流式细胞术在白血病中的应用医学PPT课件
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流式细胞术系列之-白血病免疫分型
• 幼稚细胞群体的FSC和SSC信号与M0相似，Blasts >90%。
CD13和/或CD33阳性 HLA-DR阳性 CD34阳性 CD11B，CD15等(+/-) >3%的幼稚细胞表达
MPO。
AML-M2（急性粒细胞白血病部分成熟型）
• 此类型白血病细胞除了占优势的幼稚细胞外还存在已 明显分化的细胞群体，至少已分化至早幼粒细胞或粒 细胞水平。
(immunology， I ) ( cytogenetics，C )
WHO分型(2001)
（MICM）
(morphology，M ) (immunology， I ) ( cytogenetics，C)
(molecular biology, M)
L1型
急淋
急
性
（ALL）
白
L2型 L3型
细 胞
M0: 微分化型髓系白血病；
标本来源
（1）外周血 （2）骨髓穿刺液， （3）骨髓活检标本 （4）淋巴组织穿刺
样本保存
要 求： •室温条件(16℃ -28℃ )存放； • 如非液态标本，则要在标本中加入足量的等渗液 体（如 生理盐水或组织培养液）。
保存时间
1. 肝素抗凝的外周血和骨髓标本，存放时限为48～72小时； 2. EDTA抗凝标本，存放时限只有12 ～ 24小时，因为髓细胞
胞内染色 CD3\CD79a\MPO
可以确定白血病分CD7
B系：CD10、CD19、CD20 表面染色 髓系：CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33
非系列特异的抗体：CD34、HLA-DR 泛白细胞标志：CD45
进一步 细分
其它 CD4、CD8、CD61、CD56、CD38 必要时可以加用
CD13和/或CD33阳性 HLA-DR阳性 CD34阳性 CD11B，CD15等(+/-) >3%的幼稚细胞表达
MPO。
AML-M2（急性粒细胞白血病部分成熟型）
• 此类型白血病细胞除了占优势的幼稚细胞外还存在已 明显分化的细胞群体，至少已分化至早幼粒细胞或粒 细胞水平。
(immunology， I ) ( cytogenetics，C )
WHO分型(2001)
（MICM）
(morphology，M ) (immunology， I ) ( cytogenetics，C)
(molecular biology, M)
L1型
急淋
急
性
（ALL）
白
L2型 L3型
细 胞
M0: 微分化型髓系白血病；
标本来源
（1）外周血 （2）骨髓穿刺液， （3）骨髓活检标本 （4）淋巴组织穿刺
样本保存
要 求： •室温条件(16℃ -28℃ )存放； • 如非液态标本，则要在标本中加入足量的等渗液 体（如 生理盐水或组织培养液）。
保存时间
1. 肝素抗凝的外周血和骨髓标本，存放时限为48～72小时； 2. EDTA抗凝标本，存放时限只有12 ～ 24小时，因为髓细胞
胞内染色 CD3\CD79a\MPO
可以确定白血病分CD7
B系：CD10、CD19、CD20 表面染色 髓系：CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33
非系列特异的抗体：CD34、HLA-DR 泛白细胞标志：CD45
进一步 细分
其它 CD4、CD8、CD61、CD56、CD38 必要时可以加用
白血病淋巴瘤免疫分型 ppt课件
白血病/淋巴瘤免疫分型
血液研究所 卫生部 血栓与止血重点实验室
ppt课件
1
流式细胞术的基本概念
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种 可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒 （通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对 特定群体加以分选
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人 工合成微球等
25
白血病免疫分型
• 根据白血病细胞表达的系列相关抗原， 确定其系列来源。如：淋系T/B、粒单系、 红系、巨核系等。
• 根据白血病细胞表达的系列分化其相关 抗原进一步分型。如：早前B，前B，普 通B…
ppt课件
26
EGIL，1998年白血病积分系统
• 分值
B系
T系
髓系
•2
CD79a
CD3
MPO
•
CD7+ and/orCD2+
CD19+
Myeloid Lineage
T-Lineage
B-Lineage
Myeloid, no or minimal
maturation
CD34+/CD117+/-
HLADR+
CD56+
CD15-/+ CD11b-, CD14-
Promyeloid
CD15+/CD117+/-
(cyt)CD22 TCRα/β
•
(cyt)IgM TCRγ/δ
•1
CD19
CD2
CD117
•
CD20
CD5
CD13
•
CD10
CD8
CD33
•
CD10
血液研究所 卫生部 血栓与止血重点实验室
ppt课件
1
流式细胞术的基本概念
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种 可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒 （通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对 特定群体加以分选
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人 工合成微球等
25
白血病免疫分型
• 根据白血病细胞表达的系列相关抗原， 确定其系列来源。如：淋系T/B、粒单系、 红系、巨核系等。
• 根据白血病细胞表达的系列分化其相关 抗原进一步分型。如：早前B，前B，普 通B…
ppt课件
26
EGIL，1998年白血病积分系统
• 分值
B系
T系
髓系
•2
CD79a
CD3
MPO
•
CD7+ and/orCD2+
CD19+
Myeloid Lineage
T-Lineage
B-Lineage
Myeloid, no or minimal
maturation
CD34+/CD117+/-
HLADR+
CD56+
CD15-/+ CD11b-, CD14-
Promyeloid
CD15+/CD117+/-
(cyt)CD22 TCRα/β
•
(cyt)IgM TCRγ/δ
•1
CD19
CD2
CD117
•
CD20
CD5
CD13
•
CD10
CD8
CD33
•
CD10
流式细胞分析在临床血液学中的应用
流式细胞分析在临床血液学中的应用
1.白血病诊断和监测：
白血病是由于骨髓内的恶性细胞大量增殖导致的一种血液系统疾病。
流式细胞术可以根据细胞大小、颜色和表面标记物的表达水平快速分析并鉴别异常细胞。
这对于白血病的早期诊断、分类和监测来说非常重要。
2.免疫功能评估：
流式细胞术可以评估患者的免疫功能。
通过将标记有特定抗体的细胞与患者的血液混合，可以测量细胞表面抗原的表达水平。
这有助于确定患者是否有免疫缺陷，以及免疫功能是否正在正常运行。
3.血液病的异常细胞鉴定：
流式细胞术可以鉴别和计数血液中的异常细胞。
例如，对于淋巴瘤等恶性疾病，流式细胞术可以检测和分类恶性细胞，以便进行早期诊断和个体化治疗。
4.红细胞和血小板计数：
流式细胞术可以用于快速准确地计数红细胞和血小板。
在患者需要进行输血或者有出血倾向的情况下，流式细胞术可以提供非常重要的信息。
5.免疫治疗监测：
流式细胞术可以用于监测免疫治疗的效果。
例如，在进行造血干细胞移植后，流式细胞术可以帮助监测移植后的免疫细胞比例和功能。
这对于治疗干细胞移植相关并发症和个体化治疗来说非常重要。
总之，流式细胞分析是一种在临床血液学中非常有用的技术，可以用于白血病诊断和监测、免疫功能评估、血液病的异常细胞鉴定、红细胞和血小板计数以及免疫治疗监测。
随着技术的发展，流式细胞分析的应用将进一步扩大，为临床血液学的诊断和治疗提供更多的帮助。
流式细胞术的临床应用ppt课件
实验诊断科 分子诊断组
数据分析
设门（gating）：
根据某些特性将分析细胞群
圈起来。
淋巴细胞：FSC/SSC CD45++/SSCdim T淋巴细胞：CD3+/SSCdim
实验诊断科 分子诊断组
数据分析
直方图
单参数分析
横坐标：信号强度
纵坐标：细胞数量
实验诊断科 分子诊断组
数据分析
散点图
双参数分析 横、纵坐标代表的均是信号强度 UL: cd3-cd4+ LL: cd3-cd4UR: cd3+cd4+ LR: cd3+cd4-
实验诊断科 分子诊断组
标本染色的一般方法
FCM的临床应用
已开展的临床项目 其他临床应用
实验诊断科 分子诊断组
标本染色的一般方法
标本来源：
外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脑脊 液、胸腹水、肺泡灌洗液(BALF)及其脱落细 胞。 血清和各类体液样本（可溶性蛋白）
实验诊断科 分子诊断组
前期处理
CSF、BALF、胸腹 水等：
结合淋巴细胞绝对数来看待百分比的改变
AIDS
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
HLA-B27
试剂：BD HLA-B27 Kit 标本：外周血 检测指标： T (CD3+)淋巴细胞上HLA-B27 定性检测
实验诊断科 分子诊断组
实验诊断科 分子诊断组
HLA-B27
临床意义：强直性脊柱炎（高度相关） 遗传性关节炎
数量的检测 采集时机的确定
某些肿瘤
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
白血病和淋巴瘤（L&L）免疫分型
流式细胞术在临床中应用
过敏性疾病（嗜酸性粒细胞炎症反应-哮喘）
√
妇科-流产 GVHD
慢性 急性
√ √
√
天然TREG细胞在免疫系统中的作用
平衡状态：
既可有效清除外来病原体， 又可避免过度的炎症反应。
缺乏调节性T细胞：
免疫反应过度，造成自身免疫病、 哮喘、过敏反应、移植排斥、流产等。
过多的调节性T细胞：
免疫反应低下，无法有效清除病 原体及肿瘤，造成感染及癌症。
CD45
SS/CD45
SS
R2 R3
R4
Fil e: Wang Yanqi ang 04.11.2.001
Regi on R1 R2 R3 R4
% Gated 100.00 6.33 86.99 1.74
APL
Thank you !
良性肿瘤
√
感染
寄生虫病（利什曼病、蠕虫病、丝虫病和血吸虫病
√
等）
真菌
√
病毒感染-丙肝
√
病毒感染-HIV
√
细菌感染-结核
√
细菌感染-麻风
√
自身免疫 克隆氏病、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、自身免疫 √
病
性甲状腺炎、多发性硬化
系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性淋巴细胞增殖综
√
合征(ALPS)、自身免疫性心脏病
临床意义： • 用于临床特发性血小板减少性紫癜（ITP）的
筛查与诊断
流式在强直性脊柱炎鉴别诊断中的应用
• 14、JY强直性脊柱炎相关抗原HLA-B27检测 标本类型：静脉血（2~3ml） 原理：HLA-B27是脊柱关节病病因及发病机制的
关键已经被广泛认同，各种假说均支持患者由 于存在HLA-B27的高表达引起了体内异常的免 疫应答，从而导致了脊柱关节病的发生。 临床意义： • 用于强直性脊柱炎的辅助诊断与鉴别诊断 • 用于临床强制性脊柱炎高危人群的筛查
《流式细胞技术》PPT课件
完整版ppt
34
CBA(Cytometric Bead Array)
完整版ppt
35
Traditional Analysis -- Percent positive
Po s i t i v e Ce l l
Ne g a ti v e Ce l l
CDX PE
TraditionalAnalysis— PercentPositives
43
3）DNA倍体：主要比较G0/G1期细胞DNA含量 的变化。用DNA指数（DI）表示。
DNA指数=测量样本G0/G1期DNA含量/正常人 淋巴细胞G0/G1期DNA含量
以正常人淋巴细胞作为对照。
正常细胞DNA指数为1.00，DNA指数＞1，为超 2倍体，＜1为亚2倍体，两者可统称为非整倍 体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体 肿瘤中出现频率较高。
完整版ppt
42
2）利用DNA的荧光染料，如PI （Propidium iodide碘化丙啶），与细胞 内的DNA结合，可反映细胞内DNA含量。 采用DNA直方图显示。具有2C DNA含量 细胞为G0/G1期细胞，4C DNA含量细胞 为G2/M期细胞，DNA含量介于两者之间 的细胞为S期细胞。
完整版ppt
完整版ppt
作者：笛风
1
基本概念
1、流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物 理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗 技术为一体的高科技细胞分析仪。
2、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞 仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参 数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分 析和分选（纯度可达99%以上）的技术。
140
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
29
四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
33
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
流式细胞术精品PPT课件
4
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
流式细胞仪结果分析课件PPT
何形成单个细胞流）
免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。
易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性
光束成形器：两十字交叉放置的透镜
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0. 乙醇或甲醇保存法（2周）
区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。 D3 CD4- /CD3-
• 多参数分析 免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入
二维等高图 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
流式细胞仪常检测的细胞特性 （二）免疫荧光染色的质控
假三维等高图 假三维等高图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 三、免疫胶乳颗粒技术的应用
• 三参数直方图 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。
同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单抗的信号保持其特异性。 流式细胞仪的基本结构：
• 双参数直方图:点图 光束成形器：两十字交叉放置的透镜
流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。
流式细胞术原理及临床应用-PPT文档
FCM检测白血病微小残留病变(MRD):
MRD 是 白 血 病 复 发 的 主 要 根 源 ， FCM 的 高 特 异性和敏感性可以在患者缓解期检测是否有残 留病变细胞，早期探测MRD，以免复发
FCM在临床肿瘤学中的应用
1.血液标本的检查 ● 肿瘤患者的免疫功能检查 ● 肿瘤患者的粘附分子检查：在肿瘤的浸润与转
细胞凋亡的生物学意义
胚胎形成、肌体正常发 育、衰老和损伤细胞的清 除以及肿瘤的发生、发展 和转归等都与细胞凋亡有 关。
生物医学的研究热点
FCM在血栓性疾与止血中应用
由于活化血小板是血栓的主要
成分之一，血小板活化程度的增 高与疾病的发生发展有关。 利用 流式细胞仪可检测血小板活化指 标，了解血小板状态和活化进程 。 巨血小板 血小板无力症 网织血 小板
肿瘤细胞耐药性
MDR是由多药耐药基因编码的P糖蛋白（P-gp） 亲脂化合物，包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性 排出泵。当淋巴细胞出现MDR阳性细胞时，患者对 化疗药物开始出现耐
细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序 的死亡。它涉及一系列基因的激活、表达以及调 控等的作用；是为更好地适应生存环境而主动争 取的一种死亡过程。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或 生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表 现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核 变化较慢，DNA 降解不充分，引起局部严重的 炎症反应
可用流式细胞仪分析的标本
外周血、骨髓、癌组织、癌旁组织、各种体液 （尿、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液等）
单细胞生物、特殊处理的植物细胞、某些非细胞 粒子、可溶性分子
流式细胞仪的基本功能
•细胞表型分析：包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份分析 •DNA含量及细胞周期分析、细胞凋亡检测 •目标细胞分选 •自身免疫性疾病相关HLA抗原分析、自身抗体的检测 •流式蛋白定量技术：血浆中各种细胞因子的含量
《流式细胞术的原理》PPT课件
补偿不好调。 4. 尽量选择应用广、亮度高的荧光素 5. — 荧光素的强弱用Stain Index染色指数来表示，
数值越大，信噪比越高。 6. 多色实验中，亮度高的荧光素搭配表达量低的目
标抗原 7. — 例如，PE， APC这类大分子蛋白相对亮度高。 8. 关注F/P比值
BD网站提供每一种荧
光素的激发以及发射光 谱
流式细胞仪的根本构造 以及原理
流式细胞仪的根本构造 以及工作原理
•虽然每款流式细胞仪有各自的特征性构造，但是其 内部构造根本组成一样。
•根本构造一共分三局部： •液流系统 •光学系统 •电子系统
液流系统
液流系统包括
•流动室 flow chamber
Injector
Tip Sheath
fluid
•液流驱动系统
Fluorescence signals
Focused laser beam
鞘液三大作用： 防止堵塞喷孔 约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度 保持细胞活性
液流系统
对灵敏度要求不是很苛刻的实验，可调高样本进样速率，从而 提高采样分析速度。
光学系统
主要由激发光源、光束成形及收集系统组成
数据显示
•二维点图 〔Dot Plot〕 •直方图〔Histogram〕 •等高线图 〔Contour Plot〕 •密度图 〔Density〕 •三维图〔3D Plot〕等·
流式细胞术操作流程
样本收集及 处理
制备单细胞 悬液
免疫荧光 染色
表型测定
统计学分 析
1.样本制备
样本来源
•血液 •骨髓 •淋巴结 •体液 〔尿液、脑脊液、胸腹腔积液〕 •灌洗液〔肺泡支气管〕 •加抗凝剂〔EDTA〕，室温保存，24h内
数值越大，信噪比越高。 6. 多色实验中，亮度高的荧光素搭配表达量低的目
标抗原 7. — 例如，PE， APC这类大分子蛋白相对亮度高。 8. 关注F/P比值
BD网站提供每一种荧
光素的激发以及发射光 谱
流式细胞仪的根本构造 以及原理
流式细胞仪的根本构造 以及工作原理
•虽然每款流式细胞仪有各自的特征性构造，但是其 内部构造根本组成一样。
•根本构造一共分三局部： •液流系统 •光学系统 •电子系统
液流系统
液流系统包括
•流动室 flow chamber
Injector
Tip Sheath
fluid
•液流驱动系统
Fluorescence signals
Focused laser beam
鞘液三大作用： 防止堵塞喷孔 约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度 保持细胞活性
液流系统
对灵敏度要求不是很苛刻的实验，可调高样本进样速率，从而 提高采样分析速度。
光学系统
主要由激发光源、光束成形及收集系统组成
数据显示
•二维点图 〔Dot Plot〕 •直方图〔Histogram〕 •等高线图 〔Contour Plot〕 •密度图 〔Density〕 •三维图〔3D Plot〕等·
流式细胞术操作流程
样本收集及 处理
制备单细胞 悬液
免疫荧光 染色
表型测定
统计学分 析
1.样本制备
样本来源
•血液 •骨髓 •淋巴结 •体液 〔尿液、脑脊液、胸腹腔积液〕 •灌洗液〔肺泡支气管〕 •加抗凝剂〔EDTA〕，室温保存，24h内
流式细胞术ppt课件
可区分高FL细胞与低FL细胞。 一般的流式细胞仪装有一个激光光源（488nm），可
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
流式细胞术在血液病中的应用
流式细胞术免疫分型在临床的应用
免疫分型已经是当代诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要 准之一，对形态学诊断起互补作用。 有助于研究白血病细胞的生物学行为。 有助于判断预后，系列专一性预后相对较好，交叉表达 、多系表达及裸细胞型预后差。
单克隆抗体的选择
❖ 白血病免疫分型时尽量选用系列特异性强的单抗作为一 线单抗，目前较为公认系列特异性单抗有T系的CD3、CD2； B系的CD79a、CD22、CD19和髓系的MPO、CD117、CD13等。 一般说来胞浆比胞膜的标志特异性强。用这些特异性强 的标志作为初筛，基本可确定T系、 B系或髓系，随后即 以二线单抗（CD14,CD36,CD41,CD34,CyIg,SmIg等）做进 一步的免疫分型，以确定最后亚型。
工作原理
: : :
基本工作原理
单 细 胞 流
单 细 胞 照
流
明
动 室
激 光
488 nm 激光单 细 来自 检 测 信 号488 nm 激光
处 理
激光
计算机分析
FALS Sensor
细胞分选原理
488 nm laser
- Charged Plates
FALS Sensor Fluorescence detector
T-ALL的免疫表型特点
T-ALL分类
Pro/Pre-T-ALL T-ALL
免疫标记 TdT+ 、CyCD3+ 、CD7+
CD2-、sCD3- 、CD1aCD2+、 sCD3+ 、 CD5+/- 、 CD8+/- 、CD4+/- 、 CD1a+/-
ALL和AML的免疫学鉴别
类别 TdT HLADR
流式细胞术及其临床应用课件(1)
光源与光学系统
➢ 激发光源 ➢ 光学系统
信号收集与光电转 换系统
计算机与分析系统
细胞分选与浓缩系统
激发光源 滤光片
流动室、鞘 液和样本流
信号检测器
计算机分析
（二）激光光源与光学系统
（一）激发光源 ：激光器
气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
（四）计算机和分析系统
十字门
线性门
流式细胞仪特点
流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微 粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的 协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
目前国内主要流式细胞仪厂家 Beckton Dickinson(BD) BACKMAN COULTER
淋巴细胞亚群分析
试剂：BD Multitest IMK Kit 标本：外周血（常用） 配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC
（三）荧光信号
目前常用FCM配置（BD Calibar） 488nm激光管常用染料有 第一通道（FL1）：FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 第二通道（FL2）：PE (Phycorey- thrin) 第三通道（FL3）：PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-Cy7、PE-Cy5、 PerCP-Cy5.5 633nm激光管常用染料有
1
10
2 700
3 720
4
15
……
Counts
0…………101…………102…………103
➢ 激发光源 ➢ 光学系统
信号收集与光电转 换系统
计算机与分析系统
细胞分选与浓缩系统
激发光源 滤光片
流动室、鞘 液和样本流
信号检测器
计算机分析
（二）激光光源与光学系统
（一）激发光源 ：激光器
气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
（四）计算机和分析系统
十字门
线性门
流式细胞仪特点
流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微 粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的 协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
目前国内主要流式细胞仪厂家 Beckton Dickinson(BD) BACKMAN COULTER
淋巴细胞亚群分析
试剂：BD Multitest IMK Kit 标本：外周血（常用） 配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC
（三）荧光信号
目前常用FCM配置（BD Calibar） 488nm激光管常用染料有 第一通道（FL1）：FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 第二通道（FL2）：PE (Phycorey- thrin) 第三通道（FL3）：PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-Cy7、PE-Cy5、 PerCP-Cy5.5 633nm激光管常用染料有
1
10
2 700
3 720
4
15
……
Counts
0…………101…………102…………103
流式细胞术在白血病MICM分型诊断中的作用
Influx 分选仪 1：模块化设计 2：200 000/秒(分析)
50 000/秒(分选) 3：5个激光 4：24色荧光 5：无菌环境
FACSAria II 1：高速分选 2：分选精度1/32滴 3：3个激光 4：13色荧光 5：仪器随开随用
<<back
FCM原理（动画）
FACSCalibur光路图
但是，流式免疫分型结果的解释应与临床、形态学、细胞遗传学等其他方 法结合使用，综合考虑，做出疾病的诊断与分类。
正常血细胞发育过程的抗原表达规律
按《WHO造血和淋巴组织肿瘤分类》（2008年版）
Wood B,etc（2007）
急性白血病的免疫表型
急性髓细胞白血病的免疫表型
细胞碎片
单核细胞
淋巴细胞
阈值
检测信号及意义：
荧光信号 根据荧光素交联的单克隆抗体不同而表达不同的意义
（一）设门 （gating）
（二）荧光强度 （三）单参数分析 （四）多参数分析
二、数据解释及报告
1.定性的描述（阳性或阴性）
2.评估抗原表达强度
3. 区分弱阳性和阴性群体
运用流式分析造血细胞的抗原表达情况，远远多于对形态学结果的简单证 实，能够提供大量的信息，可能帮助形态学确认某些诊断，也可能提出之前 没有考虑的诊断；在一些典型表现下，流式免疫分型可以在其他方法的辅助 之下诊断疾病。
Hale Waihona Puke 免疫分型的抗体组合原则免疫分型的抗体组合原则
一、常用抗体
白细胞分化抗原（leukocyte differentiation antigen）是指血细胞在分化成熟 为不同谱系、不同阶段及细胞活化过程中，出现或消失的细胞表面标记分子。
1982年，国际统一使用分化群（cluster of differentiation，CD）作为白细胞 分化抗原和相应单克隆抗体的命名，CD分子在流式细胞术的血液学应用中发挥着 重要作用。
50 000/秒(分选) 3：5个激光 4：24色荧光 5：无菌环境
FACSAria II 1：高速分选 2：分选精度1/32滴 3：3个激光 4：13色荧光 5：仪器随开随用
<<back
FCM原理（动画）
FACSCalibur光路图
但是，流式免疫分型结果的解释应与临床、形态学、细胞遗传学等其他方 法结合使用，综合考虑，做出疾病的诊断与分类。
正常血细胞发育过程的抗原表达规律
按《WHO造血和淋巴组织肿瘤分类》（2008年版）
Wood B,etc（2007）
急性白血病的免疫表型
急性髓细胞白血病的免疫表型
细胞碎片
单核细胞
淋巴细胞
阈值
检测信号及意义：
荧光信号 根据荧光素交联的单克隆抗体不同而表达不同的意义
（一）设门 （gating）
（二）荧光强度 （三）单参数分析 （四）多参数分析
二、数据解释及报告
1.定性的描述（阳性或阴性）
2.评估抗原表达强度
3. 区分弱阳性和阴性群体
运用流式分析造血细胞的抗原表达情况，远远多于对形态学结果的简单证 实，能够提供大量的信息，可能帮助形态学确认某些诊断，也可能提出之前 没有考虑的诊断；在一些典型表现下，流式免疫分型可以在其他方法的辅助 之下诊断疾病。
Hale Waihona Puke 免疫分型的抗体组合原则免疫分型的抗体组合原则
一、常用抗体
白细胞分化抗原（leukocyte differentiation antigen）是指血细胞在分化成熟 为不同谱系、不同阶段及细胞活化过程中，出现或消失的细胞表面标记分子。
1982年，国际统一使用分化群（cluster of differentiation，CD）作为白细胞 分化抗原和相应单克隆抗体的命名，CD分子在流式细胞术的血液学应用中发挥着 重要作用。
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33
免疫表型分析与FAB分型基于不同的参数对白血病进行分型，两 者的结果可一致或不一致；
对有些病例，尤其是髓系白血病亚型，免疫表型分析并非特异； 对于复杂的病例，需结合多种检查，如特异性染色体核型分析或
• • • • 以多参数正常抗原表达为基础 结果类似病理报告 用于原发性诊断与鉴别诊断 用于疾病分期，治疗选择疗效监测，预后判断
6
骨髓-异质性系统中的应用
多系列 – Lymphocyte (T, B, NK) – Monocyte – Neutrophil – Eosinophil – Basophil – Erythrocyte 骨髓中各系列细胞处于连续性成熟阶段
HCL
R5
25
大B细胞淋巴瘤
26
Name: he yinyan
Date:
No. 0907278
MM
R1 R3 R6 R4 R5 R2
27
T-ALL
R1 R3 R2 R4
28
R1 R3 R2 R7 R6 R4
NK-LGL
R5
29
报告
包括
– 出现或缺乏的异常细胞群 – 异常免疫表型 • 相比正常细胞群的抗原强度 – 增强，减弱，缺失
– 定量层面的判断
• 相对于全部CD45阳性细胞 (WBCs) – 出现的其它细胞群
30
R1 R3 R2 R4
31
TCRVβ克隆
32
小结
流式细胞术有助于血液系统异常疾病的诊断 – 更加确定的诊断 • 排除其他疾病 – 有助于细分亚型 • 更准确的原始细胞辨别和定量
– 有助于预后判断
– 治疗后监测 – 快速
11
正常粒系成熟模式
12
正常 B 系成熟
Wood (2004) Methods Cell Biology 75:559-576
白血病相关的免疫表型特点
表达交叉系列的抗原 非同步抗原共表达：CD34与CD15、CD11b、CD56、CD14
抗原的过度表达：早前B-ALL中CD10
抗原表达缺失：泛T抗原 易位抗原表达：CSF中TdT+淋巴细胞，骨髓中胸腺发育阶段的T淋
必须能涵盖所有细胞
7
应该使用何种抗体？
所有抗体必须为标准的商业化试剂 没有什么“秘密武器”或者专门特异的抗体
抗体的联合应用能使你从有限的标本中得到最大化的信息量
对正常抗原表达的正确认识能帮助你有效地鉴别疾病状态相关 的改变
8
高分辨流式细胞术 能够鉴别和分类所有骨髓细胞
I
II
III
IV
Antigen Expression
9
I
II
III
IV
V
103
CD 15 CD 11b
Antigen Density
CD 45
102
CD 33
CD 34 HLA-DR 10
1
CD 13
CD 16
Neutrophil Maturation
10
CD45/SS
Wood (2004) Methods Cell Biology 75:559-576
103
CD 34
CD 10 FMC 7
CD 45 102
CD 19 CD 20 CD 23 TdT CD 22 CD 5
101
可以对每一个细胞进行多特征性的检测 Lymphoid Maturation 并 对 其 相 应 的B系 列和成熟的阶段进行分类 至 少 检 测 一 万 个 细 胞， 分 辨 率 达 到 0.5 %
3
4
Investigative Tools for MM diagnosis and Management
(2008 ASH Education Program Book p298)
Patient Evaluation
诊断 单克隆蛋白数量和特征 血清蛋白电泳和免疫球蛋白定量 24小时尿蛋白；总蛋白；本周蛋白 尿和血清免疫固定 血清自由轻链和比例 骨髓检查和骨髓活检Bone marrow aspiration and biopsy 组化 免疫分型-克隆检定，及通过CD38/CD56/CD19/CD45抗体组合能从90余 例患者正常浆细胞中找到检测残留MM细胞 终末器官损害评价 全血细胞计数；生化检查: 血清肌酐和骨钙测定 预后评估 球蛋白，betta-2微球蛋白, LDH, CRP 骨髓细胞遗传学和FISH t(4;14), t(14;16), del 17p 针对某些特定患者的特殊研究
Burkitt淋巴瘤/白血病 成熟B-ALL
R6
21
MAL T+G
R1 R3 R4 R2 R5
MAL T+B
R1 R3 R4 R2
R5
22
R1 R3 R4 R2 R5
AUL
23
Name: xu zhongyu
Date:
No. 0908175
B-CLL/SLL
R1 R2 R4 R3 R5
24
R1 R3 R2 R4
流式细胞术在白血病/淋巴瘤分型和监测中的应用
世界卫生组织血液肿瘤分类方案（1999年）
“新分类方案的基本原则是：结合形态学、免疫表型、遗传改变和临床特征来鉴定 疾病的‘真实’本质”。 “这为世界各国肿瘤学家和病理学家提供了一个全新的与令人兴奋的合作交流新 篇章，必将极大促进人们对血液肿瘤的治疗与认识。”（美国临床肿瘤协会，临 床肿瘤杂志 17卷3835-3849页，1999年） 更重要的是提供了疾病分类与治疗选择和预后判断的较明确关联性，开启了血液
肿瘤靶向性治疗和个性化方案的新时代。
1
白血病分子诊断的意义 白血病初发
MICM诊断
系统诊断 异常标记
免疫/遗传学靶标
精确诊断 准确预后 指导治疗 科研资料
残留监测 靶向治疗
2
WHO血液肿瘤新分类实验技术平台
实施WHO血液肿瘤新分类方案高 度依赖流式细胞、细胞遗传和分子生 物学实验技术平台以及掌握这类实验 技能并具有专业知识的人员。
巴细胞
光散射异常：FSC和SSC
14
AML-M0
15
R1
AML-M2
R3 R2
R4
16
R1 R3 R2
AML-M3
R4
17
AML-M4
18
R1
R3 R2
R4
AML-M5R5来自19Name:zhang yixi
Date:
No. 0908243
R1
R3 R4 R2
B-ALL
20
R1 R4 R2 R5
5
流式细胞术
传统流式细胞术的临床应用
细胞计数：CD4、CD34 DNA含量：多倍数、S期 结果是数据、准确性依赖于良好的质控
传统流式细胞术在白血病免疫表型中的应用
• • • • 单参“白血病表型”，阳性比率 大多数细胞为肿瘤细胞 多为形态学/细胞化学后的确认 数据由临床医师判断
高分辨流式细胞的优点
免疫表型分析与FAB分型基于不同的参数对白血病进行分型，两 者的结果可一致或不一致；
对有些病例，尤其是髓系白血病亚型，免疫表型分析并非特异； 对于复杂的病例，需结合多种检查，如特异性染色体核型分析或
• • • • 以多参数正常抗原表达为基础 结果类似病理报告 用于原发性诊断与鉴别诊断 用于疾病分期，治疗选择疗效监测，预后判断
6
骨髓-异质性系统中的应用
多系列 – Lymphocyte (T, B, NK) – Monocyte – Neutrophil – Eosinophil – Basophil – Erythrocyte 骨髓中各系列细胞处于连续性成熟阶段
HCL
R5
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大B细胞淋巴瘤
26
Name: he yinyan
Date:
No. 0907278
MM
R1 R3 R6 R4 R5 R2
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T-ALL
R1 R3 R2 R4
28
R1 R3 R2 R7 R6 R4
NK-LGL
R5
29
报告
包括
– 出现或缺乏的异常细胞群 – 异常免疫表型 • 相比正常细胞群的抗原强度 – 增强，减弱，缺失
– 定量层面的判断
• 相对于全部CD45阳性细胞 (WBCs) – 出现的其它细胞群
30
R1 R3 R2 R4
31
TCRVβ克隆
32
小结
流式细胞术有助于血液系统异常疾病的诊断 – 更加确定的诊断 • 排除其他疾病 – 有助于细分亚型 • 更准确的原始细胞辨别和定量
– 有助于预后判断
– 治疗后监测 – 快速
11
正常粒系成熟模式
12
正常 B 系成熟
Wood (2004) Methods Cell Biology 75:559-576
白血病相关的免疫表型特点
表达交叉系列的抗原 非同步抗原共表达：CD34与CD15、CD11b、CD56、CD14
抗原的过度表达：早前B-ALL中CD10
抗原表达缺失：泛T抗原 易位抗原表达：CSF中TdT+淋巴细胞，骨髓中胸腺发育阶段的T淋
必须能涵盖所有细胞
7
应该使用何种抗体？
所有抗体必须为标准的商业化试剂 没有什么“秘密武器”或者专门特异的抗体
抗体的联合应用能使你从有限的标本中得到最大化的信息量
对正常抗原表达的正确认识能帮助你有效地鉴别疾病状态相关 的改变
8
高分辨流式细胞术 能够鉴别和分类所有骨髓细胞
I
II
III
IV
Antigen Expression
9
I
II
III
IV
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103
CD 15 CD 11b
Antigen Density
CD 45
102
CD 33
CD 34 HLA-DR 10
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CD 13
CD 16
Neutrophil Maturation
10
CD45/SS
Wood (2004) Methods Cell Biology 75:559-576
103
CD 34
CD 10 FMC 7
CD 45 102
CD 19 CD 20 CD 23 TdT CD 22 CD 5
101
可以对每一个细胞进行多特征性的检测 Lymphoid Maturation 并 对 其 相 应 的B系 列和成熟的阶段进行分类 至 少 检 测 一 万 个 细 胞， 分 辨 率 达 到 0.5 %
3
4
Investigative Tools for MM diagnosis and Management
(2008 ASH Education Program Book p298)
Patient Evaluation
诊断 单克隆蛋白数量和特征 血清蛋白电泳和免疫球蛋白定量 24小时尿蛋白；总蛋白；本周蛋白 尿和血清免疫固定 血清自由轻链和比例 骨髓检查和骨髓活检Bone marrow aspiration and biopsy 组化 免疫分型-克隆检定，及通过CD38/CD56/CD19/CD45抗体组合能从90余 例患者正常浆细胞中找到检测残留MM细胞 终末器官损害评价 全血细胞计数；生化检查: 血清肌酐和骨钙测定 预后评估 球蛋白，betta-2微球蛋白, LDH, CRP 骨髓细胞遗传学和FISH t(4;14), t(14;16), del 17p 针对某些特定患者的特殊研究
Burkitt淋巴瘤/白血病 成熟B-ALL
R6
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MAL T+G
R1 R3 R4 R2 R5
MAL T+B
R1 R3 R4 R2
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Name: xu zhongyu
Date:
No. 0908175
B-CLL/SLL
R1 R2 R4 R3 R5
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R1 R3 R2 R4
流式细胞术在白血病/淋巴瘤分型和监测中的应用
世界卫生组织血液肿瘤分类方案（1999年）
“新分类方案的基本原则是：结合形态学、免疫表型、遗传改变和临床特征来鉴定 疾病的‘真实’本质”。 “这为世界各国肿瘤学家和病理学家提供了一个全新的与令人兴奋的合作交流新 篇章，必将极大促进人们对血液肿瘤的治疗与认识。”（美国临床肿瘤协会，临 床肿瘤杂志 17卷3835-3849页，1999年） 更重要的是提供了疾病分类与治疗选择和预后判断的较明确关联性，开启了血液
肿瘤靶向性治疗和个性化方案的新时代。
1
白血病分子诊断的意义 白血病初发
MICM诊断
系统诊断 异常标记
免疫/遗传学靶标
精确诊断 准确预后 指导治疗 科研资料
残留监测 靶向治疗
2
WHO血液肿瘤新分类实验技术平台
实施WHO血液肿瘤新分类方案高 度依赖流式细胞、细胞遗传和分子生 物学实验技术平台以及掌握这类实验 技能并具有专业知识的人员。
巴细胞
光散射异常：FSC和SSC
14
AML-M0
15
R1
AML-M2
R3 R2
R4
16
R1 R3 R2
AML-M3
R4
17
AML-M4
18
R1
R3 R2
R4
AML-M5R5来自19Name:zhang yixi
Date:
No. 0908243
R1
R3 R4 R2
B-ALL
20
R1 R4 R2 R5
5
流式细胞术
传统流式细胞术的临床应用
细胞计数：CD4、CD34 DNA含量：多倍数、S期 结果是数据、准确性依赖于良好的质控
传统流式细胞术在白血病免疫表型中的应用
• • • • 单参“白血病表型”，阳性比率 大多数细胞为肿瘤细胞 多为形态学/细胞化学后的确认 数据由临床医师判断
高分辨流式细胞的优点