜直；不下垂。
4. 通电：180伏，50-60min。断电后，取膜。
安全
5. 染色：氨基黑染色10min（轻轻振晃）。
五、实验结果
醋酸纤维素薄膜
albumin 1 2 标记出每条条带的名称
实验13 凝胶柱层析分离血红 蛋白和DNP-胰糜蛋白酶
P57
一、目的与要求
掌握凝胶层析的原理、熟练掌握实验操作。
二、实验原理
凝胶层析法是指混合物随流动相，经过凝胶层析柱 时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
分 子 筛 效 应
样品性质
血红蛋白
红色，分子量 67 kD， 分子直径大于颗粒网孔，只能在胶粒外部空隙间流动， 所受胶粒的阻力小，流速快，首先被洗脱下来
DNP-胰糜蛋白酶
黄色，分子量 13.5 kD， 分子直径小于胶粒网孔，完全进入胶粒内部，在内部流动， 受到阻力大，后被洗脱下来
葡聚糖凝胶（Sephadex)