第四章电泳图谱的图像分析及蛋白质消化技术
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浅谈蛋白质质谱分析
浅谈蛋白质质谱分析方法及应用董义龙(单位：毕节学院，化学与化学工程学院，2009级化学教育本科三班,学号:06320904031）摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要的综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点，方法及蛋白质质谱分析的原理，方式和应用，并对其发展前景着出展望。
关键词：蛋白质质谱分析原理与方法蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上。
作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行，调节代谢，抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此，蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。
关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。
随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。
1 蛋白质组学研究的背景和意义1．1蛋白质组学的产生20世纪90年代开始的人类基因组计划(}Iuman Genome Project，HGP)是人类有史以来最伟大的认识自身的世纪工程，旨在阐明人类基因组DNA3×109核苷酸序列，希望在分子水平上破译人类所有的遗传信息。
经过各国科学家十几年的努力，HGP已取得了巨大的成绩。
在揭示基因组精细结构的同时，也凸现了基因数量有限性和基因结构的相对稳定性，这与生命现象的复杂和多交性之间存在着巨大的反差。
这种反差促使人们认识到：基因只是遗传信息的载体。
要研究生命现象，阐释生命活动的规律，只了解基因组的结构是远远不够的。
对于生命活动的主要体现者——蛋白质进行更全面和深入的研究是目前生命科学研究的迫切需要和重要任务。
后因组时代中功能基因组(Functional Genomics)的研究采用一些新的技术，如微阵列，DNA芯片对成千上万的基因表达进行分析比较，并从基因整体水平上对基因的活动规律进行阐述。
电泳分析法ppt课件
capillary zone electrophoresis ，CZE
带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流 出； 阴离子：两种效应的运动方向相
反；ν
电渗流
>ν
电泳时,阴离子在负极
最后流出,在这种情况下,不但可以按 类分离,同种类离子由于差速迁移被 相互分离。 最基本、应用最广的分离模式；
六、毛细管电泳的进样方式
injection method of HPCE
进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小；
1. 流体力学进样方式
（1）进样端加压
（2）出口端抽真空
（3）虹吸进样
2. 电动进样方式
毛细管一端插入样品瓶，加电压；
2 （ ) V π r ct eo ef 进样量 t L
板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。
高效毛细管电泳(CE)
2018/11/13
分离过程
电场作用下，毛细
管柱中出现：电泳现 象和电渗流现象。
带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反。ν 电渗流 >ν 电泳时,阴 离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中 性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被 相互分离。
（3）电场强度程序控制系统；
（4）电压稳定性：0.1%； （5）电源极性易转换；
2. 毛细管柱
（1）材料：石英：各项 性能好；玻璃：光学、机 械性能差； （2）规格：内径20～ 75μ m，外径350～400μ m； 长度≦1m
带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流 出； 阴离子：两种效应的运动方向相
反；ν
电渗流
>ν
电泳时,阴离子在负极
最后流出,在这种情况下,不但可以按 类分离,同种类离子由于差速迁移被 相互分离。 最基本、应用最广的分离模式；
六、毛细管电泳的进样方式
injection method of HPCE
进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小；
1. 流体力学进样方式
（1）进样端加压
（2）出口端抽真空
（3）虹吸进样
2. 电动进样方式
毛细管一端插入样品瓶，加电压；
2 （ ) V π r ct eo ef 进样量 t L
板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。
高效毛细管电泳(CE)
2018/11/13
分离过程
电场作用下，毛细
管柱中出现：电泳现 象和电渗流现象。
带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反。ν 电渗流 >ν 电泳时,阴 离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中 性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被 相互分离。
（3）电场强度程序控制系统；
（4）电压稳定性：0.1%； （5）电源极性易转换；
2. 毛细管柱
（1）材料：石英：各项 性能好；玻璃：光学、机 械性能差； （2）规格：内径20～ 75μ m，外径350～400μ m； 长度≦1m
生物化学技术__电泳_PPT教案
固定和谱带检测
固定：7%乙酸或12.5%三氯乙酸 谱带检测
染色法 荧光探针法 特殊试剂染色法
根据支持介质形状不同，可分为： •薄层电泳 •板电泳 •柱电泳
• 据用途不同，可分为： •分析电泳 •制备电泳 •定量电泳 •免疫电泳
第一节 电泳的基本原理
▪ 电泳是在电场作用下产生的物质运动。
在一定的电场强度下，带电颗粒(分子)在电 场中的迁移方式主要依据分子大小和形状、分 子所带电荷或分子的生物学与化学特性。
核黄素经光照后再被痕量氧氧产生自由基， 引发聚合反应。
丙烯酰胺聚合时常用的催化系统
引发剂
过硫酸铵 （AP）
加速剂 N,N,N′,N′-四甲基乙二胺 （TEMED）
3-二甲胺丙腈
3-二甲胺丙腈亚硫酸盐
应用范围 AP
酸性系统
核黄素
TEMED
碱性系统 （光聚合）
化学聚合与光聚合的比较
加样需注意
制备样品时，离子浓度不宜太高 蔗糖浓度小于20% 样品液中的沉淀和混浊需除去 阴离子系统用溴酚蓝作指示剂，负极在上；
阳离子系统用甲基绿或次甲基绿作指示剂， 正级在上。
一般操作
步骤：
摆好玻璃管 制备分离胶 预电泳：除去AP、未聚合丙烯酰胺、杂质 制备浓缩胶 加样 电泳：先低电流，样品进胶后，调至所需电流 取胶 固定和谱带检测 迁移率测定 谱带保存
微量TEMED的加入，可使过硫酸铵形成自由基，这些 自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、 交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺凝胶。
化学催化——酸性系统
引发剂：过硫酸铵(AP) 过氧化氢
加速剂：硫酸亚铁-抗坏血酸（Vc)
光聚合催化系统
引发剂：核黄素 加速剂：TEMED可以加速聚合
蛋白质电泳分析PPT课件
蛋白质组学研究
蛋白质电泳分析在蛋白质组学研 究中具有重要作用，可用于分离 和鉴定蛋白质，揭示蛋白质的表
达模式和功能。
生物标志物发现
通过蛋白质电泳分析，可以发现 与疾病相关的生物标志物，有助
于疾病的早期诊用于药物靶点 的筛选和验证，以及药物作用机
制的研究，有助于新药研发。
绝对定量
通过灰度扫描电泳图谱中蛋白质条带， 可以计算出各蛋白质条带的相对含量。
通过标准品或已知浓度的蛋白质样品， 可以建立标准曲线，从而对未知浓度 的蛋白质样品进行绝对定量分析。
相对定量
通过比较不同样品中蛋白质条带的灰 度值或亮度，可以计算出各蛋白质的 相对表达量。
04
蛋白质电泳分析的优缺点
优点
03
蛋白质电泳分析结果解读
电泳图谱的解读
01
02
03
蛋白质分子量标准
电泳图谱中通常会有一条 蛋白质分子量标准，用于 参考和标定蛋白质的分子 量。
蛋白质条带位置
通过观察电泳图谱中蛋白 质条带的位置，可以判断 蛋白质的迁移率和分子量 大小。
蛋白质表达量
通过比较不同样品中蛋白 质条带的亮度或密度，可 以判断蛋白质的表达量。
在食品安全和检测领域的应用前景
食品成分分析
蛋白质电泳分析可用于食品中蛋白质的鉴定和含 量测定，确保食品质量和安全。
污染物检测
蛋白质电泳分析可以检测食品中的有害物质和污 染物，如农药残留、重金属等。
转基因食品检测
通过蛋白质电泳分析，可以检测转基因食品中的 外源蛋白质，保障消费者权益。
THANKS
感谢观看
蛋白质电泳分析PPT 课件
目录
• 蛋白质电泳分析概述 • 蛋白质电泳分析实验操作 • 蛋白质电泳分析结果解读 • 蛋白质电泳分析的优缺点 • 蛋白质电泳分析展望
107652-生物药物分析与检验-第四章电泳技术
• 迁移率：带电颗粒在电场中的泳动速度。
➢电泳迁移率（m）是指单位电场强度下的 迁移速度，即m＝v/E＝q/ 6πrη，m与q成 正比，而与r,η成反比
• 影响迁移率的因素 • 1、带电颗粒的性质； • 2、缓冲液的性质； • (1), pH值；（2），离子强度； • 3、电场强度； • 4、溶液的温度和黏度； • 5、电渗作用； • 6、分子筛效应。
三、PAGE的浓度与孔径的关系
PAGE孔径的大小主要由Acr和Bis这两种 单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子 的大小，选择合适的单体浓度。 Acr/Bis：20~40 完全透明且有弹性；
＜10 很脆，易碎，不透明； ＞100 糊状不成形，易破碎。
凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和 Bis的总克数。
琼脂糖凝胶电泳
➢ 可以分离长度为100bp至近60kb的 DNA分子
➢ 琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同 相对分子质量的DNA，也可以分离
相对分子质量相同，但构型不同的 DNA分子
OCDNA LDNA
CCCDNA
➢ EB：即溴化乙锭，它能够插入DNA 分子中的碱基对之间而与DNA结合。 由于EB分子的插入，在紫外光的照 射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现
缓冲液
聚合成小孔胶
分离原理
1. 浓缩效应 1）凝胶层的不连续性
两层凝胶T与C不同孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大 孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。
2）缓冲液离子成分的不连续性
甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移 动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度 （）很小，有效迁移率（M ）很低，移 动速度较慢，称为慢离子。
五、实验操作
蛋白质双向电泳
还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还 原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。 常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷 的三丁基膦（TBP）进行还原。
起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表 面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在 盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否 则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。
双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
• 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括 多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。
• 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 • 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰
（如酶性或化学性降解等）。 • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证
100~300 g/300 1~3mg/300 l l
IPG IEF 中pH梯度的选择
• 常用方法：先宽后窄，先线性后非线性， 先短后长，预试验确定。
预分步 收集
细胞浆
细胞核 细胞膜
核糖体及其他 特定细胞成份
细胞分 泌成份
第一步
pH4-12
pH3-10
3倍
第二步 pH3-6
3倍
第 pH3 pH4
IPG胶条的重泡胀
• 泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形 式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF。
• 不同的加样方法和加样量会导致最终结果的 差异：
• Protean IEF cell、IPGphor等集成设备的使 用：
• 20mmol/L DTT 垫片的使用： • 温度的选择：
蛋白载样量
三
-4 -5
步
pH4-7
pH5 pH6 -6 -7
起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表 面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在 盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否 则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。
双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
• 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括 多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。
• 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 • 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰
（如酶性或化学性降解等）。 • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证
100~300 g/300 1~3mg/300 l l
IPG IEF 中pH梯度的选择
• 常用方法：先宽后窄，先线性后非线性， 先短后长，预试验确定。
预分步 收集
细胞浆
细胞核 细胞膜
核糖体及其他 特定细胞成份
细胞分 泌成份
第一步
pH4-12
pH3-10
3倍
第二步 pH3-6
3倍
第 pH3 pH4
IPG胶条的重泡胀
• 泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形 式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF。
• 不同的加样方法和加样量会导致最终结果的 差异：
• Protean IEF cell、IPGphor等集成设备的使 用：
• 20mmol/L DTT 垫片的使用： • 温度的选择：
蛋白载样量
三
-4 -5
步
pH4-7
pH5 pH6 -6 -7
双向凝胶电泳的图像分析解读
• 对点的体积进行归一化处理，以便于对不 同胶上的同一蛋白质点进行准确客观的相 对定量。 • 所有点的含量通过单个点的光密度值比上 胶上所有点光密度值 • 归一化处理后的数据是否合理决定着图像 分析数据统计学分析的可靠性。
第五节 凝胶配比分析
一、原因 通过多次凝胶电泳的结果提高实验的可靠性，就 需要进行不同凝胶间斑点的配比分析。 包括：凝胶的匹配和斑点的比较 匹配的目的是为了对已经进行了点检测的凝胶之 间找出代表同一蛋白质的点。匹配过程能把位于不 同凝胶上的同一蛋白质点联系起来，比较则是在不 同凝胶上对同一蛋白质点的蛋白质进行不同凝胶上 的蛋白质表达情况的分析。
三、数字化图像加工
图像增强：平滑操作、增强对比度、边缘 检测和背景消减是图像加工最熟悉的工具。 例如：在双向电泳凝胶的数字化图像上分 析蛋白质斑点。平滑操作、增强对比度、边缘 检测和背景消减是以一种精确的方式来决定蛋 白质斑点的形状和大小。在某些领域，这些操 作主要用于图像增强，以提高图像的光学质量， 分析科学可依靠这些操作提供明确的数据。
二、图像分析流程
双向电泳图谱经扫描或摄影等转换为像素为基础、 具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点的电脑信号。
典型流程：
• • • • • • • 凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递（report） 2-DE数据库的建立：
第二节 双向凝胶电泳图像采集
第四节 蛋白质点的检测
一、检测方法 自动执行：软件将在设定的算子大小下根据 凝胶背景等因素确定最佳灵敏度来识别凝 胶中的蛋白质点。 手动执行：首先在整个分析范围内选定一个 代表区域，进入一个有9个格子的小窗口， 在每一个格子中都反映所选代表区域点检 测的执行情况
二、点检测
第五节 凝胶配比分析
一、原因 通过多次凝胶电泳的结果提高实验的可靠性，就 需要进行不同凝胶间斑点的配比分析。 包括：凝胶的匹配和斑点的比较 匹配的目的是为了对已经进行了点检测的凝胶之 间找出代表同一蛋白质的点。匹配过程能把位于不 同凝胶上的同一蛋白质点联系起来，比较则是在不 同凝胶上对同一蛋白质点的蛋白质进行不同凝胶上 的蛋白质表达情况的分析。
三、数字化图像加工
图像增强：平滑操作、增强对比度、边缘 检测和背景消减是图像加工最熟悉的工具。 例如：在双向电泳凝胶的数字化图像上分 析蛋白质斑点。平滑操作、增强对比度、边缘 检测和背景消减是以一种精确的方式来决定蛋 白质斑点的形状和大小。在某些领域，这些操 作主要用于图像增强，以提高图像的光学质量， 分析科学可依靠这些操作提供明确的数据。
二、图像分析流程
双向电泳图谱经扫描或摄影等转换为像素为基础、 具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点的电脑信号。
典型流程：
• • • • • • • 凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递（report） 2-DE数据库的建立：
第二节 双向凝胶电泳图像采集
第四节 蛋白质点的检测
一、检测方法 自动执行：软件将在设定的算子大小下根据 凝胶背景等因素确定最佳灵敏度来识别凝 胶中的蛋白质点。 手动执行：首先在整个分析范围内选定一个 代表区域，进入一个有9个格子的小窗口， 在每一个格子中都反映所选代表区域点检 测的执行情况
二、点检测
蛋白质的质谱分析
徐媛媛1002021001蛋白质的质谱分析摘要：自约翰·芬恩和田中耕一发明了确认生物大分子结构的分析方法及其质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一。
它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施，已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一。
随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点、方法及蛋白质质谱分析的原理、方式和应用，并对其发展前景作出展望。
关键词：蛋白质，质谱分析，应用前言：蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。
关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。
随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。
蛋白质组学是后基因组时代的一个新领域，它通过在蛋白质水平上对细胞或机体基因表达的整体蛋白质的定量研究，来揭示生命的过程和解释基因表达控制的机理。
蛋白质组学分为表达蛋白质组学和细胞图谱蛋白质组学，前者指细胞和组织表达的蛋白质的定量图谱，它依赖二维凝胶电泳图谱和图像分析，它能在整体蛋白质水平上研究细胞的通路，以及疾病、药物和其它生物刺激所引起的紊乱，因此它可能发现疾病标志和阐明生物通路；后者是指通过纯化细胞器或蛋白质复合物，用质谱鉴定蛋白质组分，确定蛋白质和蛋白质相互作用的亚细胞位置。
基本原理：质谱是带电原子、分子或分子碎片按质量的大小顺序排列的图像。
第四章电泳图谱的图像分析及蛋白质消化技术
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在Select Spots Which are 中可以选择 Increased, Increased or Decreased 或者是 Decreased 等，激活选项后可以输入倍数关 系, 默认的是2 times, 可以输入其他数值， 如 3 times。参数设好后就单击go, 在参考胶上就 会出现黄色圈标记的蛋白质斑点，如果你选 择是Increased B>A 2 times, 那么这些黄色圈 标记的蛋白质斑点即为在量上B大于A 两倍的 蛋白质点.
16
二 、斑点检测 (spots detection)
图象采集与加工后就要进行斑点检测， PDQUEST 2-D分析软件通过一个称之为 “蛋白质斑点检测向导（spot identification wizard）”的程序来实现的。
17
单击“spot”菜单，选择“spot identification wizard”程序。 该程序首先需人工设定检测参数如最小斑点、最弱斑点、 最大斑点和背景值,然后程序进行自动检测并可调节检测的 灵敏度，若检测效果不理想，该步骤可反复进行。程序允 许人工调节脱尾（streaks）、背景、斑点（speckles）和其 他一些选项等。 这些参数设好后单击Find spot centers,其结果在凝胶图象 会显示检测到的斑点会用“ 字（Spot Crosshairs）”表示， 检测的蛋白质斑点应尽量与肉眼观测的相符。 在Parameter Set 项输入保存的名称，蛋白质斑点的参数可 被保存，并能用保存的参数自动检测所有2-D凝胶中蛋白质 斑点，单击Process all gels，会出现一个Auto-detect spots窗 口，其中可以选择需要进行斑点检测的凝胶图象（这些凝 胶图像需事先打开）。 蛋白质斑点检测完了之后，软件会自动创建另外两种格式 分别为gel image 和gel spot。
蛋白质分析法ppt课件
2021精选ppt在一个适合的宿主细胞中过量表达重组蛋白质产量的提高大大简化纯化过程通过在基因的5或3端加入6个组氨酸密码子形成纯化的标签可进一步加速纯化进程这使得含有固定金属离子如可与组氨酸结合的ni标签通常对蛋白质的功能没有什么影响2021精选ppt蛋白质测序蛋白质在测序之前首先需要经过水解得到小肽然后用自动蛋白质测序仪用edman降解法测定氨基酸序列2021精选ppt依据凝胶过滤层析将样品蛋白质洗脱时间与已知标准蛋白的洗脱时间相比可给出样品蛋白的近似分子量sds聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于确定单个肽链的大小质谱测定极为精确但上限仅几kda且对蛋白质是破坏性的2021精选pptsds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量2021精选ppt10x衍射晶体学和核磁共振x晶体衍射x射线可与蛋白质中的电子作用得到特有的衍射图谱可用于确定晶体中原子的位臵2021精选ppt11功能分析基于氨基酸一级序列信息利用计算机辅助方法进行蛋白质三维结构预测
X-晶体衍射——X射线可与蛋白质中的电子作用得到 特有的衍射图谱，可用于确定晶体中原子的位置
精品课件
10
功能分析
基于氨基酸一级序列信息，利用计算机辅助方 法进行蛋白质三维结构预测。
同源性分析氨基酸序列具有明显的相似性,这 种相似性称为序列同源性。具有序列同源性的 蛋白质称为同源蛋白质，同源蛋白共有的相似 序列称为共义序列。
通过在基因的5’或3’端加入6个组氨酸密码子， 形成纯化的标签，可进一步加速纯化进程，这 使得含有固定金属离子如可与组氨酸结合的 Ni2+的亲和柱上
标签通常对蛋白质的功能没有什么影响
精品课件
6
蛋白质测序
蛋白质在测序之前首先需要经过水解， 得到小肽，然后用自动蛋白质测序仪用 Edman降解法测定氨基酸序列
X-晶体衍射——X射线可与蛋白质中的电子作用得到 特有的衍射图谱，可用于确定晶体中原子的位置
精品课件
10
功能分析
基于氨基酸一级序列信息，利用计算机辅助方 法进行蛋白质三维结构预测。
同源性分析氨基酸序列具有明显的相似性,这 种相似性称为序列同源性。具有序列同源性的 蛋白质称为同源蛋白质，同源蛋白共有的相似 序列称为共义序列。
通过在基因的5’或3’端加入6个组氨酸密码子， 形成纯化的标签，可进一步加速纯化进程，这 使得含有固定金属离子如可与组氨酸结合的 Ni2+的亲和柱上
标签通常对蛋白质的功能没有什么影响
精品课件
6
蛋白质测序
蛋白质在测序之前首先需要经过水解， 得到小肽，然后用自动蛋白质测序仪用 Edman降解法测定氨基酸序列
电泳图片光密度分析原理与方法
电泳图片光密度分析原理与方法无论是DNA电泳图片还是RNA电泳图片，或者是蛋白的凝胶电泳图片包括Western blot膜、或者是化学发光膜图片，在图像分析的角度来看，都是同样的一种条带光密度分析的问题。
分析电泳条带有专门的一类图像分析软件。
常见的是Bandscan，Quantity One，而由各个凝胶电泳成像系统厂商自己编制的软件就更多了。
其中Labworks是UVP公司生产的凝胶电泳成像系统上配用的拍摄与分析软件，实际上就是传说中大名鼎鼎的gel-pro。
这个软件可以看作是Image-pro plus应用在电泳条带分析上的专业版。
实际上所有的电泳条带分析软件在分析原理与功能上都没什么差别。
只是软件界面与操作程序上各有不同。
所以，了解了条带的分析原理后也就能自己学会各种软件的使用了。
分析电泳条带也是从拍摄电泳照片开始的，用平时的数码相机拍摄的电泳条带一般不能用来进行定量的分析，而必须使用专门的拍摄设备，大家一般称它为“凝胶成像系统”。
它集中了观察，拍摄与分析凝胶的所有功能。
一个凝胶成像系统包括了三个部分，暗箱，相机与电脑上的控制分析程序。
让我们从使用成像系统的操作方法中来了解如何正确地拍摄与分析凝胶吧。
一、暗箱一个最简单的暗箱就是个不透光的箱子里面放了一个紫外灯箱，高级一点的暗箱则有好几组灯光照明。
当然，在箱子上面会有一个安放相机的地方。
紫外灯箱是观察与拍摄凝胶的必需照明设备。
它是用来观察EB染色的凝胶条带的。
里面的紫外灯光能提供256nm,302nm 及365nm的紫外光。
在观察EB的红色荧光条带时，一般用302nm。
在观察与拍摄蛋白凝胶的时候，必须使用透射白光照明。
有的暗箱里会有白板照明灯，平时向上掀起靠在后壁上，使用时拉下来。
简单的暗箱则是用一块荧光板放在紫外灯箱上面，用紫外光照射荧光板，发出白色光。
用白板的透射光照明来拍摄蛋白凝胶的道理有点像医院里用灯箱来观察X光片。
只有在透射光下，才能正确地反映凝胶上条带的光密度分布。
双向凝胶电泳的图像分析ppt课件
• 对点的体积进行归一化处理，以便于对不 同胶上的同一蛋白质点进行准确客观的相 对定量。
• 所有点的含量通过单个点的光密度值比上 胶上所有点光密度值
• 归一化处理后的数据是否合理决定着图像 分析数据统计学分析的可靠性。
第五节 凝胶配比分析
一、原因 通过多次凝胶电泳的结果提高实验的可靠性，就
需要进行不同凝胶间斑点的配比分析。 包括：凝胶的匹配和斑点的比较 匹配的目的是为了对已经进行了点检测的凝胶之
二、算法
是对凝胶中的蛋白质的斑点经扫描后获得的数 据，进行检测、评判和定量分析的过程。
原理：是以每一个像素点为中心构建算子，然 后比较算子中心与边缘的吸光度，如果中心与边 缘的强度相比足够大，则此像素点被认为是某蛋 白质点的一部分，如此重复对每一个像素点进行 搜索，最终构建该凝胶的图谱。
高斯拟合和高斯拉普拉斯变换斑点检测法。
四、比较
第六节 数据分析
涉及到质的准确性评估，量的确定，表 达中的定量变化
第七节 数据呈递
每个蛋白质斑点应该有一个相对分子质 量（Mr)和等电点（pI）。因此利用某些特征 的蛋白质斑点（参考胶上的斑点），一种Mr /pI晶格形式就覆盖在凝胶上，从而推测Mr /pI值。这些蛋白质斑点是已知蛋白质，并易像素为基础、 具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点的电脑信号。
典型流程：
• 凝胶图像的扫描： • 图像加工： • 斑点检测和定量： • 凝胶配比： • 数据分析： • 数据呈递（report） • 2-DE数据库的建立：
第二节 双向凝胶电泳图像采集
第四章 双向凝胶电泳的图像分析
第一节 概述 一、图像分析工具
1.硬件设备： 一定的电脑配置,Pentirm 166处理器，64M 内存，3G硬盘，1024*768分辨率 ，256色， SCI接口，windows操作系统
• 所有点的含量通过单个点的光密度值比上 胶上所有点光密度值
• 归一化处理后的数据是否合理决定着图像 分析数据统计学分析的可靠性。
第五节 凝胶配比分析
一、原因 通过多次凝胶电泳的结果提高实验的可靠性，就
需要进行不同凝胶间斑点的配比分析。 包括：凝胶的匹配和斑点的比较 匹配的目的是为了对已经进行了点检测的凝胶之
二、算法
是对凝胶中的蛋白质的斑点经扫描后获得的数 据，进行检测、评判和定量分析的过程。
原理：是以每一个像素点为中心构建算子，然 后比较算子中心与边缘的吸光度，如果中心与边 缘的强度相比足够大，则此像素点被认为是某蛋 白质点的一部分，如此重复对每一个像素点进行 搜索，最终构建该凝胶的图谱。
高斯拟合和高斯拉普拉斯变换斑点检测法。
四、比较
第六节 数据分析
涉及到质的准确性评估，量的确定，表 达中的定量变化
第七节 数据呈递
每个蛋白质斑点应该有一个相对分子质 量（Mr)和等电点（pI）。因此利用某些特征 的蛋白质斑点（参考胶上的斑点），一种Mr /pI晶格形式就覆盖在凝胶上，从而推测Mr /pI值。这些蛋白质斑点是已知蛋白质，并易像素为基础、 具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点的电脑信号。
典型流程：
• 凝胶图像的扫描： • 图像加工： • 斑点检测和定量： • 凝胶配比： • 数据分析： • 数据呈递（report） • 2-DE数据库的建立：
第二节 双向凝胶电泳图像采集
第四章 双向凝胶电泳的图像分析
第一节 概述 一、图像分析工具
1.硬件设备： 一定的电脑配置,Pentirm 166处理器，64M 内存，3G硬盘，1024*768分辨率 ，256色， SCI接口，windows操作系统
Riemerella anatipestifer 外膜蛋白质之电泳图谱
關鍵字：Riemerella anatipestifer，細胞外膜蛋白質(outer membrane protein)，SDS-PAGE 膠 體電泳(sodium dodecylsulfate-poly acrylamide gel electrophoresis)
緒言
鴨、鵝傳染性漿膜炎(infectious serositis) 又稱新鴨病 (new duck disease)〔14〕或鴨敗 血症 (duck septicemia) 〔11〕，病原菌為 Riemerella anatipestifer (RA)，亦感染其它的 水禽類造成相同的疾病，導致高低不等之死 亡率，尤其在 3〜4 週齡的幼禽特別嚴重 〔27〕。在預防控制本菌感染所發生的疾病 上，一般業者常會使用藥物治療〔7,19,25〕 和菌苗免疫〔1,21,26〕。但由於抗菌劑的使 用會隨著產生抗藥性菌株，以及因本菌具有 21 種血清型之多〔5,15,20〕，不同血清型的 菌苗，不能產生交叉免疫保護的作用〔26〕。 由此反映出本菌不同血清型間的菌株具有差 異的毒力，一直困擾著所有的養鴨和養鵝業。
* 抽印本索取作者 行政院農業委員會家畜衛生試驗所
- 54 -
Riemerella anatipestifer 外膜蛋白質之電泳圖譜
液體培養基(brain heart infusion broth, Difco) 內，經 37℃恆溫振盪水浴槽培養過夜。
外膜蛋白質之製備
參照 Snipes 等方法製備〔Snipes et al., 1988〕，大概過程敘述如下。將培養過夜的 菌液 100 mL 先置於 55℃的熱水槽一小時使 其不活化後，以 8000 rpm，於 4℃下離心 20 分鐘，收集菌塊懸浮於 5 mL PBS (pH 7.2) 溶 液內，並加入 proteinase K (50 mg / mL, Sigma)，於 37℃恆溫振盪水浴槽內作用 10 小時，再加入 PMSF (phenylmethylsulphonyl fluoride, 50 mg / mL, Sigma) 抑制 proteinase K 之作用。然後用 PBS 洗二次，再將菌塊懸 浮於 4 mL Tris-EDTA (0.05 M Tris + 1 mM EDTA, pH 8.0, Merck)溶液內，以超音波將細 胞擊破 50 秒(間斷輸出 1 次/秒)。經過超音波 擊破後的懸浮液以 7000 rpm，在 4℃下離心 20 分鐘後，收集上層液再以 19000 rpm，於 4℃離心一小時，沈澱物用 1.5% 甲基甘膠酸 (sarcosine, Sigma)溶液重覆洗二次，最後將 沈澱的外膜蛋白質溶於 150µL 無菌蒸餾水 中，存於–20℃以備做 SDS-PAGE 分析。
緒言
鴨、鵝傳染性漿膜炎(infectious serositis) 又稱新鴨病 (new duck disease)〔14〕或鴨敗 血症 (duck septicemia) 〔11〕，病原菌為 Riemerella anatipestifer (RA)，亦感染其它的 水禽類造成相同的疾病，導致高低不等之死 亡率，尤其在 3〜4 週齡的幼禽特別嚴重 〔27〕。在預防控制本菌感染所發生的疾病 上，一般業者常會使用藥物治療〔7,19,25〕 和菌苗免疫〔1,21,26〕。但由於抗菌劑的使 用會隨著產生抗藥性菌株，以及因本菌具有 21 種血清型之多〔5,15,20〕，不同血清型的 菌苗，不能產生交叉免疫保護的作用〔26〕。 由此反映出本菌不同血清型間的菌株具有差 異的毒力，一直困擾著所有的養鴨和養鵝業。
* 抽印本索取作者 行政院農業委員會家畜衛生試驗所
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Riemerella anatipestifer 外膜蛋白質之電泳圖譜
液體培養基(brain heart infusion broth, Difco) 內，經 37℃恆溫振盪水浴槽培養過夜。
外膜蛋白質之製備
參照 Snipes 等方法製備〔Snipes et al., 1988〕，大概過程敘述如下。將培養過夜的 菌液 100 mL 先置於 55℃的熱水槽一小時使 其不活化後，以 8000 rpm，於 4℃下離心 20 分鐘，收集菌塊懸浮於 5 mL PBS (pH 7.2) 溶 液內，並加入 proteinase K (50 mg / mL, Sigma)，於 37℃恆溫振盪水浴槽內作用 10 小時，再加入 PMSF (phenylmethylsulphonyl fluoride, 50 mg / mL, Sigma) 抑制 proteinase K 之作用。然後用 PBS 洗二次，再將菌塊懸 浮於 4 mL Tris-EDTA (0.05 M Tris + 1 mM EDTA, pH 8.0, Merck)溶液內，以超音波將細 胞擊破 50 秒(間斷輸出 1 次/秒)。經過超音波 擊破後的懸浮液以 7000 rpm，在 4℃下離心 20 分鐘後，收集上層液再以 19000 rpm，於 4℃離心一小時，沈澱物用 1.5% 甲基甘膠酸 (sarcosine, Sigma)溶液重覆洗二次，最後將 沈澱的外膜蛋白質溶於 150µL 無菌蒸餾水 中，存於–20℃以備做 SDS-PAGE 分析。
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二 、斑点检测 (spots detection)
图象采集与加工后就要进行斑点检测， PDQUEST 2-D分析软件通过一个称之为 “蛋白质斑点检测向导（spot identification wizard）”的程序来实现的。
17
单击“spot”菜单，选择“spot identification wizard”程序。 该程序首先需人工设定检测参数如最小斑点、最弱斑点、 最大斑点和背景值,然后程序进行自动检测并可调节检测的 灵敏度，若检测效果不理想，该步骤可反复进行。程序允 许人工调节脱尾（streaks）、背景、斑点（speckles）和其 他一些选项等。 这些参数设好后单击Find spot centers,其结果在凝胶图象 会显示检测到的斑点会用“ 字（Spot Crosshairs）”表示， 检测的蛋白质斑点应尽量与肉眼观测的相符。 在Parameter Set 项输入保存的名称，蛋白质斑点的参数可 被保存，并能用保存的参数自动检测所有2-D凝胶中蛋白质 斑点，单击Process all gels，会出现一个Auto-detect spots窗 口，其中可以选择需要进行斑点检测的凝胶图象（这些凝 胶图像需事先打开）。 蛋白质斑点检测完了之后，软件会自动创建另外两种格式
5
第一节 电泳图谱的图像分析
掌握： 蛋白电泳图像分析系统 熟悉： 使用PDQuest软件进行蛋白质点的自动检 测，匹配 和分析 了解： 二维电泳蛋白谱数据库
6
电泳图谱的图像分析简介 what can we get from image analysis?
双向凝胶电泳技术是目前蛋白质组研究的主 要技术之一, 双向电泳根据等电点和分子量 可一次性分离数千种蛋白质，经染色后蛋白 质再PAGE上可形成密度不同、分布不均的 复杂点图谱。
Rad Laboratory,Hercules,CA
9
PDQuest 软件的使用
以PDQUEST 2-D分析软件为例将双向电泳 分析的基本实验过程做一简单介绍。
10
PDQuest 软件
PDQUEST 2-D分析软件系统和其他2-D分析 软件系统一样，包括： 一 图象采集与加工： 二 斑点检测 三 斑点匹配 四 数据分析及输出
8
PDQuest 软件简介
PDQuest软件是显示（imaging）、分析 （analyzing）双向电泳图谱＆数据库查询的一个 软件包
硬件：一定的电脑配置,Pentirm 166处理器，
64M内存，3G硬盘，1024*768分辨率 ，256色， SCI接口，windows操作系统
软件： PDQuest双向凝胶图像分析软件，Bio-
如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何 对图谱上的蛋白质点进行检测、定量、比较、 分析和归类，挖掘有价值的蛋白质点的信息 是双向电泳分析软件所要解决的问题。
7
凝胶的图像处理分析及细胞蛋白 谱的建立
典型流程
凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递（report） 2-DE数据库的建立：
tiff格式保存。
2、图片加工：
在PDQUEST 2-D分析软件中打开以tiff格式保存的文件可
以。（单击“打开文件”图标和“File”菜单并选择“Open”
命令，选择保存2-D图象文件的磁盘、路径和文件名，双击 文件名或单击“Open”以打开2-D图象文件，此时tiff格式 保存的文件会自动另外创建一个为PDQUEST 2-D分析软件
11
PDQuest 软件的使用
/download/pdquest/Lessons/interface.h1t2m
一、 图象采集与加工 (editing image，透射模式，全彩
RGB,分辨率为400dpi-800dpi，尽量排除气泡，文件以
回顾
2DE
State 1
?
Functional analysis
State 2
Database search
Differential analysis
PMF
LCMS/MS
MS/MS
1
第四章 电泳图谱的图像分析及 蛋白质消化技术
2
蛋白质表达谱
使用2D凝胶的比较蛋白质组学
比较蛋白质组学最常用的方法是用两个样品进行2DSDS-PAGE，比较蛋白质点的图型。
研究人员已进行了大量工作来开发分析2D凝 胶蛋白质点图型分析软件工具。此外，也开 发出保存这些信息的大批数据库。
3
双向电泳分析软件
ImageMaster 2DElite （MelanieTM） PDQuest 6 0 英国公司Nonlinearn Dyanamics Ltd的Progenesis 德国Decodon GmbH的Delta 2D等
（在操作时先选择其中的一个凝胶图象并选定要 切割的区域，然后在image>advance crop>save crop settings下保存crop的设定条件并输入保存的 名称，其他的图象切割时在image>advance crop>load crop settings中选定先前保存的名称即 可）
4
图像分析的基础：
使用文件扫描仪，但最好使用CCD获得图型。 程序首先评估凝胶的“特征”，他是指与凝胶 本底相比显现的重要不同。“特征”相当于凝 胶上的蛋白质点。可以通过光密度（OD）、大 小和体积（整个蛋白质点面积上的OD）来鉴定 特征。这些鉴定参数是一块凝胶中或多块凝胶 之间特征比较的基础。
分别为gel image 和gel spot。
18
19
20
由于在进行斑点检测时会错误的识别一些蛋白质 斑点，比如将一些污染的非蛋白质点识别为蛋白质 点、将本来是一个蛋白质点识别为两个蛋白质点或 者反之。所以在匹配之前最好进行处理，同时将 gel scan 、gel image 和gel spot图打开，然后单击
自定义的文件格式2D Scan。） 单击工具栏上的control the image display 图标，
会出现一个对话框，通过改变此对话框的High 和Low的值 以改变明亮度。
14
15
用工具栏的crop可以切割掉凝胶边缘没有蛋白 质点的部分，以减少分析的复杂性，但要注意对 你要分析的多块凝胶图像最好是切割成同样大小。
二 、斑点检测 (spots detection)
图象采集与加工后就要进行斑点检测， PDQUEST 2-D分析软件通过一个称之为 “蛋白质斑点检测向导（spot identification wizard）”的程序来实现的。
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单击“spot”菜单，选择“spot identification wizard”程序。 该程序首先需人工设定检测参数如最小斑点、最弱斑点、 最大斑点和背景值,然后程序进行自动检测并可调节检测的 灵敏度，若检测效果不理想，该步骤可反复进行。程序允 许人工调节脱尾（streaks）、背景、斑点（speckles）和其 他一些选项等。 这些参数设好后单击Find spot centers,其结果在凝胶图象 会显示检测到的斑点会用“ 字（Spot Crosshairs）”表示， 检测的蛋白质斑点应尽量与肉眼观测的相符。 在Parameter Set 项输入保存的名称，蛋白质斑点的参数可 被保存，并能用保存的参数自动检测所有2-D凝胶中蛋白质 斑点，单击Process all gels，会出现一个Auto-detect spots窗 口，其中可以选择需要进行斑点检测的凝胶图象（这些凝 胶图像需事先打开）。 蛋白质斑点检测完了之后，软件会自动创建另外两种格式
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第一节 电泳图谱的图像分析
掌握： 蛋白电泳图像分析系统 熟悉： 使用PDQuest软件进行蛋白质点的自动检 测，匹配 和分析 了解： 二维电泳蛋白谱数据库
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电泳图谱的图像分析简介 what can we get from image analysis?
双向凝胶电泳技术是目前蛋白质组研究的主 要技术之一, 双向电泳根据等电点和分子量 可一次性分离数千种蛋白质，经染色后蛋白 质再PAGE上可形成密度不同、分布不均的 复杂点图谱。
Rad Laboratory,Hercules,CA
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PDQuest 软件的使用
以PDQUEST 2-D分析软件为例将双向电泳 分析的基本实验过程做一简单介绍。
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PDQuest 软件
PDQUEST 2-D分析软件系统和其他2-D分析 软件系统一样，包括： 一 图象采集与加工： 二 斑点检测 三 斑点匹配 四 数据分析及输出
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PDQuest 软件简介
PDQuest软件是显示（imaging）、分析 （analyzing）双向电泳图谱＆数据库查询的一个 软件包
硬件：一定的电脑配置,Pentirm 166处理器，
64M内存，3G硬盘，1024*768分辨率 ，256色， SCI接口，windows操作系统
软件： PDQuest双向凝胶图像分析软件，Bio-
如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何 对图谱上的蛋白质点进行检测、定量、比较、 分析和归类，挖掘有价值的蛋白质点的信息 是双向电泳分析软件所要解决的问题。
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凝胶的图像处理分析及细胞蛋白 谱的建立
典型流程
凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递（report） 2-DE数据库的建立：
tiff格式保存。
2、图片加工：
在PDQUEST 2-D分析软件中打开以tiff格式保存的文件可
以。（单击“打开文件”图标和“File”菜单并选择“Open”
命令，选择保存2-D图象文件的磁盘、路径和文件名，双击 文件名或单击“Open”以打开2-D图象文件，此时tiff格式 保存的文件会自动另外创建一个为PDQUEST 2-D分析软件
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PDQuest 软件的使用
/download/pdquest/Lessons/interface.h1t2m
一、 图象采集与加工 (editing image，透射模式，全彩
RGB,分辨率为400dpi-800dpi，尽量排除气泡，文件以
回顾
2DE
State 1
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Functional analysis
State 2
Database search
Differential analysis
PMF
LCMS/MS
MS/MS
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第四章 电泳图谱的图像分析及 蛋白质消化技术
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蛋白质表达谱
使用2D凝胶的比较蛋白质组学
比较蛋白质组学最常用的方法是用两个样品进行2DSDS-PAGE，比较蛋白质点的图型。
研究人员已进行了大量工作来开发分析2D凝 胶蛋白质点图型分析软件工具。此外，也开 发出保存这些信息的大批数据库。
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双向电泳分析软件
ImageMaster 2DElite （MelanieTM） PDQuest 6 0 英国公司Nonlinearn Dyanamics Ltd的Progenesis 德国Decodon GmbH的Delta 2D等
（在操作时先选择其中的一个凝胶图象并选定要 切割的区域，然后在image>advance crop>save crop settings下保存crop的设定条件并输入保存的 名称，其他的图象切割时在image>advance crop>load crop settings中选定先前保存的名称即 可）
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图像分析的基础：
使用文件扫描仪，但最好使用CCD获得图型。 程序首先评估凝胶的“特征”，他是指与凝胶 本底相比显现的重要不同。“特征”相当于凝 胶上的蛋白质点。可以通过光密度（OD）、大 小和体积（整个蛋白质点面积上的OD）来鉴定 特征。这些鉴定参数是一块凝胶中或多块凝胶 之间特征比较的基础。
分别为gel image 和gel spot。
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由于在进行斑点检测时会错误的识别一些蛋白质 斑点，比如将一些污染的非蛋白质点识别为蛋白质 点、将本来是一个蛋白质点识别为两个蛋白质点或 者反之。所以在匹配之前最好进行处理，同时将 gel scan 、gel image 和gel spot图打开，然后单击
自定义的文件格式2D Scan。） 单击工具栏上的control the image display 图标，
会出现一个对话框，通过改变此对话框的High 和Low的值 以改变明亮度。
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用工具栏的crop可以切割掉凝胶边缘没有蛋白 质点的部分，以减少分析的复杂性，但要注意对 你要分析的多块凝胶图像最好是切割成同样大小。