利用免疫共沉淀验证HT036与P311间的相互作用.
检测蛋白相互作用的方法
检测蛋白相互作用的方法
检测蛋白相互作用的方法主要有酵母双杂交技术、免疫共沉淀和GST pull-down实验。
1. 酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白的筛选，缺点就是假阳性较高，所以需要进行结果验证，一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进行验证。
2. 免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。
当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。
再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行Western blot检测，进而证明两者间的相互作用。
3. GST pull-down实验：是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。
其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体，然后进行体外表达及纯化。
将得到的靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当一种“诱饵蛋白”，然后将目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的蛋白，将目的蛋白洗脱下来，通过SDS-PAGE电泳及Western blot分析证实两种蛋白间的相互作用。
以上内容仅供参考，建议查阅相关文献获取更专业的信息。
染色质免疫共沉淀原理
染色质免疫共沉淀原理染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究染色质中特定蛋白质与DNA相互作用的重要技术。
通过ChIP技术，可以确定染色质中特定蛋白质的结合位点，从而揭示基因调控网络和表观遗传调控机制。
本文将介绍染色质免疫共沉淀的原理及其在生物学研究中的应用。
ChIP技术的原理主要包括交联、裂解、免疫沉淀、洗涤和DNA纯化等步骤。
首先，将细胞进行交联，使得染色质中的蛋白质与DNA固定在一起。
随后，对细胞进行裂解，释放染色质蛋白质复合物。
接着，使用特异性抗体将目标蛋白质与其结合的DNA片段进行免疫沉淀。
然后，通过洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白质和DNA，最终得到目标蛋白质结合的DNA片段。
最后，通过逆交联和DNA纯化，获得可以进一步分析的DNA样品。
ChIP技术在生物学研究中有着广泛的应用。
首先，ChIP技术可以用于确定染色质中特定蛋白质的结合位点，从而帮助研究人员理解基因的调控机制。
其次，ChIP技术还可以用于研究表观遗传调控，揭示组蛋白修饰与基因表达调控之间的关系。
此外，ChIP技术还可以用于筛选与某一特定蛋白质结合的DNA片段，从而帮助鉴定新的转录因子结合位点。
总之，ChIP技术在生物学研究中发挥着重要的作用，为研究人员提供了一种强大的工具来探究基因调控和表观遗传调控机制。
综上所述，染色质免疫共沉淀技术通过特异性抗体沉淀染色质中与特定蛋白质结合的DNA片段，为研究人员提供了一种重要的工具来研究基因调控和表观遗传调控。
随着生物学研究的不断深入，ChIP技术的应用也将变得更加广泛，为我们揭示生命的奥秘提供更多的可能性。
免疫共沉淀实验原理及方法
免疫共沉淀实验原理及方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1免疫共沉淀实验原理及方法免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。
免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。
免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。
免疫共沉淀的优势：与其他研究蛋白质相互作用技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相比，免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，避免了人为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。
免疫共沉淀的局限性和注意事项：1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到；2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大；4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高；5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测；6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员[1]免疫共沉淀的一般操作流程（中英文对照）：1.用预冷的PBS洗涤细胞两次；2.Carefully wash cultured cells with pre-chilled PBS for 2 times.3.4. 2. 加入预冷的RIPA裂解缓冲液（107细胞加入1ml）；5.Add in cold RIPA lysis buffer (1ml for 107cells).6.7. 3. 用预冷的细胞刮将细胞从培养介质上刮离，并转移到干净的管中。
免疫共沉淀原理及实验方法
免疫共沉淀原理及实验方法免疫共沉淀是一种通过使用抗体分子来使特定蛋白质复合物沉淀下来的方法。
在这个过程中，抗体与蛋白质复合物结合，形成抗原-抗体共沉淀复合物。
这种方法可以用于研究蛋白质间的相互作用、检测特定蛋白质的存在以及分离蛋白质复合物等。
1.细胞裂解：将目标细胞或组织加入裂解缓冲液中，破坏细胞膜，使蛋白质释放到溶液中。
2.抗体结合：将特异性抗体加入裂解液中，与目标蛋白质结合。
3.免疫沉淀：将抗原-抗体复合物与免疫沉淀剂（如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G磁珠）结合，形成免疫复合物。
4.洗涤：通过多次洗涤步骤去除非特异性结合物质，以提高免疫复合物的纯度。
5.去除抗原-抗体结合：使用酸性溶液或高盐浓度缓冲液等方式解离免疫复合物，分离出目标蛋白质。
6. 分析：通过Western blot、免疫印迹、质谱等手段对分离出的蛋白质进行分析。
免疫共沉淀的原理是利用抗体与特定目标蛋白质的结合来将其沉淀下来。
抗体通常是由动物制备得到的，可以选择单克隆抗体或多克隆抗体。
在实验中，抗体可以特异性地结合到目标蛋白质的表位上，形成稳定的免疫复合物。
随后，通过与免疫沉淀剂结合，可以使免疫复合物沉淀下来。
免疫共沉淀这种实验方法在生物医学研究中具有广泛的应用，例如检测蛋白质间的相互作用、鉴定细胞中的蛋白质复合物、研究信号转导通路等。
通过免疫共沉淀可以揭示蛋白质的功能和相互作用网络，深入理解生物学过程中蛋白质的功能和调控机制。
然而，免疫共沉淀实验也存在一些局限性。
首先，抗体需具有高度的特异性和亲合力，以保证免疫复合物的选择性。
其次，免疫共沉淀依赖于抗体与目标蛋白质的免疫反应，在一些情况下可能出现低表达的蛋白质无法被充分沉淀的问题。
此外，非特异性结合和高背景信号也会影响实验结果的准确性。
综上所述，免疫共沉淀是一种基于抗体-抗原相互作用原理的实验方法，可用于研究蛋白质间的相互作用和分离特定蛋白质复合物等。
这种方法广泛应用于生物医学研究领域，对于揭示蛋白质功能和调控机制具有重要意义。
检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术
一、检测蛋白质与蛋白质相互作用①技术（），，即荧光共振能量转移技术。
该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：以下图为例，若要利用检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。
然后只需用紫外光对进行激发，并检测是否放出绿色荧光。
如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。
②酵母双、三杂交技术（）酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如4、4等都含有二个不同的结构域，即和。
这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。
由此，设计不同的两个载体，一个含有基因（假设为A载体），另一个含有基因（假设为B载体）。
一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵()，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。
如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。
该系统的原理如下图所示：如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段()和N端段()，并在C端段的N端接上一个16转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。
将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。
若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。
此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解，那么连接C端段的16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。
内皮抑制素相互作用蛋白HT036基因的全长克隆及其促血管上皮细胞凋亡的分子机制
ｅ ｄ ｓａ ｎ ａ ｄ ｔ ｍｏｅ ｕａ ｍｅ ｈ ｎｓ ｎ ｏｔ ｔ ｎ ｉ ｉ ｓ ｌｃ ｌ ｒ ｃ ａ ｉｍ ｉ ｐ ｏ ｔ ｇ ｔ ｅ ｎ ｒ ｍｏ ｉ ｎ ｈ
ａ ｏ ｔｓｓｏ ａ ｃ ｌｒｅ ｄ ｔ ｅｌｌ ｅｌ ｐ ｐｏ ｉ ｆｖ ｓ ｕａ素相互作用蛋白Ｈ ０６ Ｔ３ 基因的全长克隆及其 术术术 ☆ 促血管上皮细胞凋亡的分子机制
范保星 ‘ ， 张宝林 ， 孙敬芬 ， 曹 璐 ， 良安 ， 陈 刘又宁
解 放 军 总 医院 。 呼吸 科 ， 研 处 。 液 科 。 京 市 １０ ５ ’ 科 血 北 ０Ｉ ３ ８ 范 保 星 ☆ 。 。９ ３年 生 ， 东 省 茌 平 县 人 。 族 ，０ ２年 解 放 军 军 事 医 男 １７ 山 汉 ２０ 学科 学 院 毕 业 。 士 ， 博 副研 究 员 ． 主要 从 事肺 癌 发 生 的分 子 机 制 研 究 。 国 家 自然科 学基 金 （０ ０４ ４，（ ｏ ｌ ８ ； ３ ３ ０ ０ ３１ ｏ ９ ） 北京 市 自然 科 学 基 金 责 助 ４
白能与内皮抑制索 在真核细胞 中相互作用 。￣Ｈ ０６基因对细胞凋亡 Ｔ３
和 细 胞周 期 的 影 响 ： 功 构 建 了表 达 Ｈ 、 ６基 因 的真 核 表 达 载 体 ， 次 成 １３ ０ 两
维普资讯
中国临床康复 第 ７ 卷 第 ４ 期 ２０ － １ １ 口 ， ０ ６ １－ ０出版 Ｃ ｉ ｓ ｏ ｒａ ｏ ｌ ｉ ｌＲ ｈ ｂｌａ ｏ， ｏｅ ｂ ｒ１ ０ ６ Ｖ １ ０ Ｎ ． ｌ ｈ ｅｅ Ｊｕｎｌ ｆ Ｃｉ ｃ ｅ ａ ｉｔ ｉ Ｎ ｖｍ ｅ ０ ２ ０ ｏ ｎ ｎａ ｉｔｎ ．１ ｏ ４
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生物素标签 相互作用的实验
生物素标签相互作用的实验
生物素标签是一种常用的蛋白质标记方法，可以通过生物素与亲和素的相互作用来实现蛋白质的纯化、检测和定位等操作。
以下是一些常用的生物素标签相互作用实验：
1. 亲和层析法：将生物素标记的蛋白质与亲和素柱进行层析，利用生物素与亲和素的相互作用来纯化目标蛋白质。
2. 免疫共沉淀法：将生物素标记的蛋白质与抗生物素抗体结合，再将其与含有生物素的磁珠一起加入到混合物中，利用生物素与抗生素抗体的相互作用来沉淀目标蛋白质。
3. 荧光共振能量转移法（FRET）：将生物素标记的蛋白质与荧光标记的亲和素结合，利用生物素与亲和素的相互作用来实现荧光共振能量转移，从而检测蛋白质相互作用。
4. 免疫荧光染色法：将生物素标记的蛋白质与荧光标记的抗生物素抗体结合，利用生物素与抗生素抗体的相互作用来定位目标蛋白质在细胞中的位置。
以上是一些常用的生物素标签相互作用实验，可以根据实验需要选择
合适的方法进行操作。
免疫共沉淀实验原理及方法
免疫共沉淀实验原理及方法免疫共沉淀实验（immunoprecipitation）是一种常用的分子生物学实验方法，用于检测免疫反应的可视化。
该实验基于免疫学反应的原理，通过特异性抗体与目标分子结合，将目标分子从复杂的混合物中沉淀出来，以便进一步分析。
免疫共沉淀实验的原理是基于抗体与抗原之间的特异性结合。
首先，需要选择与目标分子特异性结合的抗体，并对抗体进行纯化和标记，常用的标记物有酶、放射性同位素、荧光素等。
然后，将标记的抗体与样品中的目标分子充分混合，在适当的条件下，使抗体与目标分子发生结合反应。
接下来，通过添加沉淀剂，例如蛋白A/G磁珠、蛋白G琼脂糖或亲和素等，将抗体/目标复合物与其他组分一起沉淀下来。
通过离心将沉淀物分离出来，然后用缓冲液洗涤，以去除非特异性结合的物质。
最后，将洗涤后的沉淀物进行破碎、蛋白质酶解等处理，并使用电泳、免疫印迹、质谱等技术对目标分子进行分析和鉴定。
在免疫共沉淀实验中，关键步骤包括抗体的选择和标记、样品的制备与处理、抗体与目标分子的结合、沉淀物的分离与洗涤以及沉淀物的分析和鉴定。
1.抗体的选择和标记：选择特异性结合目标分子的抗体，并对抗体进行纯化和标记。
例如，使用蛋白A/G或蛋白G将抗体结合于磁珠或琼脂糖上，再通过标记物的共价偶联（如酶、放射性同位素、荧光素等）对抗体进行标记。
2.样品的制备与处理：根据实验要求，选择适当的样品组织或细胞，将其裂解并得到包含目标分子的混合物。
裂解缓冲液的组成需要根据目标分子的特性进行优化，以保持目标分子的稳定性和活性。
可以加入适量的蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和甲基化酶抑制剂等保护目标分子。
3.抗体与目标分子的结合：将标记的抗体加入到样品中，与目标分子发生特异性结合反应。
可以在低温（4℃）下进行反应，以减少非特异性结合。
4.沉淀物的分离和洗涤：通过添加适当的沉淀剂，将抗体/目标复合物与其他组分一起沉淀下来。
常用的沉淀剂有通过蛋白A/G磁珠、蛋白G琼脂糖或亲和素等。
rna结合蛋白免疫沉淀原理
rna结合蛋白免疫沉淀原理免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是一种常用的研究蛋白质相互作用的实验方法。
通过使用特定的抗体，将与目标蛋白结合的蛋白质沉淀下来，然后对沉淀的蛋白质进行检测和分析。
在Ma结合蛋白的免疫沉淀实验中，通常使用标记的Ma蛋白作为抗原，与细胞提取物中的蛋白质进行结合，然后通过免疫沉淀技术将结合的蛋白质沉淀下来，最后对沉淀的蛋白质进行检测和分析。
一、实验原理免疫沉淀实验的基本原理是利用抗体与抗原之间的特异性结合作用，将与目标蛋白结合的蛋白质沉淀下来。
抗体通常是一种能够识别并结合特定抗原的蛋白质，通过抗体的结合，将抗原-抗体复合物从溶液中沉淀下来，从而达到分离和纯化抗原的目的。
在Ma结合蛋白的免疫沉淀实验中，首先需要制备标记的Ma蛋白，并将其作为抗原添加到细胞提取物中。
细胞提取物通常包含大量的蛋白质，其中一些蛋白质可能与Ma蛋白结合。
通过抗原-抗体之间的特异性结合作用，将与Ma蛋白结合的蛋白质沉淀下来。
二、实验步骤1. 制备标记的Ma蛋白：首先需要将目标Ma蛋白进行标记，通常使用生物素、荧光染料等标记剂进行标记。
标记后的Ma蛋白具有更高的特异性和灵敏度，可以用于后续的免疫沉淀实验。
2. 细胞提取物的制备：从待研究的细胞中提取蛋白质，通常使用细胞裂解液将细胞溶解，然后通过离心、洗涤等步骤去除细胞碎片和其他杂质。
3. 抗原-抗体反应：将标记的Ma蛋白添加到细胞提取物中，与其中的蛋白质进行结合。
在适当的温度下保持一段时间，使抗原和抗体充分结合。
4. 免疫沉淀：通过加入抗Ma蛋白的抗体，将与Ma蛋白结合的蛋白质沉淀下来。
抗体通常与固相支持物（如微珠或凝胶）相结合，通过离心、洗涤等步骤将抗原-抗体复合物从溶液中分离出来。
5. 蛋白质检测和分析：对沉淀的蛋白质进行检测和分析，通常使用Western blot、质谱等方法对蛋白质进行定性和定量分析。
三、实验结果通过免疫沉淀实验，可以检测到与Ma蛋白结合的蛋白质，并对其进行鉴定和分析。
免疫共沉淀中input作用
免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质与其他分子之间的相互作用。
在免疫共沉淀实验中，我们通常有两个主要组分：待测蛋白（target protein）和抗体（antibody）。
在实验中，待测蛋白是我们感兴趣的蛋白质，而抗体是一种专门识别和结合待测蛋白的分子。
免疫共沉淀实验的目标是使用特定的抗体选择性地沉淀待测蛋白，并在沉淀物中检测其与其他蛋白质或分子的相互作用。
输入（input）在免疫共沉淀实验中是一个关键的对照样品，通常是与待测蛋白没有直接相互作用的蛋白质或其他分子。
输入的作用是帮助确定实验结果中的非特异性结合或背景信号。
通过引入输入对照，我们可以区分特异性相互作用和非特异性结合。
当我们将输入样品与抗体一起加入到实验体系中时，我们期望抗体能够选择性地沉淀目标蛋白，并且与输入没有相互作用。
因此，在共沉淀物中观察到的信号应该主要来自于待测蛋白与抗体的特异性结合，而与输入无关。
输入通常是通过使用无关的抗体或与待测蛋白没有交互作用的蛋白质来实现的。
它可以帮助确定实验中的背景信号或非特异性结合，并确保我们正确地解释共沉淀实验结果。
通过与输入进行比较，我们可
以验证共沉淀物中的信号是否真正由待测蛋白与其他分子的特异性相互作用所引起。
因此，输入的作用是提供一个参考标准，用于区分特异性信号和非特异性结合或背景信号，从而帮助研究人员解释免疫共沉淀实验结果，并准确地确定待测蛋白与其他蛋白质或分子的相互作用。
这样的对照样品在免疫共沉淀实验中是至关重要的，以确保结果的可靠性和准确性。
免疫共沉淀检测蛋白质间的相互作用
免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种常用的蛋白质相互作用分析技术，可以用于研究蛋白质之间的相互作用、识别蛋白质复合物以及探索细胞信号传导等重要生物学过程。
本文将详细介绍免疫共沉淀技术的原理、步骤和应用，并探讨其优点和局限性。
一、免疫共沉淀技术原理：免疫共沉淀技术基于抗体的高度特异性，利用抗体与靶蛋白质结合的能力，从复杂的蛋白质混合物中富集出靶蛋白质及其相互作用伙伴。
该技术主要分为两个步骤：1）抗体结合：将特异性抗体与目标蛋白质结合形成免疫复合物；2）沉淀：利用固相支持介质，如蛋白A/G琼脂糖或磁珠，将免疫复合物沉淀下来。
二、免疫共沉淀技术步骤：1. 样品制备：从细胞或组织中提取目标蛋白质，并加入破碎细胞溶液进行裂解，释放蛋白质。
同时，添加蛋白质抑制剂和磷酸酯酶抑制剂，以保持蛋白质的完整性和稳定性。
2. 抗体结合：将特异性抗体与目标蛋白质结合，形成免疫复合物。
可以选择已经商业化的特异性抗体，也可以利用自制抗体。
3. 免疫共沉淀：将免疫复合物与固相支持介质（如蛋白A/G 琼脂糖或磁珠）结合，通过离心或磁力使免疫复合物沉淀下来。
4. 洗涤：通过多次洗涤步骤，去除非特异性结合的蛋白质和杂质，以提高目标蛋白质的纯度。
5. 脱附：使用适当的缓冲液脱附免疫复合物，使其从固相支持介质上解离出来。
6. 分析：通过Western blot、质谱等方法对脱附的免疫复合物进行进一步的分析和检测。
三、免疫共沉淀技术应用：1. 确定蛋白质间相互作用：通过免疫共沉淀技术，可以识别和验证蛋白质之间的直接或间接相互作用，从而揭示细胞信号传导、蛋白质复合物组装和功能等重要生物学过程。
2. 寻找潜在药物靶点：通过免疫共沉淀技术，可以筛选和发现与特定蛋白质相互作用的小分子化合物，为药物研发提供有力的靶点信息。
3. 验证蛋白质复合物：通过免疫共沉淀技术，可以确定已知蛋白质复合物的成员以及其相互作用方式，进一步了解复合物的结构和功能。
利用免疫共沉淀技术研究RSV
利用免疫共沉淀技术研究RSV呼吸道合胞病毒（RSV）是一种常见的呼吸道病毒，引起婴幼儿病毒性肺炎和支气管炎等疾病。
RSV感染具有较高的发病率和死亡率，尤其对儿童和老年人等免疫力较弱的人群危害更大。
因此，研究RSV的致病机制和抗病毒药物的研发是当前的重要课题。
本文利用免疫共沉淀技术，旨在探讨RSV感染后与人体蛋白之间的相互作用，以期为RSV致病机制的研究提供新的思路。
过去的研究主要集中在RSV的病毒结构、基因组、临床表现等方面，对于RSV与人体蛋白之间的相互作用研究较少。
免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的经典方法之一，具有较高的灵敏度和特异性。
然而，由于RSV感染的复杂性，单一的免疫共沉淀实验难以全面揭示RSV与人体蛋白之间的相互作用，因此需要进一步完善实验方法和数据分析。
免疫共沉淀技术的基本原理是利用抗体与抗原的特异性结合，将混合溶液中的目标蛋白质与其他蛋白质分离出来，经过洗脱、纯化等步骤，最终获得纯度较高的目标蛋白质。
在本研究中，我们首先确定了实验流程：RSV感染细胞→细胞裂解→免疫共沉淀实验→质谱分析→数据解读。
然后，我们根据实验流程挑选出高质量的抗体，确保抗体的特异性识别RSV抗原。
在质谱分析环节，我们采用液相色谱-质谱联用技术对获得的共沉淀物进行分析，从而确定与RSV相互作用的蛋白质。
通过免疫共沉淀实验和质谱分析，我们获得了与RSV相互作用的蛋白质清单，并进行了数据解读。
结果表明，RSV与多种人体蛋白发生相互作用，这些蛋白质主要参与细胞代谢、细胞信号转导、免疫应答等方面。
我们还发现了一些与RSV感染密切相关的蛋白质，如病毒进入细胞的相关蛋白、病毒复制所需的蛋白质等。
这些结果为深入探讨RSV的致病机制提供了有益的信息。
对实验结果进行详细分析发现，RSV与人体蛋白之间的相互作用具有以下特点：RSV与细胞膜表面的糖蛋白、细胞骨架蛋白等相互作用，这有助于病毒进入细胞并在细胞内复制；RSV还与参与细胞信号转导的蛋白质相互作用，这可能干扰和破坏了正常的细胞信号转导途径，导致细胞功能异常；RSV还与免疫应答相关的蛋白质相互作用，这可能抑制了机体的免疫应答，使病毒得以在体内持续存在。
核酸蛋白质的免疫共沉淀
核酸蛋白质的免疫共沉淀
核酸蛋白质的免疫共沉淀
免疫共沉淀是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质与核酸之间的相互作用。
通过利用特异性抗体，可以将特定的蛋白质-核酸复合物沉淀下来，以便进一步分析其结构和功能。
以下是核酸蛋白质免疫共沉淀的基本原理和步骤：
1. 抗体选择：根据研究目的选择能够与目标蛋白质特异结合的抗体。
这些抗体通常是经过充分验证的，确保其高度特异性和亲和力。
2. 样品准备：将待研究的生物样品（如细胞提取物或组织溶液）进行预处理，以确保目标蛋白质和核酸的稳定性和完整性。
3. 免疫共沉淀反应：将抗体与样品中的目标蛋白质结合，形成抗体-蛋白质复合物。
这个过程通常在低温环境下进行，并可以通过交联剂等手段增强复合物的稳定性。
4. 共沉淀：将复合物与磁珠或琼脂糖糖珠等亲和基质结合，使复合
物以沉淀形式分离出来。
这些亲和基质通常具有与抗体Fc区域相互作用的亲和分子。
5. 洗脱和分析：通过洗脱步骤去除非特异性和背景物质，并收集纯化的复合物。
纯化的复合物可以进一步用于不同的分析技术，如免疫印迹、质谱分析或核酸测序等。
核酸蛋白质免疫共沉淀是一种有力的实验方法，可用于研究核酸与特定蛋白质的相互作用，从而深入了解其在细胞中的功能和调控机制。
正确的实验设计和严格的实验操作能够确保结果的可靠性和准确性，进一步促进科学研究的进展。
染色质免疫沉淀技术及其应用
染色质免疫沉淀技术及其应用染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究染色质中特定蛋白质与DNA相互作用的技术。
它可以帮助研究人员了解基因表达调控、表观遗传修饰等重要生物学过程，因此在生命科学领域具有重要应用价值。
一、染色质免疫沉淀技术原理及步骤1. 原理染色质免疫沉淀技术的基本原理是利用抗体特异性识别和结合染色质中的特定蛋白质，然后利用蛋白A/G或者其他物质来沉淀结合的染色质片段，最后通过PCR、测序等手段对沉淀的DNA片段进行检测和分析。
2. 步骤（1）交联：在进行染色质免疫沉淀实验前，需要对细胞或组织进行交联处理，使得染色质中的蛋白质与DNA紧密结合。
（2）裂解：对交联后的细胞进行裂解，释放染色质。
（3）免疫沉淀：使用特异性抗体进行免疫沉淀，将特定蛋白质与DNA结合的片段沉淀下来。
（4）逆交联：去除交联剂，使得DNA片段能够被进一步分析。
（5）DNA提取：从免疫沉淀得到的染色质片段中提取DNA。
（6）PCR或测序：通过PCR扩增或者测序的方法对免疫沉淀得到的DNA进行分析。
1. 研究基因调控染色质免疫沉淀技术可以用于研究基因调控过程中转录因子、组蛋白等蛋白质与染色质的相互作用，从而揭示基因的表达调控机制。
2. 研究表观遗传修饰染色质上的表观遗传修饰（如甲基化、乙酰化等）对基因表达具有重要影响，染色质免疫沉淀技术可以帮助研究人员了解这些修饰与染色质蛋白质的相互作用及其在基因表达调控中的作用。
4. 药物筛选染色质免疫沉淀技术可以应用于药物筛选，帮助研究人员评估候选药物对染色质蛋白质的影响，从而发现潜在的药物治疗靶点。
5. 肿瘤研究染色质免疫沉淀技术可以用于肿瘤研究中，帮助研究人员了解染色质中关键蛋白质的变化及其对肿瘤发生发展的影响。
1. 自动化和高通量随着科学技术的不断发展，染色质免疫沉淀技术也在向自动化和高通量方向发展，为更大规模的样品进行染色质免疫沉淀提供了可能。
研究蛋白互作的七种方法总结
研究蛋白互作的七种方法总结蛋白互作方法总结蛋白质间的相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。
本文总结了七种蛋白质相互作用的方法。
01免疫共沉淀技术免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其基本原理是：细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。
但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
02pull-down技术蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。
牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免疫共沉淀(Co-IP) 、Pull-down技术或Far-western法研究。
Pull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-)，从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。
通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。
03酵母双杂交系统酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。
其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。
将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。
在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。
免疫共沉淀试验原理及方法
免疫共沉淀试验原理及方法免疫共沉淀试验基于抗体-抗原相互作用的原理进行。
首先，通过对目标蛋白质进行免疫反应，用特异性的抗体与目标蛋白质形成抗原-抗体复合物。
然后，将抗体与目标蛋白质的复合物与磷酸化的蛋白质、蛋白质复合物或其他特定蛋白质结合，形成更大的复合物。
最后，通过沉淀这些复合物，从而使复合物分离于整个细胞提取物中。
1.固相免疫共沉淀：该方法使用固相支持材料，如蛋白A或蛋白G结合的琼脂糖磁珠或亲和树脂柱。
首先，将目标蛋白质与特异性抗体免疫反应，然后将抗体与蛋白A或蛋白G结合的支持材料结合。
接下来，将细胞提取物与抗体-蛋白质复合物和支持材料一起孵育。
随后，用磁力或离心将复合物分离，并通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质。
最后，用洗涤液溶解复合物，并通过离心或磁力分离来收集目标蛋白质及其相互作用伴侣。
2.液相免疫共沉淀：该方法使用溶液中的特异性抗体与目标蛋白质进行免疫反应。
首先，将目标蛋白质与特异性抗体免疫反应，然后添加蛋白A或蛋白G结合的琼脂糖磁珠或亲和树脂，形成抗体-蛋白质复合物。
接下来，将细胞提取物加入到抗体-蛋白质复合物中，使复合物与目标蛋白质的相互作用伴侣结合。
随后，用磁力或离心将复合物分离，并通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质。
最后，用洗涤液溶解复合物，并通过离心或磁力分离来收集目标蛋白质及其相互作用伴侣。
1.直接鉴定特定蛋白质的相互作用伴侣。
2.可以识别特定蛋白质的翻译后修饰形式，如磷酸化、乙酰化等。
3.可以从复杂的细胞提取物中寻找目标蛋白质的结合伴侣。
然而，免疫共沉淀试验也存在一些局限性，包括：1.需要具有较高特异性的抗体。
2.可能产生伪阳性结果，特别是在存在非特异性结合的情况下。
3.难以从细胞提取物中完全分离复合物。
总结：免疫共沉淀试验是一种常用的实验技术，可以用于寻找细胞中特定蛋白质的相互作用伴侣或靶向蛋白的修饰形式。
根据不同的实验需求，可以选择固相免疫共沉淀或液相免疫共沉淀方法进行。
检测两种蛋白质之间相互作用
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较1. 生化方法●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。
缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。
另外灵敏度不如亲和色谱高。
●Far-Western又叫做亲和印记。
将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。
缺点是转膜前需要将蛋白复性。
2. 等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。
当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。
而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。
该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。
缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。
3. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。
分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。
缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。
融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。
不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。
5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（<100埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。
荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。
它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。
免疫共沉淀原理及实验方法
免疫共沉淀原理及实验方法1.利用抗体的高度特异性与抗原结合，将抗原特异性地富集。
2.抗原-抗体复合物与磁珠或珠标记结合，通过磁力或离心作用将复合物分离沉淀下来。
1.材料准备：准备所需的细胞或组织样品，以及抗体、磁珠或珠标记等实验试剂。
2.细胞或组织提取：将细胞或组织样品裂解，并用适当的缓冲液重悬，获得蛋白质提取液。
3.抗体结合：将蛋白质提取液与所需的抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
4.沉淀：将磁珠或珠标记加入抗原-抗体复合物中，使其结合，再利用磁力或离心作用将复合物沉淀下来。
5.洗涤：用适当的缓冲液洗涤沉淀物，去除非特异性的蛋白质。
6. 分离与检测：将沉淀物分离出来并进行进一步的分析、检测，如Western blotting、质谱分析等。
1.高特异性：通过使用特异性抗体，可以选择性地沉淀目标蛋白质，减少非特异性的干扰。
2.高灵敏度：沉淀后的蛋白质富集度高，有利于进一步的鉴定和分析。
3.可用于分析蛋白质相互作用：通过免疫共沉淀技术，可以研究蛋白质与其他分子的相互作用关系，揭示机体内蛋白质功能和信号传导的调控机制。
免疫共沉淀技术在生命科学研究中扮演着重要的角色。
例如，通过免疫共沉淀可以研究蛋白质与DNA、RNA或其他蛋白质的相互作用关系，从而了解基因调控、信号传导和代谢途径等重要生物学过程的调控机制。
此外，免疫共沉淀还可以用于筛选靶蛋白质、鉴定疾病标志物，以及评估一些药物对蛋白质相互作用的影响。
综上所述，免疫共沉淀技术是一种重要的实验方法，通过利用特异性抗体与所要研究的蛋白质结合，实现蛋白质的富集、分离和鉴定。
该技术广泛应用于细胞生物学、分子生物学和疾病研究等领域，对揭示分子相互作用、信号传导机制和疾病发生发展具有重要意义。
免疫荧光共沉淀
免疫荧光共沉淀免疫荧光共沉淀（immunofluorescence co-precipitation）是一种广泛应用于研究蛋白质之间相互作用的生物学技术。
它结合了免疫印迹、荧光探针和共沉淀技术的优点，能够以高灵敏度和特异性检测复杂蛋白质间的相互作用，为研究蛋白质的结构、功能和调控提供了有力的手段。
在免疫荧光共沉淀实验中，首先需要将待检测蛋白质与外源的抗体结合，然后添加亲和纯化后的荧光标记抗体，使其与已结合的抗原结合形成复合物。
通过它们在复合物中的相互位置和强度来检测它们之间的相互作用。
共沉淀技术可以将蛋白质从细胞提取至溶液中，并去除非特异性相互作用，从而检测被共沉淀的细胞内蛋白质与断路器（BCL-2）家族蛋白的相互作用。
免疫荧光共沉淀分为直接法和间接法两种。
直接法将荧光标记抗体与外源抗体同时加入样品中，形成抗原-外源抗体-荧光标记抗体复合物，直接反映出待检测蛋白质与指定蛋白质之间的相互作用。
间接法则先使用外源抗体纯化蛋白质，然后再将荧光标记抗体与纯化后的蛋白质结合，形成荧光标记的复合物，最后通过BCL-2家族蛋白的免疫荧光共沉淀来检测其与蛋白质之间的相互作用。
免疫荧光共沉淀的优点在于，能够在任意的数量程度下检测蛋白质之间的相互作用，准确、快速、灵敏，同时样品要求较低，价格合理等等，所以已经被广泛应用于研究蛋白质之间的相互作用，如蛋白质复合体的组成、分子信号途径和细胞因子等方面，对于研究和治疗某些生物学疾病，具有重要的价值。
但是，免疫荧光共沉淀也存在一些不足之处，如易受实验条件的影响，信号容易受到背景噪声的影响等，所以需要在实验前严格控制试验条件，以减小这些不足之处的影响。
总之，免疫荧光共沉淀是一种重要的生物学技术，它可用于研究蛋白质之间的相互作用，提供了高灵敏度和特异性的蛋白质定位和检测。
在实验前应该注意控制试验条件，以减小不足之处的影响，从而得到更为准确和可靠的结果。
随着技术和科学的不断进步和发展，分子生物学的研究将更加深入和具有生物学应用实践的原创性的价值。
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利用免疫共沉淀验证HT036与P311间的相互作用利用免疫共沉淀验证HT036与P311间的相互作用袁顺宗1,2*,彭旭1,2*,马兵1,2,王庆红1,2,易绍萱1,2,贺伟峰1,2,陈希炜1,2,胡晓红1,2,张小容1,2,周丽娜1,2,罗高兴1,2,吴军1,2 (第三军医大学西南医院:1全军烧伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,2疾病蛋白质组学重庆市市级重点实验室,重庆400038)提要:目的利用免疫共沉淀技术验证未知蛋白HT036(hypothetical protein, HT036)和P311间的相互作用。
方法构建能在哺乳动物细胞中表达带HA标签的HT036融合蛋白(HA-HT036)的重组载体pCMV-HA-HT036,经酶切鉴定正确后,和表达带Myc标签的P311融合蛋白(Myc-P311)的重组真核表达载体pCMV-Myc-p311,单独或者共转染人293细胞,利用免疫共沉淀技术验证HT036与P311间的相互作用。
结果构建的重组表达载体pCMV-HA-HT036经双酶切鉴定正确,转染293细胞,抗Myc单克隆抗体沉淀Myc-P311相互作用蛋白复合物后,用抗HA单克隆抗体进行Western blot检测,可以检测到HA-HT036的表达。
结论成功构建了HA-HT036融合蛋白真核表达重组载体,在哺乳动物细胞中表达后利用免疫共沉淀技术证实HT036与P311之间存在着相互作用。
关键词: HT036; P311;载体构建;免疫共沉淀;相互作用中图法分类号:Q503;Q51;TQ93文献标识码:AIdentification of interaction between HT036 and P311 by co-immunoprecipitationYUAN Shun-zong1,2,PENG Xu1,2,MA Bing1,2,WANGQing-hong1,2,YIShao-xuan1,2,HEWei-feng1,2,CHEN Xi-wei1,2,HU Xiao-hong1,2,ZHANG Xiao-rong1,2,ZHOU Li-na1,2,LUO Gao-xing1,2,WU Jun1,2(State Key Laboratory ofTrauma,Burns and Combined Injury,Institute ofBurns,SouthwestHospital,Third MilitaryMedicalUniversity,2Chongqing Key Lab forMedical Pro-teomics,Chongqing 400038,China)Abstract:Objective To explore the interactionbetweenHT036(hypotheticalproteinHT036)and P311 by co-immunoprecipitation.Methods HA-tagged fusion protein(HA-HT036)expression vectorwas construc-ted,identified and transfected into human embryo kidney 293(HEK293)cells alone orwithMyc-tagged fusion protein(Myc-P311)expression vectorpCMV-Myc-p311. The interaction between P311 andHT036 was detec-ted by co-immunoprecipitation.Results Double restriction enzyme digestion showed that pCMV-HA-HT036 was constructed correctly. When Myc-P311 was immunoprecipitated by anti-Myc antibody,HA-HT036 was identified byWestern blottingwith anti-HA antibody from immunoprecipitated complex.Conclusion The re-combinantvector pCMV-HA-HT036 was constructed successfully. The interaction between HT036 and P311 could be identified by co-immunoprecipitation after co-expression of pCMV-HA-HT036 and pCMV-Myc-p311.The resultprovides an importantbasis for further study of theintracellular signal transduction ofP311.Key words:HT036;P311;expression vector construction;co-immunoprecipitation;protein-proteininteractionP311基因是本研究小组利用基因芯片技术从早期增生性瘢痕组织中筛选出的显著高表达的差异基因[1],同时Pan等[2]的研究证实P311蛋白在创伤愈合早期表达于肌成纤维细胞内,并且P311基因转染成纤维细胞后能够促进成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞,提示P311可能在创伤纤维化修复以及增生性瘢痕发生发展过程中起着重要作用,故我们将其列为增生性瘢痕相关的新候选蛋白。
然而P311促成纤维细胞-利用免疫共沉淀验证HT036与P311间的相互作用肌成纤维细胞转分化的分子机制尚不清楚,因此我们又利用酵母双杂交技术对P311的相互作用蛋白进行了初步筛选,获得了一个能与P311发生相互作用的新蛋白———未知蛋白HT036[3]。
在此基础上,为了在活体细胞内进一步证实HT036与P311间的相互作用,我们分别构建了P311的融合蛋白Myc-P311和HT036的融合蛋白HA-HT036的表达载体pCMV-Myc-p311和pCMV-HA-HT036,共转染HEK293细胞后,利用免疫共沉淀验证P311与HT036间是否存在着相互作用。
1 材料与方法1. 1 菌种、质粒和试剂大肠杆菌DH5α、含P311基因序列的重组载体pCMV-Myc-p311和含HT036编码序列的重组载体pACT2-HT036均为本研究小组保存试剂。
pCMV-HA载体、Myc单抗和HA多抗均购自Clontech公司,HRP标记的羊抗兔IgG及化学发光液购自博士德公司,细胞裂解液RIPA购自Santa Cruz公司, PVDF膜购自Millipore公司,蛋白标准品Biotinylated Protein Ladder)及其检测抗体(Anti-biotinHRP-linked antibody)购自康成公司,分子生物学操作所用工具酶购自TaKaRa公司,质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Omega公司,胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxford公司,琼脂粉、琼脂糖等购自上海生工, DMEM购自Gibco公司,转染剂Lipofetamine 2000购自Invitrogen公司。
1. 2 方法1. 2. 1 重组载体pCMV-HA-HT036的构建分别根据pACT2-HT036和空载体pCMV-HA的特点,进行SfiⅠ和XhoⅠ双酶切; 0. 6%琼脂糖凝胶电泳酶切产物后,紫外灯下分别切割含目的片段和载体的凝胶,用胶回收试剂盒进行回收;T4DNA连接酶分别连接胶回收产物(16℃, 1 h)并转化连接产物至DH5α,挑取单菌落进行质粒扩增,用SfiⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定连接产物,并用0. 8%琼脂糖凝胶电泳酶切产物。
1. 2. 2 细胞转染按2×105/孔接种HEK293细胞至六孔板中,待细胞长至90%融合时共转染pCMV-Myc-p311和pC-MV-HA-HT036,以pCMV-Myc-p311和pCMV-HA-HT036的分别转染为对照组。
具体方法:①将10μgDNA用250μl不含抗生素的无菌无血清DMEM稀释并混匀后,室温孵育5 min。
②用240μl不含抗生素的无菌无血清DMEM稀释10μl Lipo-fectamine 2000并混匀后,室温孵育5 min。
③将①和②中混合液进行混和即成转染混合液,室温孵育15 min。
④将六孔板中培养基换用1 ml不含抗生素的无菌无血清DMEM,加入转染混合液,并轻柔混匀,置于CO2培养箱中(37℃, 5% CO2)孵育。
⑤4 h后,弃去培养基,换用含10%小牛血清之DMEM继续培养。
1. 2. 3 免疫沉淀反应转染48 h后,弃去培养基,在冰上进行后续操作。
刮下细胞,用冷PBS液冲洗2遍,离心,弃上清,加入100μlRIPA,冰浴30 min,加入1μg小鼠抗Myc单克隆抗体, 4℃旋转混合2 h,加入20μl蛋白A,继续混合12 h,离心,去上清后,用RIPA洗沉淀3遍,加入20μl 2×Tricine SDS-PAGE上样缓冲液,煮沸5 min,稍离心后,立即进行电泳。
1. 2. 4 Western blot检测用10%Tricine SDS-PAGE胶对样品进行电泳,每孔上样量为20μ,l蛋白标准品上样量为10μ,l用半干电转仪转膜后, 5%脱脂奶粉封闭1 h,然后加入1∶2 000稀释的兔抗HA多克隆抗体, 4℃过夜孵育后, 0. 1% TBST洗膜, 3次, 5 min/次,加入1∶10 000稀释的羊抗兔IgG和1∶10 000稀释的蛋白标准品检测抗体,室温孵育30 min,洗膜,方法同前,根据操作说明,加入化学发光液,于Bio-Rad凝胶成像仪中进行显影。
2 结果2. 1 重组载体pCMV-Myc-p311和pCMV-HA-HT036的鉴定经酶切、电泳后获得的图谱显示(图1),近250 bp处的条带为酶切后的目的片段P311编码基因(图1,条带2),近700 bp处的条带为酶切后的目的基因HT036(图2,条带3),表明pCMV-Myc-p311和pCMV-HA-HT036分别构建成功。
实验重复3次,结果均一致。
1:DNA标准(DL2000);2:pCMV-Myc-p311酶切;3:pCMV-HA-HT036酶切图1 pCMV-M yc-p311和pCMV-HA-HT036重组载体酶切后的琼脂糖凝胶电泳图2. 2 免疫共沉淀结果pCMV-Myc-p311和pCMV-HA-HT036共转染HEK293细胞48 h后,提取蛋白,沉淀P311及与其相互作用的蛋白复合物,并进行Western blot检测(图2)。