猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展

来说，标准的 ELISA 法样品的制备，约 需 要 经 过 40 ～ 48 h 的 孵 育 才 能 完 成。 样品制备过程分 3 步 ： 1）选用营养肉汤 进行预增菌，使致伤、冷冻的沙门氏菌 复苏 ； 2）使用选择性培养基进行增菌， 使沙门氏菌大量繁殖，同时抑制其他杂 菌生长 ； 3）使用营养肉汤（蛋白胨水） 进行后增菌，使沙门氏菌的数量大大增 加。比上述标准的 ELISA 法样品制备过 程缩短了一半的时间。ELISA 方法本身， 则仅需要大约 2 h 而已（其中 30 min 是 操作时间，90 min 是孵育时间） 。 最新的沙门氏菌免疫学检测法利用 经特异性抗体敏化的免疫色谱卡片为基 础。几滴样品加到卡片上，结果可以直 接用肉眼读出。免疫色谱卡片极易操作， 且由于无需要特殊设备，很适合小型实 验室使用。尽管卡片检测法与 ELISA 法 一样需要对样品进行增菌处理， 但它（卡 片法）本身通常需时不超过 10 min。 文其乙 等建立了直接 ELISA 检测
多种猪肉产品的污染源，因而猪的沙门 氏菌病备受关注，全世界所有国家都非 常重视沙门氏菌控制。 沙门氏菌主要寄生于人和动物的肠 道中，但由于其在环境中具有较强的生 存能力，所以在环境中也广泛存在， 常见于农场的污水、人类生产的污物以 及被粪便污染的物体中。该细菌通常由 亚临床感染动物的排泄物通过施肥或浇 灌等方式造成环境源性污染，造成水果
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猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的 研究进展
耿士忠， 潘志明， 刘 杰， 刘志成， 方 强， 焦新安 （扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室， 江苏 扬州 225009） 沙门氏菌是常见的人和动物的重要 病原菌之一，呈全球性分布。多种沙门 氏菌均可感染猪，主要包括 ： 海德堡沙 门氏菌（Salmonlla heidelberg） 、 华盛顿 沙门菌（Salmonlla worthington） 、鼠伤 寒沙门氏菌（Salmonlla typhimurium） 、 鼠伤寒沙门氏菌哥本哈根变种 （S.typhimurium-var.copenhagen） 、 新 生 儿 德 尔 卑 沙 门 氏 菌（Salmonlla derby） 、 婴 儿 沙 门 氏 菌（Salmonlla infantis） ，以及乙型副伤寒沙门氏菌 （Salmonlla paratyphi B） 、斯坦利沙门 氏菌（Salmonlla stanley） 、雷根特沙门 氏菌（Salmonella regent） 、猪霍乱沙门 氏 菌（Salmonlla choleraesuis） 、肠炎 沙 门 氏 菌（Salmonella enteritidis） 等 血清型。其中猪霍乱沙门氏菌和德尔卑 沙门氏菌对猪具有宿主适应性，感染母 猪可长时间携带病原。世界上最大的一 起由沙门氏菌引起的食物中毒，1953 年 发生在瑞典，是由食用猪肉而引起的鼠 伤寒沙门氏菌中毒，导致 7 717 人中毒， 90 人死亡。由于沙门氏菌菌型、菌株不 同，致人发病的菌量也不同，一般使人 发病的菌量平均为 107 cfu 以上。鼠伤 寒沙门氏菌是最常见的血清型，在国外 占 27.7% ～ 80%，其次为肠炎沙门氏菌 占 10.3%。某省 10 年来的统计资料显示 猪在屠宰前感染沙门氏菌是比较严重的， 其检出率高达 26.5%。由于带菌率高， 在屠宰加工过程中，往往可造成猪肉污 染，猪肉的沙门氏菌检出率为 12.5%。 肉类食品从宰杀到烹调加工的各个环节 中，都可受到污染。烹调后的熟肉，如 果再次受到污染，并且在较高的温度下 保存，食用前又不再加热，则更为危险。 有些细菌主要在生长猪以及一些母猪的 肠道内繁殖。感染猪可连续数周甚至数 月从粪便中排出病原，而不表现任何症 状。在屠宰的时候，猪肠道中的沙门氏 菌可能污染胴体，导致人类食物中毒， 对公共健康构成潜在威胁。有些细菌如 猪霍乱和猪伤寒沙门氏菌，可引起仔猪 发病，是仔猪的一种较常见的肠道传染 病，而在成年猪中很少发生。该病在各 地猪场均有发生，特别是在卫生条件差 的猪场常有发生，给养殖业造成很大损 失。此病主要危害 1 ～ 4 月龄断奶仔猪， 所以是规模化猪场提高仔猪成活率与经 济效益的大敌 。由于这些沙门氏菌是
图 2 实时定量 PCR 仪 菌过程中，竞争性细菌生长过快而难以 分离。第 2 步是选择性增菌步骤，它能 选择性地使沙门氏菌生长，而抑制其他 细菌的生长，有时也对某些血清型的 沙门氏菌有抑制和致死作用，如亚硒酸 能抑制和致死猪霍乱沙门氏菌，亮绿对 都柏林沙门氏菌有害。除了在培养基中 添加特定成分外，还常常用提高温度的 方法来增加增菌培养基的选择性，不少 实验室采用的温度为 43 ℃。目前应用 的培养基主要有如下几种类型 ： 含四磺 酸 钠 的 Muller-Kauffman 肉 汤、 亚 硒 酸盐 F- 亚硒酸盐半胱氨酸 - 亮绿磺、 Rappaport-Vassiliadis 培养基或半固体 Rappaport-Vassiliadis 培养基、连四硫 基盐肉汤（Tetrathionate broth） 、硒酸 盐 胱 氨 酸 肉 汤（Selenitecystinebroth） ， 现在 Rappaport-Vassiliadis 培养基的推 荐温度为 41.5 ℃。活力选择增菌培养基 用来增加沙门氏菌的敏感性，半固体培 养基，如 MSRV 或 DIASALM（诊断用 半固体培养基）可以提供更好的选择性。 由于没有任何一种培养基可以全面地保 持所有食品基质或各种沙门氏菌血清型， 所以，较适当的做法就是使用 2 种培养 基平行地进行试验。从某种程度上讲， 使用多种选择性培养基或通过预增菌培 养后，直接选择性增菌、直接涂板会更 有利。第 3 步选择性平板培养，作为选 择性固体培养基，能进行不同程度的鉴 别培养，能抑制其他细菌生长，并能提 供沙门氏菌的一些主要生化鉴别特征 ： 无乳糖发酵和硫化氢产生，37 ℃培养 24 ～ 48 h 后判定结果。 在这种培养基上，
1 直接法——传统的培养鉴定方法
用于检测沙门氏菌的传统方法是 将食物样品分步增菌，以提高病原菌的 检出率。这种培养方法总体可分为 3 个 不同阶段，预增菌、选择性增菌及分离 步骤。传统沙门氏菌检测法全过程需时 至少 4 ～ 7 d，才能得出明确的诊断结 果。GB 4789.4-94 是 目 前 我 国 规 定 的 对畜产品中沙门氏菌的标准检测方法， 主要是根据沙门氏菌的生化特性，进行 预增菌、选择性增菌、分离培养、生化 鉴定和血清分型 5 个步骤。在检测畜产 品过程中，应注意根据不同的样品采取 不同的检测步骤。第 1 步预增菌，不表 现临床症状的动物粪便、环境样品、动 物饲料和食物中的沙门氏菌数量通常很 低，必须使用预增菌培养基（如缓冲 蛋白胨水） ，它能使少量的沙门氏菌增 殖，以利于细菌分离，或使用普通预增 菌液以帮助细菌分离。将样品添加到一 种高营养、无选择性的培养基中，37 ℃ 培养，有助于因被冷冻、加热、干燥或 生物试剂等因素而致于濒死的沙门氏菌 复苏。预增菌对较少的生长较活泼的沙 门氏菌可能不是最好的方法，如来自粪 便的热适应菌株，因为在非选择性预增
2010年 第6期 SWINE INDUSTRY SCIENCE 猪业科学 101
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肠杆菌科分属诊断噬菌体，其鉴定沙门 氏菌只要 6 min，加上培养菌落时间只 需 2 d。张碧波等应用噬菌体快速检测沙 门氏菌，对 100 个肠杆菌菌株进行噬菌 体 O-I 裂解试验，30 株沙门氏菌全部为 阳性，而其余非沙门氏菌株全部为阴性， 与前人研究结果一致。由此可见，应用 沙门氏菌噬菌体 O-I 对沙门氏菌进行检 测方便可靠。
图 3 磁分选仪 沙门氏菌形成特征性菌落，据此通常可 与其他细菌菌落相区别。现在有一种较 宽范围的显色培养基可以方便使用。有 许多这样的培养基有助于分离可疑菌落， 但是必须确认样品的基体、培养系统和 血清型，因为在某些环境下，细菌的感 受性是很差的。第 4 步是分离鉴定步骤， 即选择性培养物在含一种或多种抑制非 沙门氏菌生长制剂的琼脂平板上划线培 养，然后对平板上肉眼可见的特征性可 疑菌落进行确认，并将可疑菌落在选择 和非选择性琼脂上作继代培养，对该菌 落分离物进行一系列生化和血清学检测， 以作出鉴定。鉴定 O、H 抗原和在特定 的情况下鉴定 Vi 抗原，可用特异抗血清 进行直接平板凝集试验。在具有双相菌 的情况下，应通过含已知相抗血清的半 固体培养基传代，用相转化法鉴定 2 个 相，尽可能使用抗多种因子的抗血清加 速筛选，因为单因子血清能更进一步纯 化细菌。大多数实验室能鉴定较为普通 的血清型，而进一步鉴定某菌株应参考 实验室的设备。传统沙门氏菌检测法全 过程需时至少 4 ～ 7 d，才能得出明确的 诊断结果。 噬菌体对细菌有特殊的裂解作用。 Thal-Kalings 对 1 181 株 沙 门 氏 菌 和 323 株其他菌株进行沙门氏菌噬菌体 O-I 裂解试验，结果表明沙门氏菌裂解率为 99.5%，而非沙门氏菌裂解率为 0.3%。 截 至 到 1973 年，Keils 及 Seeliger 等 人 通过大量观察证实，沙门氏菌属内裂解 率在 95.0% ～ 99.6% 之间，属外误差为 0% ～ 2.33% 之间。何晓青等发现一种
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蔬菜等二次污染，引起人间接感染，或 者引起食源性污染，如肉、蛋、奶等直 接污染，引起人因食用污染食物而感染， 并致人腹泻或系统性疾病。猪沙门氏菌 病引起的严重的公共卫生问题，对猪肉 的食品安全及国际贸易形成较大威胁。 因此对猪沙门氏菌的检测及诊断就显得 至关重要。 自 19 世纪后期，沙门氏菌首次被鉴 定为人类的一种病原以来，检测方法学 都是建立在采集感染动物或患病者的粪 便或血液作为临床病料的基础上。此后 的 60 年间，用于从食品中分离沙门氏菌 的方法实质上与那些用于临床病料的方 法是相同的。但至少有 3 个因素限制了 用于临床病料的方法应用在食品分析上。 第一，通常，沙门氏菌的含量水平在污 染食品中比在感染病人的病料中要低很 多； 第二，食品本身的性质会干扰病原 的检测，例如，某些食品中固有菌群可 能处在一个很高的水平，从而影响特定 细菌的选择性分离和鉴定 ； 第三，与临 床病料不同的是，经过加工的食品，由 于加热、干燥、高含盐量、酸和冷冻等 因素的作用，其中的沙门氏菌受到了尚 不致命的损伤或称“致伤” ，这就形成 了一个具有不同生长特性的细菌群，这 种现象对那些希望从食物样品中分离出 沙门氏菌的食品分析家来说有很大影 响，因为在选择培养基上直接培养“致 伤”的沙门氏菌通常是以细菌死亡和试 验失败而告终。为克服这些困难，人们 建立了一种简单的微生物增殖步骤，专 门针对以食品为传播载体的病原。虽然