针刺对川芎嗪防治豚鼠庆大霉素中毒性耳聋靶向作用的影响

针刺对川芎嗪防治豚鼠庆大霉素中毒性耳聋靶向作用的影响近年来，随着各领域靶向性治疗的研究，耳蜗靶向性研究逐渐兴起，运用传统的中医药治疗手段，结合现代靶向治疗方法有望成为中医耳聋研究领域的突破点之一。

有研究[1]表明，针刺特定穴位能够增加药物靶向吸收的效果，达到更好的治疗作用。

川芎嗪是中药川芎的有效成分，它能够通过血-迷路屏障进入耳蜗外淋巴液，直接作用于耳蜗和听神经，从而发挥作用。

本实验采用庆大霉素耳聋豚鼠模型，应用听觉电生理、免疫组织化学方法等多种技术，观察针刺对川芎嗪耳蜗靶向性治疗作用的影响。

1 材料与方法1.1 实验动物分组与方法健康活泼、无耳疾、耳郭反射灵敏的白毛红目豚鼠48只，体重240～300 g，雌雄各半，浙江中医药大学动物研究中心提供[许可证号SCXK(浙)2005-0021]，随机分为正常对照组(A组)、模型对照组(B组)、川芎嗪组(C组)、针刺组(D组)、针刺加川芎嗪组(E组)，除A组样本数为8只，其余4组每组均为10只。

D组和E组：每日腹腔注射庆大霉素(批号：06012122)100mg/kg，针刺动物处于清醒状态,用固定装置(自制)固定，针刺穴位参照文献报道及实验动物解剖学与人体穴位相应部位[2]，取双侧“听宫” “翳风” “外关”穴，用G 6805型电针治疗仪刺激，疏密波，频率4/20 Hz，强度1~2mA，强度以针刺部位颤动、动物能忍受为宜，每日1次，持续刺激20min；E组针刺完毕立即灌服川芎嗪(盐酸川芎嗪批号：050101)，每日200mg/kg。

B组和C组：每日腹腔注射庆大霉素100mg/kg，C组腹腔注射后，立即灌服与E组等量的川芎嗪。

A 组：腹腔注射与B组等量的生理盐水。

各组动物皆连续干预及观察10 d。

观察期间，混合饲养，每日测量体重调整药量。

1.2 听性脑干反应(ABR)阈值测试用1%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔麻醉后，在隔音的电屏蔽室内采用NGT-Ⅱ型脑干诱发电位仪进行ABR测试。

记录电极置颅顶正中，参考电极及接地电极分别置于给声耳及对侧耳后皮下。

带通滤波为100~3000 Hz的短声刺激，叠加512次，扫描时程10ms，TDH-39型耳机输出，重复率10次/秒，距离豚鼠耳道口0.5 cm，以Ⅲ波为基准确定反应阈。

分别在实验前、处死前进行ABR测试。

1.3 标本固定停药后第2 d，待测试完ABR后，用1%戊巴比妥钠按30mg/kg腹腔注射麻醉后，迅速断头，取出听泡，在解剖显微镜下刺破前庭窗及蜗窗，右侧蜗尖钻孔，灌注10%中性缓冲福尔马林(pH 7.4)后浸入该溶液24 h。

1.4 细胞凋亡及免疫组化检测常规包埋石蜡切片,厚4 μm，平行蜗轴5 μm连续切片，按原位切口末端标记[terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP nick end labeling, TUNEL]及Bax/Bcl-2染色试剂盒步骤操作。

使用HPIAS-1000病理图文分析系统(中国武汉同济千屏影像工程公司)对凋亡和免疫组化Bax(一种促凋亡蛋白)及Bcl-2(一种抗凋亡蛋白)的表达采用半定量检测分析，即对每张切片采集Corti器部位(×200倍)的免疫反应阳性细胞的平均光密度，得出积分光密度值(IOD)。

1.5 统计分析计量资料用均数±标准差(x±s)表示，用SPSS 10.0软件统计包对各组数据进行统计分析。

实验前后采用t检验，多组间均数比较用方差分析。

2 结果2.1 ABR阈值检测各组ABR结果如表1所示。

各组实验前阈值比较差异无显著意义(P>0.05)；给药10 d后，模型对照组ABR阈值明显高于正常对照组，川芎嗪组、针刺组和针刺加川芎嗪组平均阈值虽然在治疗干预后有所增高，但较模型对照组明显降低(P<0.05)，以针刺加川芎嗪组最明显(P<0.01)。

表1 各组豚鼠实验前后ABR波Ⅲ反应阈值比较(x±s，dB SPL)2．2 细胞凋亡及凋亡相关基因Bcl-2及Bax 的表达(见表2)TUNEL染色阳性细胞核呈黄色或棕色，细胞核呈蓝色为阴性。

模型组可见大量TUNEL染色阳性细胞(见图1)，IOD值明显高于正常组(P<0.01)，正常组Corti器未见阳性细胞(见图2)，针刺组、川芎嗪组IOD值明显低于模型组(P<0.01)，但仍高于正常组(P<0.05)，针刺加川芎嗪组IOD值与正常组比较差异无显著性意义(见图3)。

Bax蛋白免疫组织化学染色阳性细胞呈棕黄色。

模型组Bax蛋白表达强阳性(见图4)，IOD值明显高于正常组(P<0.01)，正常组仅见少量Bax蛋白表达(见图5)；针刺组、川芎嗪组及针刺加川芎嗪组Bax蛋白表达IOD值明显低于模型组(P<0.01)，其中针刺加川芎嗪组Bax蛋白表达较少(见图6)。

Bcl-2蛋白免疫组织化学染色阳性细胞呈棕黄色，深浅不均。

模型组Bcl-2蛋白表达IOD值明显低于正常组(P<0.01)，也低于针刺加川芎嗪组(P<0.05)。

模型组Bax/Bcl-2 IOD 比值较正常组明显增大(P<0.01)，且高于川芎嗪组及针刺加川芎嗪组(P<0.05)。

以上结果提示3种手段均可以不同程度拮抗庆大霉素对耳蜗毛细胞凋亡，影响Bax 及Bcl-2蛋白的表达，以针刺加川芎嗪组最为显著，二者具有协同增效作用。

3 讨论3．1 针刺加川芎嗪对庆大霉素(GM)的防治效果ABR阈值的升高与内耳细胞结构受损有关。

本实验研究结果提示针刺加川芎嗪能够在一定程度上减轻GM对内耳结构的损伤，改善听功能，针刺特定穴位能明显增强川芎嗪对GM的拮抗作用。

研究表明，GM可通过细胞凋亡方式引起毛细胞死亡。

细胞凋亡TUNEL原位标记染色结果显示，各治疗组染色阳性细胞均有减少，与模型组相比，针刺加川芎嗪组作用更佳，差异有非常显著性意义(P<0.01)，也明显优于针刺组和川芎嗪组。

提示针刺、川芎嗪、针刺加川芎嗪均能够减轻GM损伤后豚鼠耳蜗Corti 器部位的细胞凋亡，针刺可能加强川芎嗪抗GM致耳蜗毛细胞凋亡的作用，从而有效地减缓GM对内耳的损伤，保护听功能。

Bcl-2即B细胞淋巴瘤/白血病基因2(B-cell lymphoma/leukermia 2)，Bax基因与Bcl-2约有21%的氨基酸序列同源，故称Bax为Bcl-2家族成员。

Krajewski S等[3]提出Bcl-2基因促进细胞生存，Bax基因促进细胞凋亡，Bcl-2/Bax比值决定细胞的存活与死亡，比值高，细胞生存率高，比值低，细胞凋亡率高。

Bax及Bcl-2免疫组化结果显示，GM能上调Bax蛋白表达，抑制Bcl-2的表达，而针刺、川芎嗪、针刺加川芎嗪调整凋亡相关基因Bax及Bcl-2的表达，降低Bax/Bcl-2的比值，以针刺加川芎嗪组对Cortic器部位Bax蛋白表达的效果最明显。

这表明，GM损伤后，Bcl-2蛋白家族参与了庆大霉素诱导的内耳损伤，而针刺加川芎嗪可能主要通过下调Bax的表达，降低Bax/Bcl-2，在一定程度上拮抗GM的耳毒性，其效果显著优于单独使用针刺及川芎嗪。

3．2 针刺促进药物靶向性疗效的可能机制耳与经络关系十分密切，《灵枢·口问》曰：“耳者宗脉之所聚也”。

内耳疾病多由局部经脉郁闭，气血运行不畅，耳失濡养所致。

针刺手太阳经穴之听宫、手少阳三焦经之翳风、外关穴，可激发经气，疏通耳部经络，增强耳脉气血的运行，平衡阴阳,调整内耳功能；针灸借助经络由表达里，通调阴阳，调和气血，药物藉脏腑由里达表，使经络疏通而奏效。

经络的结构体系是药物信息传递的主要途径[4]，其中，腧穴是脏腑经络之气输注聚集于体表的部位。

腧穴部位处分布有大量的神经干、支，血管、游离神经末梢等。

穴位是内脏病理生理状态在体表的机能感应点。

针刺作用于穴的信息可能通过经络结构体系、细胞连接通讯传递到特定的效应靶器官。

中药川芎归少阳经脉，听宫为手足少阳、手太阳之交会穴；翳风为手少阳三焦经之腧穴，又为手足少阳经之交会穴；外关为手少阳三焦经之络穴，具有和解少阳、清降三焦之火、清宣少阳经经气的作用。

可以推论，通过针刺听宫、翳风及外关穴，可能增加川芎嗪对少阳经的亲和力，使川芎嗪更多地分布于靶器官部位。

现代医学研究[5]表明，经络的循行与神经、血管、淋巴管的循行分布基本一致，与人体应激系统也有密切关系。

针刺作用于人体特定经络，能够促进血液运行，改善人体的新陈代谢，对脏腑组织器官、血液等有特异性调理作用。

内耳微循环直接受椎-基底动脉系统血流影响，还受植物神经及局部调控机制影响。

可以推论，针刺听宫、翳风、外关穴位，通过刺激耳部周围的神经、游离神经末梢，调节神经、内分泌、免疫网络系统，增加耳蜗的血流量，从而使趋向于多个脏器的药物具有针对性地、更多地进入耳蜗，使药物更大限度地发挥治疗作用。

有研究[6]表明，针刺刺激以各种能量传递的形式作用于体表的特定部位或穴位，产生一定的生物信息，通过信息传递系统，输入到相关的脏器，对失常的生物信息进行调整，从而起到对病变脏器功能的调节作用，同样也可使川芎嗪随生物信息的调整和加强而快速、大量、及时、准确地到达耳蜗，最大限度地发挥其治疗作用。

另外，根据受体理论[7]，针刺听宫、翳风及外关穴可特异性调整耳的功能，那么，也可能改变耳蜗部位相应受体的数量和质量，增强药物与耳蜗中受体结合，加强了药物的吸附与代谢，从而增强药物川芎嗪能够大量、准确地到达耳蜗。

总之，针刺加川芎嗪对内耳的保护作用明显强于单独使用针刺或单独服用川芎嗪治疗。

针刺听宫、翳风及外关穴对川芎嗪治疗内耳疾病有一定的靶向协同作用，能增强该药对GM所致感音神经性耳聋的治疗效果，这为临床上使用针刺特定穴位加强药物治疗耳聋这一手段提供了实验依据。

参考文献：[1] 成泽东,陈以国,张利泰,等.针刺对大鼠体内中药有效成分趋向性影响的实验研究[J].中国针灸,2002,22(1):51-53.[2] 李辞蓉,华兴邦,周浩良,等.豚鼠针灸穴位图谱的研制[J].上海针灸杂志,1992,11(2):28-30.[3] Krajewski S, Krajewskam, Shabaik A, et al.Immunohistochemical determination of in vivo distribution of Bax, a dominant inhibitor of Bcl-2 [J].Am J Pathol,1994, 145(6):1323-1336.[4] 邓亲恺.经络实质辨析——关于经络本质与生物学基础的研究[J].中国医学物理学杂志,2004,21(2):63-72.[5] 黄炳山.经络结构应是应激系统的主要组成部分[J].针灸临床杂志,2004,20(11):5-6.[6] 陈军德,李武.药物归穴现象与经络的作用机制[J].中国针灸,2002,22(10):667-669.[7] 丁荣施.略论中药归经和受体学说[J].广东医学,1986，7(5):28.。