乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定_辛毅

Isolation， primary culture and identification of cardiac fibroblasts and cardiac myocytes of neonatal mouse XIN Yi1 ， XU Xiufang2 ， HUANG Yimin2 ， ZHANG Ying1 ， LI Wenbin3
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泡 10 s， 转移至超净台。将乳鼠固定于左手掌中， 右 手用无菌棉签蘸体积分数 75% 酒精消毒胸、 腹部皮 肤 3 次。用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上 开胸后， 用剪子压住胸骨右缘， 使心脏自然跳出， 用 取 出 心 脏， 置于装有预冷 弯镊 子 勾 住 心 尖 根 部， 0. 01 mol · L － 1 磷酸盐缓冲溶液 （ phosphate buffered PBS） 的培养皿中。 将鼠心脏全部取出后， solution， 剪去心房、 剔除心脏上结缔组织、 脂肪及血管， 于预
第 28 卷
随着分子、 细胞生物学的发展， 细胞水平的研究 日益受到重视。国内外诸多学者开展了心肌细胞的 生理、 病理、 药理、 代谢等方面的基础研究
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sarcomeric腹水单克隆抗体 α 横纹肌肌动蛋白 （ α actin， SA； 美国 Sigma， EA53 ） 、 TRITC 标记的羊抗 α鼠 IgG（ 二抗， 美国 Jacson ） ； 肌球蛋白重链 （ myosin MHC ） 小鼠单克隆抗体 （ 英国 Abcam， 3heavy chain， 48 ） ， CMM 为 美 国 ScienCell 公 司 产 品。 细 胞 培 养 板、 离心管、 培养皿等耗材购自美国 Corning 公司。 1． 1． 3 主要仪器 荧光倒置显微镜 （ 德国 Leica， 4000B 型） ， 51 ） ， 荧光正置显微镜 （ 日本 OlympusBXCO2 细胞培养箱（ 日本三洋公司产品 ） ， 酶标检测仪 （ 德国 Beckman ） ， 超净工作台 （ 北京昌平长城净化 空气仪器厂 ） ， 离心机 （ 上海安亭科学仪器厂 TGL16C ） 。 1． 2 1． 2． 1 方法 取材 将乳鼠于体积分数 75% 乙醇缸中浸
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乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定
1 2 2 毅 ，许秀芳 ，黄益民 ，张 1 3 颖 ，李温斌
北京市心肺血管疾病研究所实验中心 ， 北京
100029 ； 2． 首都医科大学附属北
北京 100029 ； 3． 首都医科大学附属北京安贞医院心外 北京市心肺血管疾病研究所分子生物学研究室 ，
（ 1 ． Beijing Anzhen Hospital， Capital Medical University， Department of Experimental Center， Beijing Institute of Heart， Lung and Blood Vessel Diseases， Beijing 100029 ， China； 2 ． Beijing Anzhen Hospital， Capital Medical University， Department of Molecular Beijing Institute of Heart， Lung and Blood Vessel Diseases， Beijing 100029 ， China； 3 ． Department of Cardiac Surgery， Biology， Beijing Anzhen Hospital， Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100029 ， China） Abstract： Objective To build the isolation， culture and identification techniques of cardiac fibroblasts and cardiac The heart of neonate mouse was cut into pieces， then type Ⅱ collagenase plus trypsimyocytes of neonate mouse． Methods
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辛
（ 1． 首都医科大学附属北京安贞医院 京安贞医院 科， 北京 100029 ）
小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞 。光学显微镜下分别观察成纤维细胞和心肌细胞的基本形态特征的变化 ， 并对 2 种 细胞行苏木素伊红（ HE） 染色， 用第 2 代心肌成纤维细胞行波形蛋白免疫荧光鉴定 ， 而原代心肌细胞行 α横纹肌肌动 蛋白、 心肌肌钙蛋白和心肌肌球蛋白重链免疫荧光鉴定 。结果 差速贴壁分离法心肌成纤维细胞原代培养 90 min 基 72 h 心肌成纤维细胞波形蛋白免疫荧光鉴定纯度高达 97% ； 而心肌 本贴壁， 贴壁较早， 培养第 3 ～ 5 代细胞生长良好， 24 h 贴壁后部分心肌细胞出现自发性搏动现象 ， 48 h 后细胞逐渐展开， 72 h 后逐渐形成细胞簇并出现 细胞贴壁较晚， 93% 、 心肌肌球蛋白重链、 心肌横纹肌肌动蛋白、 心肌肌钙蛋白免疫荧光鉴定心肌细胞纯度分别为 95% 、 同步搏动， 95% 。结论 关键词： 差速贴壁分离法结合免疫荧光鉴定可分离乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞 ， 此方法成熟、 稳定、 有效， 心肌成纤维细胞； 心肌细胞； 原代培养； 乳小鼠； 免疫荧光 文献标志码： A 7239 （ 2011 ） 05-0541-07 文章编号： 1004为研究心脏疾病的基础与临床研究提供了理想的实验模型 。 33 ； Q233 中图分类号： Q95-
， 体外
培养的心肌细胞可保持结构及功能上的某些特点 ， 并具有自发性节律搏动、 不传代， 且心肌细胞的培养 具有不受体内神经体液因素的影响等特点 。成纤维 细胞是结缔组织中最常见的细胞， 可合成和分泌胶 原纤维、 弹性纤维、 网状纤维及有机基质， 并且在外 伤等因素刺激下， 部分纤维细胞可重新转变为幼稚 的成纤维细胞， 其功能活动也得以恢复， 参与组织损 伤后的修复。实验研究中由于心肌细胞和成纤维细 胞在原代细胞培养时均是贴壁细胞， 故需要建立一 种技术方法将 2 种细胞分离开并保持各自的纯度。 差速贴壁纯化法是根据成纤维细胞和心肌细胞在培 养皿表面贴壁时间不同而进行分离的 ， 操作简单， 对 分 离 纯 度 高。 本 实 验 参 照 Simpson 细胞 影 响 小， 等
收稿日期：2011 － 05 － 24 基金项目：国家自然科学基金资助项目 （ 编号： 81070077 ） ； 省部共建重点教育部心血管重塑相关疾病重点实验室项目（ 编号： 110267 ） ； 首都医科大学基础 － 临床合作基金重点项目 （ 编号： 11JL09 ） 作者简介：辛 毅（ 1968 － ） ， 女， 北京市人， 学士， 主管技师， 主要从事细胞生物学研究。 通讯作者：李温斌（ 1965 － ） ， 男， 河南焦作人， 博士， 主任医师， 博士生导师， 主要从事心脏外科的基础与临床研究。
第 28 卷 第 5 期 2011 年 9 月
新乡医学院学报 Journal of Xinxiang Medical College
Vol． 28 No． 5 Sep． 2011
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． 新乡医学院学报， 2011 ， 28 （ 5 ） ： 541本文引用：辛毅， 许秀芳， 黄益民， 等． 乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定［J］ 547．
nase digestion method were used for isolating cell and then cardiac fibroblasts and cardiac myocytes were collected and cultured by different speed adherence． The basic shape change of cardiac fibroblasts and cardiac myocytes were observed under the opitical microscope and the two kinds cells were given hematoxylineosin staining． The second generation cardiac fibroblasts were assayed by vimentin immunofluorescence and cardiac myocytes were assayed by αsarcomericactin， cardiac troponin and cardiac myoglobulin heavy chain immunofluorescence． Results Fibroblasts were adhered after 90 minutes of primary culture by the and the third generation to the fifth generation cells growth well． The expression of vimenmethod of different speed adherence， tin of 97% fibroblasts were positive after 72 hours' culture． But cardiac myocytes were adhered after 24 hours of culture and there was spontaneous beating phenomenon of part cardiac myocytes． The cells gradually spread after 48 hours． The cells clusters were formed and there was synchronous pulsation after 72 hours． The positive expression rate of cardiac myoglobulin heavy chain ， sarcomericactin and cardiac troponin was 95% ， 93% ， 95% ， respectively after 72 hours' culture． Conclusion αmyocytes． This method provide an ideal experimental model for the basic and clinical research of heart disease． Key words： cardiac fibroblasts； cardiac myocytes； primary culture； neonatal mouse； immunoflourescence Different speed adherence method and immunoflurescence were effective and stable to isolate the cardiac fibroblasts and cardiac