2006 越南巨竹竹叶中黄酮的提取纯化初步研究 赵丹 四川食品与发酵

越南巨竹（Ｄ．ｙｕｎｎａｎｉｃｕｓＨｓｕｅｇｅｔＤ．Ｚ．Ｌｉ），麻竹亚属，别名云南龙竹、大挠竹、大竹。

杆高达２５ｍ，径１１ｃｍ￣１８ｃｍ，梢头下垂，节间长４０ｃｍ￣５０ｃｍ，幼时被白色小刺毛。

竹材作建筑，竹筏、水管等用。

竹子在我国分布广泛，品种繁多，竹叶资源十分丰富。

对竹叶的保健功能人们早已有所认知，特别是在研究得知竹叶中富含类黄酮化合物等多种有效成分以来，许多国家加大了对竹子资源的开发力度。

竹叶中天然保健成分的研究与开发具有很好的经济效益，前景非常广阔。

我国竹类资源丰富，合理充分的利用我国的竹类资源，开发偏中性或碱性饮料以及天然油脂抗氧化剂和可食无毒防腐剂，具有很大的市场前景。

黄酮类化合物的糖苷是多酚化合物，具有酚类化合物的特征，有弱酸性，可溶于碱性溶液中但是很多黄酮类化合物在碱性溶液中有氧存在时，其黄酮苷会发生降解反应。

由于黄酮类成分中大多具有酚羧基，因此可用碱性水溶液或碱性稀醇溶液浸出，浸出液经酸化后可析出黄酮类化合物［１￣６］。

１材料与方法收稿日期：２００６－０９－１３作者简介：赵丹（１９８２－），在读硕士研究生。

研究方向：食品化学与营养学。

越南巨竹竹叶中黄酮的提取纯化初步研究赵丹１，肖平２（１．西南大学食品科学学院，重庆４００７１６；２．宜宾辐射应用实验站，四川宜宾６４４０００）摘要：本文重点介绍了从越南巨竹竹叶中提取纯化黄酮的工艺，并通过实验分析得出其提取纯化的最佳工艺流程。

结果表明：用聚酰胺为吸附层析的装柱材料，样液进样浓度为２．０ｍｇ／ｍｌ，进样流速１．５ｍｌ／ｍｉｎ，乙醇浓度８０％，流速３．０ｍｌ／ｍｉｎ，最大流量３５０ｍｌ。

关键词：竹叶；黄酮；提取；纯化中图分类号：ＴＳ９５９．２文献标识码：Ａ文章编号：１６７１－６８９２（２００６）０６－００１０－０００４ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＥｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｌａｖｏｎｉｏｄｆｒｏｍｔｈｅＬｅａｖｅｓｏｆＶｉｅｔｎａｍＨｕｇｅＢａｍｂｏｏＺＨＡＯＤａｎ１，ＸＩＡＯＰｉｎｇ２（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４００７１６，Ｃｈｉｎａ；２．ＹｉｂｉｎＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔａｔｉｏｎｏｆＲａｄｉａｔｉｏｎＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ＹｉｂｉｎＳｉｃｈｕａｎ６４４０００，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｆｌａｖｏｎｉｏｄｆｒｏｍｔｈｅｌｅａｖｅｓｏｆＤｅｎｄｒｏｃａｌａｍｕｓｙｕｎｎａｎｉｃｕｓＨｓｕｅｇｅｔＤ．Ｚ．Ｌｉｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ，ａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｌｏｔｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｕｓｉｎｇｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｃｏｌｕｍｎｐａｃｋｅｄｗｉｔｈｐｏｌｙａｍｉｄｅ，ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓａｍｐｌｅｌｉｑｕｉｄ２．０ｍｇ／ｍｌ，ｔｈｅｖｅｌｏｃｉｔｙｏｆｅｎｔｅｒｉｎｇｓａｍｐｌｅｌｉｑｕｉｄ１．５ｍｌ／ｍｉｎ，ａｌｃｏｈｏｌｄｅｎｓｉｔｙ８０％，ｃｕｒｒｅｎｔｖｅｌｏｃｉｔｙ３．０ｍｌ／ｍｉｎ，ｔｈｅｂｉｇｇｅｓｔｄｏｓａｇｅ３５０ｍｌ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂａｍｂｏｏｌｅａｖｅｓ；ｆｌａｖｏｎｉｏｄ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ四川食品与发酵ＳｉｃｈｕａｎＦｏｏｄａｎｄＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ第４２卷（总第１３４期）１．１材料越南巨竹叶处理方法：将竹叶于６０℃￣７０℃的烘箱中烘干，然后用粉碎机粉碎，真空包装，避光储存。

１．２试剂卢丁（生化试剂，上海试剂二厂生产）、乙醇、甲醇、色谱纯甲醇、冰乙醇、乙醇钠、氢氧化钠、聚酰胺（柱层析，１４目￣３０目，上海化学试剂公司）、柱层析用硅胶、ＡＢ￣８大孔树脂１．３主要仪器设备ＦＡ２００４Ａ电子天平上海精天电子仪器厂２ＸＺ－１型旋片式真空泵浙江临海市精工真空设备厂ＲＥ－８６旋转蒸发器上海本波试验仪器厂恒温真空干燥箱上海跃进试验仪器厂ＦＤ－１真空冷冻干燥机北京博医康技术公司电热恒温水浴锅上海医疗器械五厂层析柱（Φ２０ｍｍ￣４００ｍｍ）、回流浸提装置、真空抽滤装置等１．４实验方法［７￣１２］实验首先采用索氏抽提法。

准确称取１ｇ烘干并粉碎到一定粒度的竹叶干粉，用滤纸包好，放入索氏抽提器，用甲醇抽提，直到抽提回流液无色，浓缩溶剂。

将溶剂转移到１００ｍｌ容量瓶中，用相同浓度的乙醇溶液定容到刻度，即为样品液。

然后将所得样品液用聚酰胺柱层析分离纯化。

湿柱色谱是靠洗脱剂把分离的各个组分逐个洗脱下来，也称洗脱色谱。

欲分离的混合物中的各组分分配在吸附剂和洗脱剂之间，化合物被吸附剂吸附愈强，该化合物溶解在洗脱剂愈少，沿洗脱剂移动距离愈小。

色谱柱填充的吸附剂的量远远大于薄层板，且柱的大小可以依分离的物质的量的多少而选。

近年来不少人把柱色谱用于制备上，称为制备色谱。

１．４．１层析柱填充物的选择—静态吸附法比较取充分水洗的硅胶Ｇ、聚酰胺（柱层析，１４目～３０目）、ＡＢ－８大孔树脂各１０ｍｌ，分别加入到相同浓度的１００ｍｌ的样品液中，室温下振荡２４ｈ后，测定总黄酮的浓度，将上述进行过吸附的填充物转入直径１ｃｍ、长度３０ｃｍ的玻璃柱中，用９５％的乙醇和水洗涤至无色，然后在１２０℃烘干至恒重。

吸附量按下式计算各种树脂的静态吸附量。

吸附量（ｍｇ／ｇ）＝１．４．２动态吸附曲线的制作量取４００ｍｌ浓缩后的浸提液总黄酮浓度为３．０６５ｍｇ／ｍｌ的样品液，在流速为２．０ｍｌ／ｍｉｎ的条件下通过装好的层析柱，用自动收集器接收滤液，每支试管接收２ｍｌ，每间隔１管测定总黄酮浓度，以流出体积为横坐标，总黄酮浓度为纵坐标作图即得动态吸附曲线。

１．４．３聚酰胺的预处理及装柱称取５０ｇ聚酰胺，用４０目筛筛去小颗粒，加水浸泡２４ｈ。

取Φ２０ｍｍ×４００ｍｍ的玻璃柱层析，关闭出水口，装入预处理好的聚酰胺，柱中间如有气泡需重装。

１．４．４进样浓度实验将浓缩后得浸提液用３０％乙醇分别调整稀释为：０．５５ｍｇ／ｍｌ、０．７４ｍｇ／ｍｌ、１．０３ｍｇ／ｍｌ、１．５３ｍｇ／ｍｌ、２．０２ｍｇ／ｍｌ、２．５０ｍｇ／ｍｌ六个梯度的溶液，在流速为２．０ｍｌ／ｍｉｎ的条件下通过层析柱，直到柱饱和，计算吸附率，确定进样的浓度。

吸附率（％）＝×１００％１．４．５进样流速实验用总黄酮浓度为２．０２ｍｇ／ｍｌ的样品液，在不同流速下通过装填好的５０ｇ干重聚酰胺的层析柱，每２０ｍｌ测定流出液中总黄酮的含量，直到柱饱和，计算吸附率。

１．４．６洗脱剂浓度的选择分别量取２８０ｍｌ总黄酮浓度为２．０２ｍｇ／ｍｌ的样品液，在流速为１．５ｍｌ／ｍｉｎ的条件下通过装填好的层析柱，将流速调为３．０ｍｌ／ｍｉｎ，分别用２００ｍｌ４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％的乙醇洗脱，收集洗脱液，测定总黄酮洗脱率，确定最佳洗脱溶剂。

１．４．７洗脱溶剂流速的选择分别量取２８０ｍｌ总黄酮浓度为２．０２ｍｇ／ｍｌ的８０％乙醇溶液，在流速为１．５ｍｌ／ｍｉｎ的条件下通过装填好的层析柱，在不同流速下洗脱，收集洗脱液，测定总黄酮洗脱率，确定最佳洗脱溶剂的流速。

１．４．８洗脱溶剂用量的选择分别量取２８０ｍｌ总黄酮浓度为２．０２ｍｇ／ｍｌ的样品液，在流速为１．５ｍｌ／ｍｉｎ的条件下通过装填好的层析柱，在流速３．０ｍｌ／ｍｉｎ的条件下，先用５０ｍｌ蒸馏水通柱除去杂质，再用不同体积的６０％乙醇洗脱，收集洗脱液，测定黄酮洗脱率及洗脱液干燥物的总黄酮浓度，确定最佳洗脱溶剂的用量。

２结果与分析２．１不同填充物静态吸附效果的比较表１浸提时间对总黄酮提取的影响＊＊表示方差分析达到Ｐ≤０．０１异极显著水平赵丹等：越南巨竹竹叶中黄酮的提取纯化初步研究吸附前总黄酮的质量－吸附后总黄酮的质量填充物的质量进样溶液总黄酮的量－进样后流出总黄酮的量进样溶液总黄酮的量填充物重复数吸附量平均值／ｍｇ／ｇ标准误显著性ＡＢ－８大孔树脂３１３．４６０．５６ｂ硅胶３７．３５０．２１ｃ聚酰胺３１６．７８０．４１ａ汇总９１２．５３０．２４显著性＊＊Ｆ１３０．３０４Ｐ０．００００１１四川食品与发酵２００６年第６期数字后的小写字母为多重检验Ｐ＜０．０５显著水平不同填充物静态吸附的吸附量如表１所示。

聚酰胺吸附量高于其它两种填充物（差异极显著，ｐ＜０．０１适合于竹叶黄酮的纯化）。

因此，本实验确定使用聚酰胺为层析柱的填充物。

２．２聚酰胺柱动态吸附曲线图１聚酰胺柱动态吸附曲线以样品液浓度为２．０２ｍｇ／ｍｌ，流速１．５ｍｌ／ｍｉｎ的流速下进入含有聚酰胺的色谱柱中进行动态吸附，吸附曲线如图１。

当流出液为２８０ｍ时，总黄酮吸附已基本达到饱和。

２．３进样液浓度对吸附率的影响图２总黄酮浓度对吸附率的影响不同浓度进样液的吸附率见图２。

浓度为３．０６ｍｇ／ｍｌ和２．５２ｍｇ／ｍｌ时，浓度较高，溶液中的生物类黄酮未能充分被吸附即被滤出，吸附率较低。

０．５５ｍｇ／ｍｌ￣２．０２ｍｇ／ｍｌ，随着浓度的升高，吸附率逐渐升高，当达到２．０ｍｇ／ｍｌ时达到最高，所以选择２．０ｍｇ／ｍｌ作为样品液进样的浓度。

２．４进样流速的选择图３样品液流速对吸附率的影响流速低，样品液与柱的相对接触时间长，有利于充分吸附溶液中的黄酮；流速高，样品液与柱的相对接触时间短，不利于充分吸附溶液中的黄酮，随着流速的增大吸附率逐渐下降。

２．０ｍｌ／ｍｉｎ与１．５ｍｌ／ｍｉｎ有显著差异（ｐ＜０．０５），１．０ｍｌ／ｍｉｎ与１．５ｍｌ／ｍｉｎ差异不显著（ｐ＞０．０５），选择１．５ｍｌ／ｍｉｎ为进样流速。

２．５洗脱剂浓度的选择图４不同浓度乙醇的洗脱效果不同浓度的乙醇洗脱时的黄酮洗脱率如图４所示。

在乙醇浓度为４０％￣８０％时随着浓度的增加洗脱率逐渐增加，７０％、８０％两个浓度的乙醇水溶液的洗脱百分率相差显著（ｐ＞０．０５），所以选择８０％乙醇为洗脱剂。

２．６洗脱剂流速的确定图５不同洗脱剂流速的影响在不同流速洗脱时的洗脱率如图５。

随着洗脱流速的增大，黄酮洗脱率降低，３．５ｍｌ／ｍｉｎ与３ｍｌ／ｍｉｎ有显著差异性（ｐ＜０．０５），３ｍｌ／ｍｉｎ与２．５ｍｌ／ｍｉｎ差异不显著（ｐ＞０．０５），所以选择３ｍｌ／ｍｉｎ的洗脱流速。

２．７洗脱剂用量的选择图６洗脱剂用量对洗脱效果的影响吸附率／％样品液的浓度（ｍｇ／ｍｌ）吸附率／％流速（ｍｌ／ｍｉｎ）洗脱率／％洗脱剂的浓度（％）吸附率／％流速（ｍｌ／ｍｉｎ）洗脱率／％液体的体积（ｍｌ）流出液的体积（ｍｌ）总黄酮的浓度／ｍｇ／ｍｌ１２第４２卷（总第１３４期）!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"图６是用不同体积的７０％乙醇洗脱时的洗脱率。