重组L_天冬酰胺酶的鉴定_吴敬

重组L2天冬酰胺酶的鉴定吴　敬　吴梧桐　赖龙生　刘景晶 摘　要　目的:对重组L2天冬酰胺酶进行鉴定。

方法:用基因测序、氨基酸组成分析、N2末端氨基酸测序、胰肽图谱、IEF、分子量、紫外扫描等各种实验手段对重组L2天冬酰胺酶及其天然品进行了全面比较。

结果:重组产品与天然品具有同质性。

结论:重组L2天冬酰胺酶具有较好的应用前景。

关键词　L2天冬酰胺酶,鉴定 中图分类号　R392233Appraisal of R ecombinant L2asparaginaseWu Jing,Wu Wutong,Lai Longsheng,Liu JingjingDepart ment of B iochem ist ry,Chi na Pharm aceutical U niversity(N anji ng210009)Abstract　Purpose:To give an appraisal of recombinant L2asparaginase.Methods:Various analytical techniques including gene sequencing,amino acid composition,analysis of N2terminal amino acid analy2 sis,peptide mapping,IEF,molecular weight and UV2scanning were used.R esults:The recombinant L2 asparaginase had the same quality as that of native products.Conclusion:The application of recombi2 nant L2asparaginase was promising.K ey w ords　L2asparaginase,Appraisal 由于遗传学转录和翻译后水平的变化、生产和纯化过程的改变,工程菌表达的重组产品与天然品比较可能会发生结构、生物学和免疫学的某些变化。

因此,重组产品的质控除保证生物活性和常规的安全性外,还应保证重组产品与天然品的同质性、各批产品的一致性,严格限制有关杂质的含量,这样才能确保产品的安全有效[1]。

L2天冬酰胺酶是一种重要的抗肿瘤药物,临床上广泛用于治疗白血病[2]。

近年来,我们实验室构建了高效表达该酶的基因工程菌并建立完善了其中试生产工艺[3]。

为综合评价重组L2天冬酰胺酶的质量,本文从多方面考察了重组产品与天然品的同质性。

1　材　料1.1　菌种 国家医药管理局九五攻关项目(960432084) 作者单位　210009　南京,中国药科大学生化教研室 收稿日期　1999210214　修回日期　2000202222 重组基因工程菌 E.coli P KA/CPU210009、野生菌 E.coli CPU210009,本室。

1.2　酶与试剂天然品L2天冬酰胺酶,常州生化千红制药有限公司;重组L2天冬酰胺酶,本室提供;胰蛋白酶(序列分析纯),德国宝灵曼公司;三氯乙酸,美国Merck 公司。

1.3　仪器ABI PRISM TM377DNA Sequencer,日本;Beckman porton LF3200protein/peptide,美国;Perkin2elmer lambda UV/VIS speltrumeter,日本;Pharmacia L K B multiphorⅡ,美国;日立835250型氨基酸分析仪。

2　方　法2.1　重组质粒测序从工程菌中提取质粒,用Nco I、HindⅢ酶切,经电泳证明有插入片段,以此质粒上的相关基因正反测序。

测序使用引物:R Primer(ZG259b)5′2G A GCGG A TAACAA TT TCACACA GG23′F Primer(ZG259b)5′2GCTTCTGCGTTCTG A TTTAA23′R15′2TAA TCGTGGCGTGCTGGT23′R25′2ACCA GCACGCCACG A TTA23′2.2　野生菌 E.coli CPU210009的产酶基因测序测序使用引物:　ZG284P1　5′GCACTTGCCGCACTGGTT23′　ZG284P2225′2GCTTG A G AA TGCCGTG A T23′　ZG259R1　5′2TAA TCGTGGCGTGCTGGT23′　ZG259R2　5′2ACCA GCACGCCACG A TTA23′以ZG284P1、ZG284P222对细菌染色体进行PCR 扩增,PCR产物经精制后,使用Bigdye试剂盒顺序。

2.3　肽图分析样品的处理　样品经脱盐、冻干,1%N H4HCO3溶解至1.0mg/ml,按1∶30(W/W)加入胰蛋白酶, 37±0.5℃保温16h,50%冰醋酸终止反应备用。

色谱条件　流动相:A为0.1%TFA水,B为0.1%TFA,乙腈∶水(80∶20)。

梯度:0～60min,B:0～30%;60～120min,B:30%～38%;120～175,B: 38%～80%。

流速:0.2ml/min;上样量:自动进样50μl;检测波长:210nm。

2.4　SDS2PA GE电泳、等电聚焦电泳按参考文献[4]方法进行。

2.5　氨基酸组成分析酸解:6mol/L HCl,110℃,18h;碱解:4mol/L NaOH,110℃,18h;Cys采用过甲酸氧化成半胱磺野生菌#001TTA CCC AAT ATC ACC ATT TTA GCA ACC GGC GGG ACC ATT GCC GGT GGT GGT GAC TCC GCA 质　粒TTA CCC AAT ATC ACC ATT TTA GCA ACC GGC GGG ACC ATT GCC GGT GGT GGT GAC TCC GCA #061ACC AAA TCT AAC TAC ACA GCG GGT AAA GTT GGC GTA GAA AAT CTG GTT AAT GCG GTG CCG ACC AAA TCT AAC TAC ACA GCG GGT AAA GTT GGC GTA GAA AAT CTG GTT AAT GCG GTG CCG #121CAA CTA AAA GAC ATT GCG AAC GTT AAA GGC GAG CAG GTA GTG AAT ATC GGC TCC CAG GAC CAA CTA AAA GAC ATT GCG AAC GTT AAA GGC GAG CAG GTA GTG AAT ATC GGC TCC CAG GAC #181ATG AAC GAT AAT GTC TGG CTG ACA CTG GCG AAA AAA ATT AAC ACC GAC TGC GAT AAA ACC ATG AAC GAT AAT GTC TGG CTG ACA CTG GCG AAA AAA ATT AAC ACC GAC TGC GAT AAA ACC #241GAC GGC TTC GTC ATT ACC CAC GGT ACC GAC ACG ATG GAA GAA ACC GCT TAC TTC CTC GAC GAC GGC TTC GTC ATT ACC CAC GGT ACC GAC ACG ATG GAA GAA ACC GCT TAC TTC CTC GAC #301CTG ACG GTG AAA TGC GAC AAA CCG CTG GTG ATG GTC GGC GCA ATG CGC CCG TCC ACG TCC CTG ACG GTG AAA TGC GAC AAA CCG CTG GTG ATG GTC GGC GCA ATG CGC CCG TCC ACG TCC #361ATG AGC GCA GAC GGA CCA TTC AAC CTG TAT AAC GCG GTA GTG ACC GCA GCT GAT AAA GCC ATG AGC GCA GAC GGA CCA TTC AAC CTG TAT AAC GCG GTA GTG ACC GCA GCT GAT AAA GCC #421TCC GCT AAT CGT GGC GTG CTG GTG GTG ATG AAC GAC ACC GTA CTG GAC GGT CGC GAT GTC TCC GCT AAT CGT GGC GTG CTG GTG GTG ATG AAC GAC ACC GTA CTG GAC GGT CGC GAT GTC #481ACC AAA ACC AAC ACC ACC GAC GTA GCG ACC TTC AAG TCT GTT AAC TAC GGT CCT CTG GGA ACC AAA ACC AAC ACC ACC GAC GTA GCG ACC TTC AAG TCT GTT AAC TAC GGT CCT CTG GGA #541TAC ATT CAC AAC GGT AAG ATT GTC TAC CAA CGT ACC CCG GCA CGT AAG CAC ACC AGC GAT TAC ATT CAC AAC GGT AAG ATT GTC TAC CAA CGT ACC CCG GCA CGT AAG CAC ACC AGC GAT #601ACG CCA TTC GAT GTC TCT AAG CTG AAT GAG CTG CCG AAA GTC GGC ATC GTT TAT AAC TAC ACG CCA TTC GAT GTC TCT AAG CTG AAT GAG CTG CCG AAA GTC GGC ATC GTT TAT AAC TAC #661GCT AAC GCA TCC GAT CTT CCG GCT TTA GCA CTG GTA GAT GCG GGC TAT GAT GGC ATC GTT GCT AAC GCA TCC GAT CTT CCG GCT TTA GCA CTG GTA GAT GCG GGC TAT GAT GGC ATC GTT #721AGC GCT GGT GTG GGT AAT GGT AAC CTG TAT AAA TCC GTG TTC GAC ACC CTG GCA ACC GCC AGC GCT GGT GTG GGT AAT GGT AAC CTG TAT AAA TCC GTG TTC GAC ACC CTG GCA ACC GCC #781GCG AAA AAC GGC ACT GCA GTA GTG CGT TCT TCC CGC GTA CCG ACG GGT GCT ACC ACT CAG GCG AAA AAC GGC ACT GCA GTA GTG CGT TCT TCC CGC GTA CCG ACG GGT GCT ACC ACT CAG #841GAT GCT GAA GTG GAT GAT GCG AAA TAC GGC TTC GTC GCC TCT GGC ACG CTG AAC CCG CAA GAT GCT GAA GTG GAT GAT GCG AAA TAC GGC TTC GTC GCC TCT GGC ACG CTG AAC CCG CAA #901AAA GCG CGC GTC CTG CTG CAG CTG GCT CTG ACC CAA ACC AAA GAT CCG CAG CAG ATC CAG AAA GCG CGC GTC CTG CTG CAG CTG GCT CTG ACC CAA ACC AAA GAT CCG CAG CAG ATC CAG #961CAG ATC TTC AAT CAG TACCAG ATC TTC AAT CAG TAC图1　重组质粒和野生菌的测序结果酸后6mol/L HCl ,110℃,18h 测定。