04第五章__疏水层析

上阴离子DEAE-Sephadex A50层析柱(pH8.0)（离子交换 层析）， 用 梯 度 缓 冲 液 ( 1 0 mmol／Ltris-HCl，pH8.0-0.2mol／L NaCl1mmol／L EDTA-1mmol／Lα- 巯 基 乙 醇 ， 盐 浓 度 变 化 范 围 为 0.2~0.7mol／L NaCl)洗脱，
的)。
一般在lmol／L (NH4)2SO4 或 2mol／L NaCl 高浓度盐 溶液中，亲水性较强的组分物质，会发生局部可逆性 溶液 可逆性 变性，并能被迫与疏水的固定相结合在一起， 变性 然后通过降低 降低流动相的离子强度 离子强度，即可将结合于固定 降低 离子强度 相的物质，按其结合能力大小，依次进行解吸附 进行解吸附。 进行解吸附
(如上所述，加1mol／L(NH2)2SO4 或2mol／LNaCl，以使样品中的 有效成分变性，并能与固定相很好地相互吸附。)
把此样品溶液徐徐加入固定相(使有效成分与固定相之 间作用0.5-1h)后，先用平衡缓冲液洗涤，再用降低盐 浓度的平衡缓冲溶液洗脱， 与此同时，要用部分收集器分段收集洗脱下来的溶液， 并对收集的每部分溶液进行检测。 固定相进行再生处理后可重复使用。
3．装柱 将选定的亲水性吸附剂如苯基-Sepharose C1-4B悬浮于 乙醇溶液中，浸泡一段时间； 采用离心(或过滤)方法，弃上清液，收集沉淀物； 并以50％(m／V)浓度悬浮于样品缓冲液中； 尔后，按常规方法装入层析柱，经洗涤、Hale Waihona Puke Baidu衡完毕， 即可加样。
二、加样与洗脱
加样前，在样品溶液中要补加适量的盐类。
第四章 疏水层析
疏水层析亦称疏水作用层析(hydrophobic interaction chromatography，HIC) 从分离纯化生命物质的机制来看，它也属于吸 吸 附层析一类。 附层析 疏水层析和反相层析(reversed phase chromatography)分离 生命物质的依据是一致的，即: 视有效成分和固定相之间相互作用的疏水力 疏水力差 疏水力 异性大小，将有效成分分离出来。
第二节 操作与应用
一、层析柱的制备 1．层析柱规格 所使用层析柱之规格与普通层析的相似 2．固定相 在进行常压疏水层析时，大多数是选用苯基(或辛基)Sepharose Cl-4B吸附剂作固定相。 苯基-Sepharose Cl-4B适合于分离纯化与芳香族化合物 具有亲和力的物质。 辛基-SepharoseCl-4B则适用于分离纯化亲脂性较强的 物质。
二、吸附剂
固定相 由基质 配体 基质和配体 基质 配体(疏水性基团)两部分构成。 配体对疏水性 疏水性物质具有一定的吸附力 吸附力。 疏水性 吸附力 基质则有亲水性和非亲水性之分。 亲水性基质与（吸附疏水性物质的）配体构成 的固定相，称亲水性吸附剂。 疏水性基质与（吸附疏水性物质的）配体构成 的固定相，称疏水性吸附剂。
疏水层析 (所用基质的性能与反相层析不同)： 与基质结合的配体密度小，疏水性弱，对蛋白 蛋白 质及其复合物仅产生温和的吸附作用，吸附物 容易被解析下来。 故，较适合分离纯化盐析后或高盐洗脱下来的 物质。 这不仅使有效成分的纯度得到提高，而且还保 持了其原来的结构和生物活性。
第一节 基本原理
一、疏水作用 就球形蛋白质的结构而言，其分子中的疏水性 残基数是从外向内逐步增加的。 一般球形蛋白和膜蛋白的结构均较稳定，在很 大程度上是取决于分子中的疏水性作用。
三、应用实例
1．纯化鸡胗钙调蛋白
取新鲜鸡胗(除去结缔组织)切成1cm3小块， 置组织捣碎机中，加2倍于固形物体积的缓冲液(50mmol／L TrisHCl，pH8.0，2mmol／L EDTA，1mmol／Lα-巯基乙醇)高速匀浆三 次(30s／次)， 离心(8000 r／min，4℃，0.5h)收集鸡胗钙调蛋白抽提液(沉淀重 复抽提一次)，合并抽提液， 加硫酸铵盐析(pH8.0，60％饱和度)，除去大量杂蛋白， 上清液采用等电点沉淀(用H2S04调pH=4.0)，离心收集含有效成分 的沉淀物， 加蒸馏水悬浮，用三羟甲基氨基甲烷(Tris)调pH=7.5～8.0，令其 缓慢溶解， 经透析，离心得到溶液
反相层析： 与基质结合的配体密度大 疏水性强 密度大，疏水性强 密度大 疏水性强，对蛋白 质类物质具有较大的吸附力； 欲将吸附物解析下来，须用含有机溶剂 机溶剂的流动 机溶剂 相(降低极性)洗脱，方可见效。 洗脱液的极性 极性降低，常常会引起大分子活性物 极性 质变性， 因此反相层析一般较适合分离纯化小分子质量 的肽类 辅基 肽类和辅基 肽类 辅基等物质。
通过分部收集和活性测定，合并有效成分溶液进行疏水 层析。 此层析用的固定相为苯基-Sepharose CL-4B，用其纯 化钙调蛋白的流程见图4-1。
CaCl2
1．亲水性吸附剂 基质主要是： 交联琼脂糖(Sepharose CL-4B) 配体是： 苯基或辛基化合物 基质与配体通过耦合方法构成稳定的 苯基(或辛基)-Sepharose Cl-4B吸附剂
2．非亲水性吸附剂 基质有： 硅胶、树脂(苯乙烯、二乙烯聚合物)等 配体为：苯基、辛基、烷基(C4、C8、C18)等。 二者通过共价结合构成非亲水性吸附剂。
亲水性强的蛋白质 蛋白质与疏水性固定相结合作用原理 固定相结合作用原理 蛋白质 固定相 一是:靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobic patch)； 二是:令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴露 出掩藏于分子内的疏水性残基； 三是:高盐作用。疏水层析的特性所致，即在高盐浓度 高 下，暴露于分子表面的疏水性残基 疏水性残基 疏水性固定 疏水性残基才能与疏水性固定 疏水性 相作用(这与普通吸附层析和离子交换层析的操作是绝然不同
也就是：疏水作用弱(即亲水性强)的物质，用 高浓度盐溶液洗脱时，会先被洗下来。 当盐溶液浓度降低时，疏水作用强的 物质才会随后被洗下来。 （相同盐浓度下，疏水作用弱的物质先被洗下来
疏水作用强的物质随后被洗下来）
对于疏水性很强 疏水性很强的物质，则需要在流动相添加适 疏水性很强 降低极性才能达到解吸附的目的。 量有机溶剂降低极性 降低极性