疏水层析填料
层析填料介绍
层析填料介绍
一、离子交换层析柱
1. 弱阳离子交换填料：以羧基为主，常用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
2. 强阳离子交换填料：以氨基为主，常用于有机物、生物小分子、金属离子等的分离。
3. 弱阴离子交换填料：以胺基为主，通常用于无机阴离子、有机酸、磷酸等的分离。
4. 强阴离子交换填料：以季铵盐为主，常用于离子的选择性吸附分离、蛋白质去除等。
二、凝胶层析柱
1. 大孔凝胶层析填料：具有大的孔径和大的分子量，适用于大分子的分离和纯化，如蛋白质、糖类等。
2. 中孔凝胶层析填料：孔径和分子量较小，适用于中小分子的分离和纯化，如抗体、糖体、药物等。
3. 小孔凝胶层析填料：孔径和分子量非常小，适用于小分子有机物、酶、激素等的分离和纯化。
4. 离子交换凝胶层析填料：同时具有凝胶和离子交换功能，适用于对分子量和电荷具有选择性的物质的分离和纯化。
三、亲和层析柱
1. 金属亲和层析填料：以Ni、Co、Zn等为配位离子的柱子，适用于含有带金属结构的肽、蛋白质、核酸等的分离。
2. 免疫亲和层析填料：以特异性抗体为配体的柱子，可用于分离和纯化含有特定表位的蛋白质等物质。
3. 亲和层析填料：利用配位、化学键合、反相作用等与物质之间的亲和力实现分离和纯化。
以上是常见的层析柱填料种类及其特点，选择合适的填料可提高层析分离效率和纯化效果。
不同层析填料结构及性能汇总
不同层析填料结构及性能汇总层析填料是一种在化学工艺过程中常用的颗粒填料，用于物质的分离、提纯和反应等操作中。
不同的层析填料结构具有不同的特点和性能，下面是几种常见的层析填料结构及其性能的汇总。
1.球形填料：球形填料是层析填料中常见的一种，主要特点是球形颗粒，表面光滑。
球形填料的优点是具有较好的流动性，易于装填和拆卸，而且堆积密度较大，具有较高的载液处理能力。
球形填料的局限性是接触面积相对较小，不适合用于需要更大的接触面积的反应。
常用的球形填料有玻璃微珠和石英微珠等。
2.塔板填料：塔板填料是一种层析填料，其结构为多孔板状结构。
塔板填料的主要优点是填料与流体的接触面积大，具有很高的传质效果。
而且利用塔板填料可实现对流体的逆向流动和分布，能够达到较好的分离效果。
不过塔板填料的缺点是容易堵塞，需要定期维护和清洗。
常见的塔板填料有不锈钢网格填料和陶瓷塔板填料等。
3.散堆填料：散堆填料是一种高度散装的层析填料，其结构松散，流体在填料之间能够较为均匀地流动。
散堆填料的主要优点是填料之间通道较大，流体阻力小，能够获得较大的固液接触面积，有利于物质的分离和传质。
散堆填料的缺点是装填和拆卸比较困难，而且流体流动过程中易造成填料的堵塞。
常见的散堆填料有活性炭、陶瓷颗粒和聚苯乙烯微珠等。
4.结构化填料：结构化填料是一种具有规则几何形状的层析填料，可以是板状、网状或块状等。
结构化填料的主要优点是填料具有统一的形状和大小，能够获得较好的流体分布和传质效果，而且填料之间的通道大小可以根据需要进行调整。
结构化填料的缺点是成本较高，制造过程复杂。
常见的结构化填料有金属泡沫填料和陶瓷梯度填料等。
综上所述，不同的层析填料结构具有不同的特点和性能，可以根据具体的应用需求选择适合的填料结构。
球形填料具有良好的流动性和高的载液处理能力；塔板填料具有高的传质效果和分离能力；散堆填料具有较大的固液接触面积；结构化填料具有统一的形状和大小等特点。
层析填料介绍
层析填料介绍摘要：一、层析填料的概念与分类1.层析填料的定义2.分类方法及常见类型二、层析填料的工作原理1.分离原理2.固定相与流动相三、层析填料的应用领域1.生物制药2.食品工业3.环境保护四、我国层析填料的发展现状与趋势1.发展现状2.技术挑战3.未来发展趋势五、结论正文：层析填料是一种具有特定孔径和分离效果的微球或膜材料，广泛应用于生物分离和纯化领域。
本文将介绍层析填料的概念、分类、工作原理、应用领域以及我国的发展现状与趋势。
一、层析填料的概念与分类层析填料是一种具有多孔结构的材料，其分离效果主要取决于固定相（填料）与流动相（样品）之间的分配系数差异。
根据分离原理和固定相的性质，层析填料可分为多种类型，如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
二、层析填料的工作原理层析填料的分离效果主要依赖于样品中各组分与固定相之间的吸附和解吸作用。
在层析过程中，样品在流动相的带动下，经过填料层，各组分根据与固定相的亲和力不同，发生不同程度的吸附和解吸，从而实现分离。
三、层析填料的应用领域层析填料在生物制药、食品工业和环境保护等领域具有广泛应用。
在生物制药领域，层析填料可用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化；在食品工业中，可用于天然产物、食品添加剂等的提纯与精制；在环境保护方面，可应用于水质处理、废气净化等。
四、我国层析填料的发展现状与趋势我国层析填料行业在近年来取得了显著的发展，但与国际先进水平相比，仍存在一定的技术差距。
目前，我国层析填料产业面临着技术挑战，如提高填料的分离效果、降低生产成本、开发新型填料等。
未来，我国层析填料行业将朝着高技术含量、高附加值、绿色环保的方向发展。
综上所述，层析填料作为一种重要的生物分离材料，具有广泛的应用前景。
蛋白质分离纯化的原理
蛋白质分离纯化的原理
蛋白质分离纯化的原理主要基于不同蛋白质之间的化学性质和生物活性的差异。
以下是一些常用的蛋白质分离纯化原理：
1. 尺寸排除层析（Size Exclusion Chromatography）：利用各种不同孔径的柱填料，通过蛋白质在柱中流动时，根据分子量的大小来进行分离。
较大分子量的蛋白质会逐渐流过柱床，而较小分子量的蛋白质则会进入柱床的孔隙中。
2. 亲和层析（Affinity Chromatography）：利用蛋白质与特定配体之间的亲和性进行分离。
通常在柱填料上固定对目标蛋白质有选择性结合的配体，通过向柱中加入蛋白质混合物，目标蛋白质可以与柱填料上的配体结合，而其他非特异性结合的蛋白质则会迅速流出。
最后，通过改变条件，如改变pH或加入竞争性配体，可以使目标蛋白质从柱上解离。
3. 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）：利用蛋白质与固定的离子交换基团之间的静电相互作用进行分离。
在柱填料上固定有阴离子交换基团的柱填料，当蛋白质混合物从柱中通过时，具有不同电荷的蛋白质会与柱填料上的离子交换基团发生相互作用，从而实现分离。
4. 疏水层析（Hydrophobic Interaction Chromatography）：利用蛋白质与柱填料上的疏水基团之间的疏水相互作用进行分离。
在柱填料上固定有疏水基团，当蛋白质混合物从柱中通过时，具有较强疏水性的蛋白质会与柱填料上的疏水基团发生相互作用，从而实现分离。
这些方法经常结合使用，以提高对目标蛋白质的纯化程度和产量。
在实际应用中，选择适当的分离纯化方法还需要考虑蛋白质性质、产量要求以及研究目的等因素。
疏水作用色谱填料研究进展
值）３ 如磷酸盐体系、 （） ２， 乙酸－ 乙酸盐体系等， 可以避
免残 留硅 醇带来 的阴离 子效应及硅基填 料的溶解 损 失 。另 外 在 酸 性 ｐ 值 下 ， 白 质 会 部 分 变 质 失 Ｈ 蛋
出现， 使得原先缓慢的疏水色谱分离技术实现快速
分 成 可 （０ 离 为 能９ ２） ， ３
２ １４ 贯穿 （ｅｆ ｉ ） ．． ｐｒ ｓ ｎ 孔基质 ｕｏ
快速 分离（ ｍｎ 的活性 回收率很高（ ＜５ ｉ） ８ ）
２１３ 聚合物基质 ．．
针对硅 胶在碱 性条 件下 易溶 解 的缺点 ， 也为 了
２２ 疏水性配基 ． ＨＣ填料的一个重要特点是配基具有很弱的疏 Ｉ
水性 ， 与蛋 白质作用很温和 ， 从而能很 好地保 留蛋 白 质的生物活性（） 水配 基的类 型 、 ２。疏 ６ 烷基配 基 的碳 链长 短都是决 定填 料疏 水性 的关键 。前面 已提到 ，
甲氧基聚乙二醇修饰的葡糖氧化酶与良他酶素的共
轭产物 。 张 仁斌 等（） 聚 乙二 醇键 合在 大 颗粒 基 质如 ３将 ３
多孔玻璃和琼脂糖软凝胶和硅胶上制成键合相可用 于蛋白质的疏水分离。其中Ｐ Ｇ１０ 键合填料 Ｅ －５０
（０ｍ） ５ｎ 有最佳分离效 能 ， 白质在此柱上 可得 ９ ％ 蛋 ０
以上的活性回收率。２ ｇ以上的蛋白质样品可一次 ｍ 注入 １０ ｍ×５ ｍ ｉ ． ０ｍ ｍ ． 分析柱中而不影响分辨率 ． ｄ
满足某些特殊场合分离的需要， 人们开发了高分子 聚合物填料， ｏａｓ ｎ５ １７ 年研究了不同 如Ｊｈｎｓ （ 于 ９４ ｏ２ ）
组成的丙烯 酰胺和 甲基丙烯酸 酯合 成的共聚物填 料 与醇脱氢酶 的疏水作用对酶活性 的影响 。
ＨＣ填料的碳链与Ｒ Ｌ Ｉ Ｐ Ｃ不同， 一般偶联密度很低，
疏水层析填料
2008-6 Volume 8疏水层析填料疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。
一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。
影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。
疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。
Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：Cellfine TM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。
结构见下图：填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。
通常，Cellfine TM Octyl对疏水性蛋白的吸附性会强于Cellfine TM Butyl对疏水性蛋白的吸附。
然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。
Cellfine TM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。
在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。
三种疏水层析填料的疏水性差异（左图）色谱柱：8.2 x 150 mm柱体积：8 ml流动相：2.0 – 0.0MAmmonium Sulfatein 0.01M phosphate, pH 7.0流速：1.32 ml/min样品：5 mg/3 ml– 100 µl2008-6 Volume 8Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱）Asahipak NH2P色谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。
Asahipak NH2P色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。
与硅胶基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，Asahipak NH2P可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。
疏水层析填料种类
疏水层析填料种类疏水层析填料是一种常用于色谱分析中的填料材料，它具有疏水性能，能够在分离过程中有效地分离样品中的混合物。
下面将介绍几种常见的疏水层析填料种类。
1. 碳链疏水层析填料碳链疏水层析填料是一种以疏水性为基础的填料材料。
它由具有碳链结构的有机化合物制成，具有较高的疏水性能。
碳链疏水层析填料在分离过程中能够有效地吸附和分离样品中的非极性化合物，如脂肪酸、烷烃等。
碳链疏水层析填料常用于食品、医药、环境等领域的分析中。
2. 硅胶疏水层析填料硅胶疏水层析填料是一种以硅胶为基础的填料材料。
硅胶具有较高的孔隙度和比表面积，能够提供较大的吸附表面，因此适用于分离和富集样品中的疏水性化合物。
硅胶疏水层析填料广泛应用于有机合成、药物分析和环境监测等领域。
3. 疏水性分子筛层析填料疏水性分子筛层析填料是一种以分子筛为基础的填料材料。
分子筛是一种具有特殊孔隙结构的材料，能够通过选择性吸附分离混合物中的特定成分。
疏水性分子筛层析填料主要应用于石油化工、精细化工和环境保护等领域，能够有效地分离和富集样品中的疏水性物质。
4. 疏水性聚合物层析填料疏水性聚合物层析填料是一种以聚合物为基础的填料材料。
疏水性聚合物具有较高的亲水性，能够在分离过程中选择性地吸附和分离样品中的疏水性化合物。
疏水性聚合物层析填料在生物医药、食品分析和环境监测等领域具有广泛的应用。
总结起来，疏水层析填料种类多样，每种填料都具有独特的特点和适用范围。
选择合适的疏水层析填料能够提高色谱分析的分离效果和分析灵敏度，为科研和生产提供可靠的数据支持。
在实际应用中，需要根据样品特性和分离要求选择合适的疏水层析填料，以获得准确、可靠的分析结果。
层析填料选择
•柱效/分辨率 •表面特性 •压力/流速特性
14 / GE /
按照层析技术原理分类选择填料
• 凝胶过滤填料选择 • 离子交换填料选择
• 亲和填料选择
• 疏水填料选择 • 反相填料选择
15 / GE /
离子交换（IEX）－最受欢迎的层析方法
原理：根据生物分子的表面电荷性质进行分离纯化，
可以应用在层析的各个阶段。
7
2 4 5 3 6
100,000 1,000,000 10,000,000
1. Superdex™ Peptide 2. Superdex 75 3. Superdex 200 4. Sephacryl™ S-100 HR 5. Sephacryl S-200 HR 6. Sephacryl S-300 HR 7. Sephacryl S-400 HR
小
高
90um
Q、SP、DEAE、CM、ANX Sepharose Fast Flow
DEAE、CM Sepharose CL-6B
100-300um
Q、SP Sepharose Big Beads
Sreamline SP and DEAE
颗 粒
大
分 辨 率 低
18 / GE /
Q、SP Sepharose XL －－超高载量填料
27 / GE /
Capto MMC
－－耐高盐浓度的弱阳离子交换凝胶
• 高盐吸附
• 新的选择性
28 / GE /
Layered beads-Two Examples
Shell Beads
22 / GE /
Capto基架刚性更强
•高流速、低反压 •高载量
Capto™ Q and Sepharose™ 6 Fast Flow in BPG™ 300, 20 cm bed height
层析柱填料的分类
层析柱填料的分类层析柱填料是一种常用的分离技术，在多个领域都有广泛的应用。
根据其物理性质和化学性质的不同，层析柱填料可以分为不同的分类。
本文将对层析柱填料的分类进行详细介绍。
一、根据物理性质分类1. 吸附填料：吸附填料是层析柱中最常用的一种填料。
其主要特点是表面具有较强的吸附能力，可以与待分离物质发生物理吸附作用。
常见的吸附填料有硅胶、活性炭、分子筛等。
吸附填料在生物制药、食品加工、环境监测等领域有广泛应用。
2. 离子交换填料：离子交换填料是一种带电的固体颗粒，其表面带有正或负电荷。
离子交换填料可以与待分离物质中的离子发生离子交换作用，实现分离纯化的目的。
常见的离子交换填料有阳离子交换树脂、阴离子交换树脂等。
离子交换填料在水处理、生物制药、化工等领域有广泛应用。
3. 柱色谱填料：柱色谱填料是一种高效分离的填料，其主要特点是具有较大的表面积和较好的分离效果。
常见的柱色谱填料有C18、C8、氨基、硅胶等。
柱色谱填料在药物分析、环境监测、食品检测等领域有广泛应用。
二、根据化学性质分类1. 亲水性填料：亲水性填料是一种具有亲水性表面的填料，其主要特点是对亲水性物质具有较好的吸附和分离效果。
常见的亲水性填料有硅胶、糖凝胶、羟基磷灰石等。
亲水性填料在生物制药、食品加工等领域有广泛应用。
2. 疏水性填料：疏水性填料是一种具有疏水性表面的填料，其主要特点是对疏水性物质具有较好的吸附和分离效果。
常见的疏水性填料有疏水性聚合物、疏水性硅胶等。
疏水性填料在有机合成、食品加工等领域有广泛应用。
3. 离子互化填料：离子互化填料是一种可以与待分离物质发生离子交换作用的填料，其主要特点是对离子性物质具有较好的吸附和分离效果。
常见的离子互化填料有阳离子交换树脂、阴离子交换树脂等。
离子互化填料在环境监测、药物分析等领域有广泛应用。
三、根据粒径分类1. 大孔径填料：大孔径填料是一种具有较大孔径的填料，其主要特点是具有较大的表面积和较好的传质效果。
疏水层析填料种类
疏水层析填料种类疏水层析填料是一种常用于化学实验室和工业生产中的分离技术。
它通过利用不同物质在填料表面的亲水性和疏水性差异，实现物质的分离和提纯。
目前市场上存在多种不同种类的疏水层析填料，下面将介绍其中几种常见的填料种类。
1. 疏水树脂疏水树脂是一种常见的疏水层析填料，它具有较好的亲水性和疏水性，可用于吸附和分离含有疏水性物质的溶液。
疏水树脂通常由聚合物材料制成，表面包覆有疏水基团。
常见的疏水树脂有聚苯乙烯、聚苯乙烯交联物等。
疏水树脂具有较高的吸附能力和选择性，适用于分离不同大小和形状的分子。
2. 疏水凝胶疏水凝胶是一种由高分子材料制成的填料，其表面具有疏水性。
疏水凝胶的特点是具有高比表面积和较大的孔隙度，可以提供较大的吸附容量和分离效果。
常见的疏水凝胶有聚丙烯酸甲酯凝胶、聚乙烯醇凝胶等。
疏水凝胶的优点是具有较高的化学稳定性和机械强度，适用于工业生产中的分离和纯化过程。
3. 疏水陶瓷疏水陶瓷是一种新型的疏水层析填料，它由陶瓷材料制成，并在表面涂覆一层疏水性物质。
疏水陶瓷具有良好的化学稳定性和机械强度，可耐受高温和酸碱环境。
疏水陶瓷的孔隙结构和比表面积可调控，适用于不同分子的分离和纯化。
疏水陶瓷广泛应用于生化、制药、环保等领域。
4. 疏水纤维疏水纤维是一种以纤维材料为基础的疏水层析填料。
疏水纤维具有较大的比表面积和良好的吸附性能，可用于分离和纯化溶液中的目标物质。
疏水纤维可采用不同的纤维材料制成，如聚丙烯、聚乙烯、聚酯等。
疏水纤维的优点是易于制备和使用，适用于小规模实验室和工业生产中的分离需求。
总结起来，疏水层析填料种类多样，不同的填料适用于不同的分离和纯化需求。
选择适合的疏水层析填料可以提高分离效果和纯化效率，为实验和生产过程提供便利。
随着科学技术的不断发展，疏水层析填料的种类还将不断更新和发展，为分离科学领域带来更多的应用和突破。
疏水相互作用层析和反相层析
实用文档GE Healthcare疏水相互作用和反相层析技术原理和方法实用文档GE Healthcare生命科学产品使用手册抗体纯化手册18-1037-46重组蛋白手册蛋白扩增与简单纯化18-1142-75蛋白纯化手册18-1132-29离子交换色谱及色谱聚焦原理与方法11-0004-21亲和色谱层析原理与方法18-1022-29 疏水相互作用原理与方法18-1020-90凝胶排阻层析原理与方法18-1022-18扩张床吸附技术原理与方法18-1124-26微载体细胞培养原理与方法18-1140-62Percoll方法学与应用 18-1115-69Ficoll-Paque Plus淋巴细胞的体外分离18-1152-69GST基因融合系统手册1 8-1157-58二维电泳（固定的 pH梯度）原理与方法80-6429-60实用文档目录简介………………………………………………………………………………………………………9第一章疏水相互作用层析的原理……………………………………………………………………12理论情况下的疏水相互作用层析……………………………………………………………………12水的作用………………………………………………………………………………………………12蛋白结构………………………………………………………………………………………………13可逆的相互作用………………………………………………………………………………………14疏水相互作用分离的步骤……………………………………………………………………………14分辨率…………………………………………………………………………………………………17柱效……………………………………………………………………………………………………18选择性…………………………………………………………………………………………………19第二章疏水相互作用的实践…………………………………………………………………………25简介……………………………………………………………………………………………………25纯化策略（ CIPP）中的疏水相互作用层析…………………………………………………………25疏水相互作用分离的实际考虑………………………………………………………………………27筛选选择性……………………………………………………………………………………………30自动的疏水相互作用填料筛选，方法开发和优化…………………………………………………30手动介质筛选，方法开发和优化……………………………………………………………………31样品性质和配基的选择………………………………………………………………………………33盐的选择和缓冲液制备………………………………………………………………………………33柱子和填料准备………………………………………………………………………………………38样品制备………………………………………………………………………………………………38样品上样………………………………………………………………………………………………39样品上样量……………………………………………………………………………………………39样品体积………………………………………………………………………………………………40温度……………………………………………………………………………………………………40洗脱……………………………………………………………………………………………………41线性梯度洗脱…………………………………………………………………………………………41逐步洗脱………………………………………………………………………………………………42流速……………………………………………………………………………………………………35流速控制………………………………………………………………………………………………44洗涤和再平衡…………………………………………………………………………………………45分析结果和下一步……………………………………………………………………………………45规模化放大……………………………………………………………………………………………46仪器选择………………………………………………………………………………………………46实用文档疏水相互作用层析介质的保养 (47)问题解决 (47)理想的疏水相互作用分离：目的蛋白可以用梯度洗脱很好的分离 (47)目的蛋白在梯度里很早洗脱，分辨率差 (47)目的蛋白在梯度的末端洗脱，分辨率差 (48)目的蛋白在梯度的中间洗脱，分辨率差 (48)BioPress填料 -专为生产设计的填料…………………………………………………………………52客户定制的填料………………………………………………………………………………………52客户定制产品…………………………………………………………………………………………52第3章疏水相互作用层析的介质……………………………………………………………………53简介……………………………………………………………………………………………………53 SOURCE：用高分辨率纯化和简单放大 (53)纯化选项 (54)纯化案例 (56)进行一次分离 (58)第一次使用或长期储存后使用 (59)用梯度洗脱分离 (59)用逐步洗脱分离 (59)清洗 (60)填料性质 (60)化学稳定性 (61)保存 (61)Sepharose High Performance：高分辨纯化…………………………………………………………61纯化选择………………………………………………………………………………………………62纯化案例………………………………………………………………………………………………64进行一次分离…………………………………………………………………………………………65第一次使用或长期储存后使用………………………………………………………………………66用梯度洗脱分离………………………………………………………………………………………67用逐步洗脱分离………………………………………………………………………………………67清洗……………………………………………………………………………………………………67填料性质………………………………………………………………………………………………68化学稳定性……………………………………………………………………………………………69保存……………………………………………………………………………………………………69 Sepharose Fast Flow：用高分辨纯化，简单放大…………………………………………………69纯化选择………………………………………………………………………………………………70纯化案例………………………………………………………………………………………………72实用文档进行一次分离 (75)第一次使用或长期储存后使用 (76)用梯度洗脱分离 (77)用逐步洗脱分离 (77)清洗 (77)填料性质 (78)化学稳定性 (78)保存 (79)第四章纯化策略中的疏水相互作用层析 (79)应用 CIPP (80)纯化技术的选择和组合 (80)疏水相互作用层析作为捕获步骤 (82)纯化重组人表皮生长因子（ h-EGF） (83)用于中度纯化的疏水相互作用层析 (84)纯化 Fab片段 (85)疏水相互作用层析作为精细纯化 (86)纯化重组的 Pseudomonas aeruginosa exotoxin A，PE553D (86)用作精细纯化的其它技术 (88)第五章反相层析：原理和方法 (89)简介 (89)术语 (92)反相层析理论 (90)反相层析分离的步骤 (91)分辨率 (93)选择性 (95)反相层析的实践 (103)填料和柱子选择 (103)洗脱液选择和准备 (104)柱子和填料准备 (107)样品制备 (107)样品上样量 (108)样品体积 (108)温度 (108)洗涤和再平衡 (110)问题解决 (110)鬼峰 (110)实用文档基线漂移：平衡洗脱液 (110)纯化选项 C C2/C18:对复杂样品的高分辨分离...............................................................113使用μRPC .........................................................................................................113分离案例.........................................................................................................114进行分离.........................................................................................................115第一次使用或长期储存后使用..............................................................................115用梯度洗脱分离................................................................................................115清洁...............................................................................................................116填料性质.........................................................................................................117化学稳定性......................................................................................................117储存...............................................................................................................117 SOURCE：快速高分辨分离，简单规模化放大 (117)纯化选项 (118)纯化案例 (118)进行分离 (121)第一次使用或长期储存后使用 (121)用梯度洗脱分离 (122)清洗 (122)填料性质 (123)化学稳定性 (124)储存 (124)反相层析和 CIP (124)反相层析作为捕获步骤 (125)反相层析作为中度纯化 (125)反相层析作为精细纯化 (125)附录 1样品制备 (126)样品的稳定性 (126)样品净化 (127)特定的样品制备步骤 (128)蛋白沉淀的重新溶解 (131)更换缓冲液和脱盐 (132)除去脂蛋白 (135)除去酚红 (135)除去小分子量杂质 (135)附录 2填充和制备柱子 (136)选择柱子 (137)实用文档柱子填充和柱效 (137)附录 3选择纯化设备 (139)直线流速（ cm/h）和体积流速（ ml/min）之间的相互转换 (140)从直线速度（ cm/h）到体积流速（ ml/min） (140)从体积流速（ ml/min）到直线速度（ cm/h） (140)从ml/min到使用注射器..........................................................................................141附录 4换算数据：蛋白、柱压.................................................................................141柱压...............................................................................................................141附录 5氨基酸表................................................................................................142附录 6纯化过程中的分析检测..............................................................................144附录 7生物样品的保存 (146)实用文档简介如图 1所示，根据生物分子的不同特性，可以用层析技术分离开。
疏水层析影响因素解析
疏水层析影响因素解析1. 疏水层析填料的选择*不同的配基的疏水填料与蛋白的结合能力强弱不同，在进行疏水层析时要对不同的疏水填料进行筛选对比。
Butyl-S（苯基）（从左往右疏水性增强）*同一配基的疏水填料由于配基密度不同，其和蛋白的的疏水作用力也不同，筛选填料时也要对不同的配机密度的疏水填料进行对比筛选。
2. 样品的性质蛋白质的疏水性强弱取决于其表面疏基团的分布，同时与样品缓冲液的离子强度，离子种类，pH,所处的温度都有一定的关系，在进行疏水层析时要保持恒定的温度，且要对样品缓冲液的离子种类及离子强度，pH进行筛选对比分析。
3. 层析柱反压升高或柱效下降（1）确保压力的升高是由层析柱引起的检查在线滤器；从组分收样器开始断开管线，观察压力变化排除其他原因造成的压力升高。
（2）层析柱使用过程杂质的积累对填料进行清洗：先用0.5M的氢氧化钠洗1CV,然后用去离子水把碱洗掉（5CV),之后在用30%的异丙醇洗1CV，异丙醇洗完后用去离子水洗5CV，上样1CV 1mg/ml胃蛋白酶溶液（溶于0.1M乙酸，0.5M氯化钠，降解沉淀在层析柱上的蛋白），室温过夜，再用1.5CV 0.2M NaOH清洗，再用4CV去离子水清洗。
（3）柱床太高疏水层析装填高度建议在10-20cm，大于20cm反压增大。
（4）流速过快使用适当的流速。
（5）层析填料被污染或老化随着填料的使用，一些杂质的积累会使层析填料的孔径发生变化（如堵塞，非特异性吸附积累，微生物污染，破碎等），导致其排阻能力发生偏差而影响分离度。
此时可对填料进行CIP清洗，若清洗后还不能达到分离要求，就要更换新的填料。
4. 层析柱进气泡大量进行很好脱气的去离子水反相冲洗平衡层析柱（30cm/h），气泡会被逐渐带出层析柱。
5. 洗脱时没有收到目标物质或者洗脱量太少(1) 目标物没有与介质结合或结合量较少先确认目标物质是否和填料结合(2) 洗脱时间不够降低流速，延长洗脱液的保留时间(3) 目标物质和填料结合强度太高降低平衡液中盐浓度或更换盐的种类或或更换结合能力较弱的疏水介质在洗脱液中加入添加剂（少量去污剂或者低浓度有机试剂）(4) 层析缓冲液及温度确保疏水层析时的温度适宜，且选择合适的缓冲液。
介质讲义
1.疏水层析填料（HIC）2.离子交换填料（IEC）3.凝胶过滤填料（GFC）疏水层析填料1.生物分子表面大都含或强或弱的疏水区域，在不同环境下，与各种疏水介质产生不同强弱和结合。
2.高离子强度可加强疏水性，和离子交换刚刚相反，高盐吸附，低盐洗脱。
经洗脱的样品又可直接或稍加稀释后上其它层析柱，作为连接下游层析步骤的桥梁，并可完全取代传统的盐析沉淀技术，更符合工业生产要求。
3.比反相介质的配体密度低很多，无需有机溶剂洗脱，保存生物活性。
配体种类繁多，提供宽广的选择性。
Butyl-S Sepharose 6FF(乙肝疫苗纯化使用的疏水介质)1.亲水性的交联6%琼脂糖基质和丁基配体2.疏水性最弱的疏水填料3.颗粒大小－45-165µm4.pH稳定性，工作－3~13; 清洗－2~145.最快流速－600cm/h6.耐压－0.3Mpa化学稳定性可用：1mM HCl 70%乙醇 30%异丙醇 50%乙烯 8M尿素 6M盐酸胍 1M NaOH在位清洗（CIP）建议：推荐5-10次层析循环做一次CIP(生产上每批都进行CIP,为了更好的控制内毒素) 如果杂质成分不明可以采用下列方法：在位清洗（CIP）1.去除脂质和更强疏水性蛋白A.70%乙醇或30%异丙醇 4CV-10CV用梯度反洗以防止由于使用高浓度有机溶液而产生气泡。
B.用表面活性剂或酸溶液洗柱2CV，例如：0.1-0.5%非离子表面活性剂+1M醋酸 ,40cm/h反洗，再用70%乙醇洗5CV，洗去表面活性剂,3-4CV WFI（生产未使用）在位清洗（CIP）2.去除其它杂质0.5-1M NaOH 反向清洗4CV，流速40cm/h WFI清洗2-3CV.如果还是清洗不充分可将柱子静置在0.5-1M NaOH 中过夜.（生产----0.5 M NaOH 反向清洗2CV 1h 流速40cm/h,之后WFI清洗10CV，此方法同时可以达到去除内毒素的目的，CIP后内毒素<0.25EU/ml）再生:为了保证介质有个良好的性能，在每次层析后都要清洗吸附在柱上的物质。
丁基疏水层析填料
丁基疏水层析填料丁基疏水层析填料是一种常用于分离和纯化化合物的填料材料。
它的主要特点是具有疏水性，能够与水相相互排斥，从而实现对溶液中目标化合物的选择性吸附和分离。
我们来了解一下丁基疏水层析填料的原理。
丁基疏水层析填料的疏水性是由丁基烷基链引入填料表面所实现的。
这种疏水性使得填料在水溶液中具有高度的亲疏水选择性，能够选择性地吸附目标化合物，并与其他化合物区分开来。
当溶液通过填料时，疏水性相似的化合物会通过填料较快，而疏水性不同的化合物则会被填料吸附，从而实现了目标化合物的分离纯化。
丁基疏水层析填料具有较大的比表面积和孔隙体积。
这使得填料具有较高的吸附容量和分离能力。
大的比表面积可以提供更多的吸附位点，从而增加了填料对目标化合物的吸附量。
而丰富的孔隙体积则可以提供更大的分子尺寸选择性，使得填料能够分离不同尺寸的化合物。
丁基疏水层析填料具有良好的化学和物理稳定性。
它能够在较宽的pH范围内稳定运行，适用于多种溶液体系。
同时，填料具有较好的耐压性和耐高温性，能够在高压和高温条件下进行层析操作，提高操作效率和分离效果。
丁基疏水层析填料的应用范围非常广泛。
它可以用于生物制药、制剂开发、天然产物分离和纯化等领域。
在生物制药中，丁基疏水层析填料常用于蛋白质纯化和寡核苷酸富集。
在制剂开发中，它可以用于药物配方的优化和药物杂质的去除。
在天然产物分离和纯化中，丁基疏水层析填料可以实现对天然产物中复杂混合物的高效分离和纯化。
丁基疏水层析填料作为一种常用的分离和纯化材料，在化学和生物制药领域发挥着重要作用。
它通过利用疏水性和孔隙结构的特点，实现对溶液中目标化合物的选择性吸附和分离，为研究和生产提供了一种有效的工具。
随着科学技术的不断进步和发展，丁基疏水层析填料将在更多领域展现其独特的优势和应用前景。
第09章疏水层析高等教学
高级教育
29
添加剂可以用来改善选择性和分辨率。 例如，样品和疏水相互作用层析填料结合太紧 时。然而，如果在高浓度使用，就有使目的蛋 白失活或/和变性的可能。添加剂可以通过促 进蛋白溶解性，改变蛋白构象，促进结合着的 蛋白的洗脱来影响分离。水溶性醇、去垢剂等 是疏水相互作用层析中最广泛使用的添加剂。
高级教育
34
Washing out unbound material
1. Equilibration 2. Sample application
3. Washing
4. Elution
Non-bound proteins
Abs
Conc. salt
高级教育
35
Elution
1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing
高级教育
5
就球形蛋白质的结构而言，
其分子中的疏水性残基数是从
外向内逐步增加的。
虽然疏水氨基酸大多被包
埋在球形蛋白内部，有些则暴
露在外，在蛋白质表面形成疏 水区域，这部分暴露在外疏水 性基团称为疏水补丁。
疏水和亲水部件表面的溶菌酶。
最疏水部分是深红色,浅红色的更少的 疏水性。最亲水部分显示在深蓝色的, 更少的亲水部分是浅蓝色。
高级教育
28
三、缓冲液
▪ 对于疏水相互作用，选择缓冲液离子并不致 关重要。最经常使用磷酸缓冲液。
▪ pH 的选择必须和蛋白稳定性和活力兼容。 ▪ 然而，在疏水相互作用层析过程中，pH5-8.5
对于最终的选择性和分辨率的影响都非常小。
▪ pH的增加减弱疏水相互作用，在pH高于8.5或 低于5的时候，蛋白的存留会更加显著的改变。
不同层析填料结构及性能汇总
不同层析填料结构及性能汇总层析填料是一种用于石油化工行业的物理分离工艺。
其主要作用是利用填料的结构和性能特点来实现不同组分在塔内的分离。
下面将对常见的几种层析填料进行结构和性能的汇总。
1.环状填料：环状填料是一种常见的层析填料结构，通常由环状或弧形的塑料材料制成。
环状填料的优点是具有大的表面积和较好的液体分布性，有利于液体和气体之间的传质和传质。
然而，由于环形填料的数量较少，因此压降较大，不能用于高流速条件下的分离。
2.正交填料：正交填料是一种具有交叉口的多边形填料，通常由塑料材料制成。
正交填料的优点是具有较大的表面积和较好的气液分布性能，能够在较低的压降下实现高效的分离效果。
同时，正交填料的结构稳定，不易变形，适用于各种工艺条件。
3.球状填料：球状填料是一种常见的层析填料，通常由金属材料或陶瓷材料制成。
球状填料的优点是具有较大的表面积和较好的液体分布性，有利于液体和气体之间的传质和传质。
由于球状填料的结构紧密，因此其分离效果较好。
然而，球状填料的压降较大，不能用于高流速条件下的分离。
4.泡沫填料：泡沫填料是一种高孔隙率的填料，通常由塑料材料制成。
泡沫填料的优点是具有较大的表面积和较好的气液分布性能，能够在较低的压降下实现高效的分离效果。
同时，泡沫填料具有较好的吸附性能，能够有效去除气体中的杂质。
然而，由于泡沫填料的孔隙率较高，因此其结构不稳定，容易发生塌陷。
5.网状填料：网状填料是一种具有大孔隙率的填料，通常由金属丝制成。
网状填料的优点是具有较大的表面积和较好的气液分布性能，能够在较低的压降下实现高效的分离效果。
同时，网状填料具有较好的机械强度和耐腐蚀性能，适用于各种工艺条件。
综上所述，不同层析填料具有各自的结构和性能特点，适用于不同的工艺条件和分离要求。
选择适合的填料结构和性能是实现高效分离的关键。
在实际应用中，需要综合考虑填料的材料、几何结构、表面积、孔隙率、压降和耐腐蚀性能等因素，以选择最适合的填料。
疏水层析
生物大分子的分离与表征第1章、疏水层析 第2章、反相层析 第3章、色谱聚焦层析 第4章、高效液相色谱 第5章、重组蛋白的分离与分析 第6章、抗体纯化技术A)疏水层析（HIC）亦称为疏水作用层析 ，是利用固定相载体上偶联的疏水性配基 与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结 合而进行分离的层析技术。
从作用机制来看，它属于吸附层析。
非极性化合物例如苯、环己烷在水中的溶解度非常 小，与水混合时会形成互不相溶的两相，即非极性分子 有离开水相进入非极性相的趋势，即所谓的疏水性 (Hydrophobicity)。
非极性溶质与水溶剂的相互作用则称为疏水效应 (Hydrophobic effect) 。
疏水作用(hydrophobic interaction):非极性分子进入水中，有 聚集在一起形成最小疏水 面积的趋势，保持这些非 极性分子聚集在一起的作 用则称为疏水作用。
对于可溶蛋白，溶剂是水，疏水侧链因此被包 埋在蛋白质内部。
最终的结构是最适合周围溶液的 热动力学折衷的结果。
就球形蛋白质的结构而言，其分子中的疏水性残基数是从外向内逐步增加的。
虽然疏水氨基酸大多被包埋在球形蛋白内部，有些则暴露在外，在蛋白质表面形成疏 水区域，这部分暴露在外疏水 性基团称为疏水补丁。
疏水和亲水部件表面的溶菌 酶。
最疏水部分是深红色,浅红色 的更少的疏水性。
最亲水部 分显示在深蓝色的,更少的亲 水部分是浅蓝色。
1.2、疏水层析原理A)B)高度规则的水壳层包围在配基和蛋白的疏水表面周围。
疏水物质被迫融合以减少这种壳的总面积（熵最大）。
在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白 之间或蛋白自身的相互作用。
盐能够增强疏水作用。
亲水性强的蛋白质与疏水性固定相结合作用原理◦ 靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobic patch)；◦ 令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴露 出掩藏于分子内的疏水性残基；◦ 高盐作用。
疏水层析的特性所致，即在高盐浓度 下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性 固定相作用。
层析填料的选择及其装柱技术介绍幻灯片
理想的基质应符合下面的要求： 1．极低的非特异性吸附。 2．高度的亲水性。 3．较好的理化稳定性。 4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合。 5．适当的多孔性。
一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联 葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。
常用亲和吸附剂采用的基质
反相层析填料的选择原则
考虑样品组分的种类和性质、分离的规模及对分辨率 的要求、流动相条件：
待分离物分子量，对介质孔径的选择提供指导； 样品组分的疏水性质决定采用何种配基； 分离的规模及对分辨率的要求也是须考虑的因素，通
常分离规模和分辨率的关系是负相关的 ； 反相层析时的流动相条件很大程度上影响反相介质基
层析填料的选择 及装柱技术介绍
佳辰公司生物中心 陈阶
2012-04-18
如何选择填料？
一、依据所纯化的对象的各物理和化学特性。
（一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、 核酸等）
二、纯化所要达到的目的（粗提？中度纯化？ 精细纯化？）。
三、所要选择的层析方法
1. 凝胶过滤 ( Gf)
易脱落。 4) 配体自身应具有较好的稳定性。
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为 两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体 （general ligand）
亲和吸附介质的配基
（1）酶的抑制剂 （2）抗体 （3）A蛋白 A蛋白（protein A）为分子量约42KD的蛋白质，
Sephadex LH-20 同时具备亲水和亲脂双重性质， 且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作 用。
Pharmadex LH-20同时适用于分子类别非常相似 的物质的分离和工业规模的制备，既可用于初 步纯化步骤，也可用于最终精制步骤，如非对 映同分异构体的分离。
疏水层析标准操作规程
疏水层析标准操作规程疏水层析是一种常用的色谱技术，在分析实验室和工业生产上得到广泛应用。
为了确保疏水层析实验的准确性和可重复性，制定一份标准操作规程是非常重要的。
下面是一份疏水层析标准操作规程的范例，供参考：1. 实验仪器和试剂准备a. 确保疏水层析仪器处于正常工作状态，如：泵、检测器、进样器等。
b. 准备好所需的疏水层析柱，并按照设备要求进行装填和平衡。
c. 检查所需的试剂和溶剂，并确保其纯度和足够的储备量。
2. 样品准备a. 准备样品溶液，并确保其浓度和体积满足层析条件。
b. 如有需要，对样品进行预处理，如：过滤、稀释等。
3. 层析条件设置a. 根据实验目的选择合适的层析模式，如：梯度洗脱、等温洗脱等。
b. 设置合适的流速和流程控制参数，如：流速、柱温、洗脱梯度等。
4. 进样和分析a. 进样前，确保进样器和进样管道的清洁，并采取适当的方法进行样品进样。
b. 监测并记录层析进程中的关键参数，如：流量、波长、保留时间等。
c. 根据实验目的和样品特性，选择合适的检测方法和条件，如：紫外检测器、荧光检测器等。
5. 数据处理和结果分析a. 根据标准操作规程的要求，对实验数据进行处理和分析。
b. 记录实验结果和关键数据，如：峰面积、保留时间、峰高等。
c. 如有需要，进行数据统计和结果验证，如：重复实验、平均值计算等。
6. 清洗和维护a. 实验结束后，对层析柱和仪器进行及时的清洗和维护。
b. 根据实验室和生产要求，定期维护和校准仪器，确保其正常工作。
7. 安全注意事项a. 遵守实验室和工作场所的安全规定，佩戴适当的个人防护装备。
b. 注意有害物质的操作和处理方法，如：有机溶剂、毒性试剂等。
通过制定和遵守疏水层析的标准操作规程，可以确保实验的准确性和结果的可靠性，提高实验效率和数据分析的可重复性。
同时，规范操作也有助于确保人员的健康安全和实验室环境的保护。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2008-6 Volume 8
疏水层析填料
疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。
一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。
影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。
疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。
Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：Cellfine TM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。
结构见下图：填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。
通常，Cellfine TM Octyl对疏水性蛋白的吸附性会强于Cellfine TM Butyl对疏水性蛋白的吸附。
然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。
Cellfine TM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。
在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。
三种疏水层析填料的疏水性差异（左图）
色谱柱：8.2 x 150 mm
柱体积：8 ml
流动相：2.0 – 0.0M
Ammonium Sulfate
in 0.01M phosphate, pH
7.0
流速：1.32 ml/min
样品：5 mg/3 ml– 100 μl
2008-6 Volume 8
Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱）
Asahipak NH2P色谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。
Asahipak NH2P色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。
与硅胶基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，Asahipak NH2P可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。
聚合物基材氨基柱与硅胶基材氨
基柱的柱寿命比较
左图为Asahipak NH2P色谱
柱与硅胶基材氨基柱的寿命对
比试验。
结果显示：随着使用时
间的延长，硅胶基材氨基柱对单
糖、二糖的保留快速下降，其原
因应是硅胶基材氨基柱的氨基
降解所致。
色谱柱：Asahipak NH2P-50 4E,
其它公司的氨基柱
(4.6mmID*250mm)
流动相：CH3CN/H2O=75/25
流速：1.0mL/min
检测器：Shodex RI
柱温：30度
Asahipak NH2P色谱柱可在正相模式下分离糖类物质，糖类
物质按照分子量由小到大的顺序依次被洗脱。
增加洗脱液中有
机溶剂的比例可以延迟糖类的洗脱时间。
Asahipak NH2P色谱柱
可以在碱性，室温条件下分离单糖、二糖和糖醇混合物。
右图
为Asahipak NH2P色谱柱分离单糖、二糖及三糖混合物的应用
实例。
单糖、二糖及三糖混合物的分离
色谱柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4.6mmID*250mm)
流动相：H2O/CH3CN=25/75
流速：1.0mL/min
检测器：Shodex RI
柱温：30度
2008-6 Volume 8
学习园地
导致色谱柱柱压升高的原因及解决方案
第一阶段：确认是柱子导致的压力上升，还是HPLC系统导致的压力上升。
由于HPLC系统有很多环节，如泵、管路等，都容易吸附和积聚杂质，这些因素均会导致压力上升，所以，应先对HPLC系统进性排查。
排查方法：取下色谱柱，仅用管路连接并正常输送流动相时记录系统压力。
如果此时HPLC系统压力正常，则考虑是柱压升高。
第二阶段：确定是否使用了保护柱（预柱）。
一般在测定容易堵塞色谱柱的样品时，应该使用保护柱。
如果使用了保护柱，那么压力的升高就有可能是保护柱的柱压升高导致的。
排查方法：取下色谱柱，仅以保护柱连接管路并正常输送流动相测试柱压，再反过来取下保护柱仅以色谱柱连接管路正常输送流动相测试柱压，如果仅当连接保护柱时柱压高的话，则为保护柱引起的柱压升高，请清洗、或更换保护柱。
第三阶段：如果不是上述第一、第二点原因造成压力升高，就可以确认是色谱柱的原因了。
如果柱压是随着使用时间的延长，慢慢上升，这属于正常现象，是色谱柱达到使用寿命了，只能更换色谱柱了。
如果柱压是在实验开始时，实施中或经过一次、几次实验后，突然上升，则要结合实验情况考虑原因解决方案
色谱柱
柱长色谱柱越长，柱压越高。
可根据实验情况适当减小柱长。
柱内径柱内径越小，柱压越高。
可选择大内径色谱柱。
填料基质的形态填料的形态也会对柱压有影响。
硅胶基质的形态可以分为无定形和球形两种，现在一般装柱使用球形硅胶。
常规的色谱柱清洗方法（正向冲洗）
使用比目前使用的流动相对样品溶解能力更强的试剂清洗色谱柱。
如果您使用的流动相是乙腈：水（70:30），请使用更高浓度的乙腈水溶液进行清洗，比如乙腈：水（80:20）或乙腈：水（90:10）。
但是，如果高浓度的乙腈水溶液导致样品溶解困难的话，请停止使用上述流动相，转而使用对样品易溶的流动相。
如果该方法仍不见效，请试用下述方法。
色谱柱清洗方法（反向冲洗）
将色谱柱反向连接（即与色谱柱上箭头标识相反的方向使流动相由出口处流入、入口处流出）输送流动相试试。
此时，如果柱压太高会对色谱柱造成损坏，所以请将流速调至平时操作时的一半。
但是，如果使用相同的流速，反洗比正向清洗柱压还低的话，可能会发生色谱柱入口处的填料在筛板处聚集，那么就使用原有流速进行反洗。
反洗流动相的选择与上述正向冲洗相同，请选用比平时使用的流动相溶解性更强的、更易溶解样品的流动相。
注意，反洗时请断开检测器的管路连接，以避免污染检测器。
反洗色谱柱容易对色谱柱造成伤害，不到万不得已不要轻易使用。
本期的内容就先介绍到这里，欢迎大家各抒己见，希望以上内容能对大家的学习工作有所帮助。