橙黄玉凤花种子萌发培养及小苗组培快繁研究

收稿日期：2018-07-23 修回日期：2018-08-10基金项目：广东省科技厅科技基础条件研究项目(2015A030302007)；广东省科技计划项目(2017A020213031)；惠州市科技计划项目(2016x0427042)；广东省植物学资源共享课程(粤教函2017(214)号)作者简介：郑洲翔，博士，副教授，从事园林植物研究。

E-mail: 32091827@橙黄玉凤花种子萌发培养及小苗组培快繁研究郑洲翔1，刘德浩2，陈智涛2，廖建良1(1.惠州学院生命科学学院，广东 惠州 516007；2.惠州市林业科学研究所，广东 惠州 516001)摘 要：对橙黄玉凤花Habenaria rhodocheila 种子进行无菌萌发培养以获得大量原球茎，并对原球茎组培，建立其快繁体系。

结果表明，橙黄玉凤花种子以0.1%升汞消毒15 min 为最佳处理。

种子萌发培养基中，添加0.2%活性碳(AC)有利于种子萌发。

种子萌发的最佳培养基为1/2MS ＋NAA 0.5 mg·L -1＋AC 0.2%，原球茎增殖分化最佳培养基为1/2MS ＋NAA 0.2 mg·L -1＋ZT 3.0 mg·L -1＋AC 0.2%；生根最佳培养基为1/2MS ＋NAA 0.1 mg·L -1＋6-BA 2.0 mg·L -1＋AC 0.2%。

关键词：橙黄玉凤花； 组织培养；快繁Doi: 10.3969/j.issn.1009-7791.2018.03.017中图分类号：S682.31 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2018)03-0273-04Tissue Culture and Rapid Propagation of Habenaria rhodocheilaZHENG Zhou-xiang 1, LIU De-hao 2, CHEN Zhi-tao 2, LIAO Jian-liang 1(1.School of Life Science, Huizhou University, Huizhou 516007, Guangdong China; 2.Huizhou Institute of Forestry, Huizhou 516001, Guangdong China)Abstract: Effects of different disinfection treatments, additives, plant growth regulators on tissue culture and rapid propagation system of Habenaria rhodocheila with seeds as explants were studied. Sterilizing the seeds with 0.1% mercuric chloride for 15 min was the best disinfection treatment. Seeds germinated only on the medium adding active carbon(AC). 0.2% active carbon in culture medium was fit for germination. The optimal medium for seed germination was 1/2MS ＋NAA 0.5 mg·L -1＋AC 0.2%, the optimal medium for multiple buds formation was 1/2MS ＋NAA 0.2 mg·L -1＋ZT 3.0 mg·L -1＋AC 0.2%, the optimal rooting medium was 1/2MS ＋NAA 0.1 mg·L -1＋6-BA 2.0 mg·L -1＋AC 0.2%.Key words: Habenaria rhodocheila ; tissue culture; rapid propagation橙黄玉凤花Habenaria rhodocheila 属于兰科玉凤花属多年生草本植物，产于江西、福建、湖南、广东、香港、海南、广西、贵州(榕江)。

越南、老挝、柬埔寨、泰国、马来西亚、菲律宾也有分布[1]。

一般生于海拔300～1500 m 山坡或沟谷林下阴处地上或岩石覆土中。

其株型优雅，花型优美，花色新奇，具有较好的观赏价值。

此外，橙黄玉凤花对治疗肺热咳嗽、疮疡肿毒、跌打损伤有一定药效，具有清热解毒、活血止痛的药用价值。

在我国，橙黄玉凤花极少栽培，其野生资源被过度采摘，日见枯竭。

《濒危野生动植物种国际贸易公约》已将其列为保护物种，中国《野生植物保护名录》中也将其划为二级保护植物[2]。

虽然橙黄玉凤花不是市场主流的兰花品种，但其花朵有如蝴蝶般多姿。

在泰国，橙黄玉凤花已批量出口至世界各地[3]。

通过组织培养，大量繁殖橙黄玉凤花，可实现满足市场需求与保护其野生资源的目的。

2018,47(3): 273～276.Subtropical Plant Science第47卷 ﹒274﹒1 材料与方法1.1 材料橙黄玉凤花为地生兰，萼片绿色，唇瓣橙黄色(图1: A, B)。

实验用种子采自广东省惠州市国营汤泉林场。

1.2 方法1.2.1 种子消毒处理 将采集的橙黄玉凤花蒴果(图1: C)，先用75%乙醇浸泡30 s ；再用0.1%升汞分别浸泡5、10、15、20 min ，然后用无菌水冲洗5～6次，用无菌滤纸吸干表面水分。

1.2.2 种子萌发培养基 以1/2MS 为基本培养基。

添加活性炭浓度分别为0、0.2%。

NAA 浓度分别定为0、0.2、0.5、1.0 mg·L -1 4 个处理，培养基添加活性炭0.2%。

1.2.3 增殖分化培养基 以1/2 MS 为基本培养基。

ZT 浓度分别为0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L -1；NAA 浓度分别为0、0.2、0.5、1.0 mg·L -1。

每个培养基中接种5个原球茎，每处理接种20个原球茎。

1.2.4 生根培养基 以1/2 MS 为基本培养基，添加不同浓度NAA(0、0.1、0.2 mg·L -1)和6-BA(0、0.5、1.0、2.0、3.0 mg·L -1)。

每处理接种20个诱导芽。

培养基添加活性炭0.2%。

特别实验除外，培养基经高温高压灭菌后冷却备用，并添加蔗糖3%和琼脂0.8%，pH 5.8～6.0。

种子萌发实验中，每处理接种一个蒴果的种子，种子均匀地播种在培养基表面。

每天观察萌发情况，30 d 后统计污染情况。

种子开始萌发后，每20 d 统计其萌发株数，至萌发数量稳定为止。

每处理3个重复。

1.3 培养条件培养温度(25 ± 2) ℃，光照强度1500～2000 lx ，光照时间10～12 h·d -1。

1.4 炼苗与移栽将长有2个根茎和2片小叶的瓶苗在室温条件下炼苗7 d ，拧松培养瓶盖再在室温条件下炼苗14 d ，打开培养瓶盖在室温阴凉条件下炼苗7 d 。

取出小苗，将根茎清洗干净后，在阴凉处晾1 d ，栽种至基质中(有机土∶沙子∶蛭石体积比为1∶1∶1)。

移栽苗于温室大棚培养，60 d 后统计移栽苗成活率。

2 结果与分析2.1 消毒时间选择 橙黄玉凤花种子用0.1%升汞浸泡15 min 处理最为合适。

浸泡15 min 的污染率远小于浸泡5 min 和10 min (表1)，而浸泡20 min 的污染率虽然与浸泡15 min 相同，但其种子活力可能减弱。

2.2 活性碳对种子萌发的影响 橙黄玉凤花种子在没有活性炭的培养基中不萌发，而在添加0.2%活性炭的培养基中萌发率高达80%(表2)，活性炭对种子萌发起决定性影响(图1: D, E) 。

2.3 NAA 对种子萌发的影响 NAA 能促进种子萌发和原球茎发育。

NAA 浓度为0.2～0.5 mg·L -1时，种子萌发的数量和原球茎质量都明显提高(图1: F)。

NAA 浓度从0.5 mg·L -1升至1.0 mg·L -1时，虽然种子萌发数量有所增加，但是原球茎的粒径和白色绒毛数量都减少，胚发育的活性减弱(表3)。

因此NAA 浓度为0.2～0.5 mg·L -1较合适。

表1 不同消毒时间对种子的影响Table 1 Effects of different disinfection times onseeds消毒时间/min 接种数(蒴果)污染数 污染率/% 5 3024 80 10 3018 60 15 303 10 20 30 3 10 注：表中数值为三次重复的平均值，下表同。

表2 活性炭浓度对种子萌发的影响 Table 2 Effect of AC on the germination 活性碳/% 接种数(蒴果) 萌发数(蒴果) 萌发率/%0 30 0 0 0.2 30 24 80第3期 郑洲翔,等：橙黄玉凤花种子萌发培养及小苗组培快繁研究﹒275﹒表3 NAA 浓度对种子萌发影响Table 3 The effect of NAA on the germinationNAA/mg·L -1 接种数(蒴果) 萌发数 原球茎生长情况0 30 2250 白色卵圆形，粒径较小，绒毛较少0.2 30 3156 白色至乳黄色，卵圆形，粒径较大，绒毛较多0.5 10 3638 白色至乳黄色，卵圆形，粒径较大，绒毛多1 10 3504 白色，卵圆形，粒径较小，绒毛少 2.4 NAA 和ZT 对原球茎增殖分化的影响 NAA 、ZT 能有效促进原球茎的增殖分化。

当培养基中不添加NAA 时，ZT 浓度从0增至4.0 mg·L -1，原球茎增殖倍数由1.3升至2.9(表4)。

在未添加ZT 的培养基中，NAA 浓度由0升至 0.5 mg·L -1时，原球茎增殖倍数由1.3增加至2.2，但是当NAA 浓度继续增至 1.0 mg·L -1时，原球茎增殖倍数降至1.8。

二者结合，以NAA 0.2 mg·L -1、ZT 3.0 mg·L -1时，增殖倍数最高，达到7.4倍 (图1: G)。

2.5 生根培养NAA 、6-BA 能明显促进生根(表5)。

在培养基未添加NAA 的情况下，6-BA 浓度由0增至 3.0 mg·L -1时，生根率由3.1%提高至51.2%。

在培养基未添加6-BA 的情况下，NAA 的浓度由0增至0.2 mg·L -1时，生根率由3.1%增至68.7%。