PCR检测中假病毒内标和外标的制备(新)

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新型冠状病毒核酸检测模拟室内质控品的研制

ＤＯＩ：１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０２０．１１．０９·新型冠状病毒肺炎·新型冠状病毒核酸检测模拟室内质控品的研制作者简介：杨传坤，１９８５年生，男，主管技师，硕士，从事临床分子生物学与免疫学检验工作。

通信作者：吴国球，博士研究生导师，教授，Ｅｍａｉｌ：ｎａｔｉｏｎｂａｌｌ＠１６３．ｃｏｍ；陈克平，硕士研究生导师，副主任技师，Ｅｍａｉｌ：ｋｅｐｉｎｇ２００１＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。

杨传坤１，赵峰峰１，吴国球１，２，陈克平１，２（１．东南大学附属中大医院检验科，南京２１０００９；２．东南大学医学院检验系，南京２１０００９）摘要：目的　评价用阴性临床样本稀释假病毒原料、制备新型冠状病毒核酸检测模拟室内质控品的可行性。

方法　用ＰＢＳ与阴性临床样本梯度稀释噬菌体病毒样颗粒（假病毒）制备模拟室内质控品，用荧光ＰＣＲ仪检测ＯＲＦ１ａｂ和Ｎ靶基因。

同时加入ＲＮａｓｅ抑制剂－２０℃保存，评价其稳定性。

结果　ＰＢＳ与阴性临床样本稀释制备的模拟室内质控品核酸检测Ｃｔ值差异无统计学意义，且所用试剂Ｎ靶基因的检测灵敏度大于ＯＲＦ１ａｂ基因。

制备的模拟质控品在－２０℃条件下可稳定保存６０ｄ，且无需添加ＲＮａｓｅ抑制剂。

结论　阴性临床样本作为基质稀释假病毒原料制备模拟质控品可更好地反映基质效应，可用作新冠病毒核酸检测室内质控品。

同时应关注靶基因检测灵敏度不同造成的单靶标阳性样本，防止漏检。

关键词：新型冠状病毒；核酸检测；室内质控品；假病毒中图分类号：Ｒ４４６．６文献标志码：Ａ新型冠状病毒（２０１９ｎＣｏＶ，简称新冠病毒）可引起新型冠状病毒肺炎，此种病毒传播性强、传播迅速，且人群普遍易感［１］。

早发现、早确诊、早隔离是传染病防控的关键，新冠病毒核酸检测在疫情防控中扮演重要的角色［２］。

国家卫生健康委员会发布的各版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》，均将核酸检测阳性作为新冠病毒感染确诊金标准。

基因克隆、假病毒操作步骤

实验名称：基因克隆实验器材:荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工PCR产物纯化试剂盒、恒温加热器、NEB连接体系、灭菌纯水、JM109感受态、冰、LB培养基、酒精灯、涂棒、氨苄、氨苄抗性平板、甘油等；操作步骤：1、可通过PCR进行拼接获得目的基因的，过柱纯化（生工试剂盒根据说明书进行纯化，在最后一步的洗脱可以用预热的灭菌纯水洗脱，在加灭菌纯水洗脱的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；2、选择合适的载体（EZ-T）用连接酶进行连接，NEB体系，16℃过夜连接T4lages 1.010×T4buffer 2.0EZ-T 1.0目的基因8.0DdH2O 8.0＿＿＿＿＿＿＿＿＿20ul3、取100µl摇匀后的JM109感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；4、加入500µl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性；5、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬菌体，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（氨苄抗性），37℃倒置培养12~16小时；6、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（氨苄）的LB液体培养基中，37℃振荡培养3h；7、培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；8、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充分混匀，-80℃保存；实验名称：假病毒的制备实验器材：荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工小剂量抽提试剂盒、生工胶回收试剂盒、恒温加热器、NEB连接体系、灭菌纯水、冰、LB培养基、氨苄、卡那、卡那抗性平板、甘油等；操作步骤：1、选取测序结果正确的菌种以1：100 的比例接种到含氨苄（1：1000）的5ml LB 培养基中过夜培养中，37℃，200r/min；2、收集菌体抽提质粒，用生工小剂量抽提质粒试剂盒跟据说明书进行抽提，在抽提过程中要注意防污染（在最后一步的洗脱可以用预热的洗脱液洗脱，在加洗脱液的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；3、用抽提好的质粒做双酶切用NEB公司的体系，同时做一管PET28-MS2的双酶切20ulBamH 1 2.5ul BamH 1 1.0ul HindIII 2.5ul HindIII 1.0ulBSA 5.0ul BSA 2.0ulBuffer2 5.0ul Buffer2 2.0ul产物20ul PET28-MS2 8.0H2O 15ul H2O 15ul＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿50.0 ul20.0ul37度3小时，4、配置1%的大空胶，将双酶切产物跑胶，割胶（在割胶的时候要注意产物不要在紫外灯光下暴露太久），用生工胶回收试剂盒进行回收根据说明书进行纯化；PET28-MS2直接用生工PCR产物回收试剂盒进行纯化；5、将回收好的酶切产物进行连接用NEB的连接体系，16℃，过夜连接T4lages 1.0ul10×T4buffer 2.0ulPET28-MS2 4.0ul目的片段8.0ulDdH2O 6.0ul＿＿＿＿＿＿＿＿＿20ul6、取100µl摇匀后的BL21感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；7、加入500µl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性；8、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬菌体，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（卡那抗性），37℃倒置培养12~16小时；9、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（卡那）的LB液体培养基中，37℃振荡培养，培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；10、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充分混匀，-80℃保存；11、选取测序结果正确的菌种以1：100 的比例接种到含卡那霉素的5ml LB 培养基中过夜培养，37℃，200r/min；12、将1ml 过夜培养的菌液接种到100ml 含卡那青霉素的LB 培养基中，37℃，200r /min 振荡培养4 -6h 至OD 600值大约在0.6-0.8；13、加入终浓度为1mmol/L (IPTG)，在37℃条件下，200 r /min诱导表达16h；14、10,000 rpm，4℃，离心10min，收集菌体，加入1×超声buffer 5 ml重悬菌体；<摇床一小时>15、超声处理：置于冰上超声，功率300W，超声时间2<5>s，间隔时间3<5>s，全程3min，超声12<10>个循环；16、将破碎完全的表达产物12,000 rpm，4℃，离心30min，沉淀细胞碎片，收集上清到另一干净的离心管中，得到含病毒样颗粒的表达产物，分装保存-80℃保存；17、将得到的病毒样颗粒的双酶消化验证实验分别取4 份用NEB公司的DNaseI、生工的RNaseA 进行消化37℃消化1h-2h18、1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶消化结果；19、去第1次消化产物进行第2次消化37℃1h-2h（用NEB公司的DNaseI）DNaseI 40ul10×DNaseIBuffer100ul消化产物10ulTE 850ul＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿1ml20、DNaseⅠ消化后，加入终浓度为5mM的EDTA终止反应，然后65度10分钟使DNaseⅠ失活；21、提取RNA标本后上荧光定量，检验病毒颗粒的浓度和质粒的消化情况。

内标技术介绍 (1)

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东胜创新
29
北京东胜创新生物科技有限公司之
感谢各位光临
感谢各位光临！
东胜创新
30
问题
举一例说明荧光定量PCR技术所引发的研究课题；荧光定量PCR技术可用于定量DNA及RNA模板（+）
东胜创新
31
16
实时荧光定量PCR技术之
多色多通道技术应用-基因表达分析
Copies ng/ µl Total RNA
ERBB2 copies / GAPDH copies Healthy RNA 1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012 2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019 0.0115
东胜创新
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实时荧光定量PCR技术之
多色多通道技术
一个PCR管内进行两种PCR扩增要解决的问题： 1、引物及探针问题---引物及探针的相互干扰 2、模板量差别---共用资源的相互竞争
东胜创新
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实时荧光定量PCR技术之 1、引物及探针问题
F
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多色多通道技术
F R F
R Q R Q
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东胜创新
单
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单
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R QQ R Q R Q R Q Q R Q R
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假病毒作为RNA参考物质的制备和质量控制规范-编制说明

《假病毒作为RNA参考物质的制备和质量控制规范》征求意见稿编制说明一、工作简况（一）任务来源根据国家标准委下达的《关于下达2013年第二批国家标准制修订计划的通知》（国标委综合[2013]90号）要求，由中国检验检疫科学研究院、连云港出入境检验检疫局和北京出入境检验检疫局联合承担了该标准的编制工作。

主管部门为农业部，归口单位为全国水产标准化技术委员会。

本标准根据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》中的要求进行编写的，本标准编号：20131313-T-424，完成时间为2016年。

（二）修订的必要性在水生动物RNA病毒的分子生物学检测标准中，一般选择灭活病毒中抽提的RNA作为阳性对照。

此方法具有一定的生物安全风险，且RNA极易降解，无法长久保存。

假病毒技术利用包含MS2 噬菌体基因的质粒作为病毒核酸的载体，在大肠杆菌中能将插入的病毒基因转录成RNA，同时表达出MS2噬菌体蛋白包裹病毒RNA，组装成假病毒。

该假病毒不仅含有所需要的RNA片断，而且与MS2 噬菌体类似，能够耐受核酸酶的降解，具有较好的稳定性，且不具复制能力和传染能力，可代替灭活病毒作为参考物质用于RNA 病毒的分子生物学检测。

目前我国还没有相应的国家标准规范假病毒RNA参考物质的制备和质量控制方法。

针对这一情况，本项目计划建立一套技术标准，包括假病毒的制备方法、质量评价方法和保存条件。

通过该标准可以为RNA病毒分子生物学检测提供稳定安全的RNA参考物质。

该标准的建立将有助于提高我国病原分子生物学检测结果的可靠性。

(三)主要工作过程1、准备阶段：本标准完成过程中所使用的质粒为中国检科院动检所自己制备的表达型质粒载体，用于假病毒外膜蛋白的表达。

大肠杆菌感受态来自商业采购，由动检所保存。

同时召集有相关水生动物病毒病诊断经验的科研人员组成工作小组，进行假病毒参考物质制备方法的改进、验证和征求意见稿的起草工作。

2、实验阶段：2014年全年，由中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所牵头，连云港出入境检验检疫局和北京出入境检验检疫局联合实施该标准的实验工作。

PCR 假阴性和假阳性原因分析与解决方案

PCR假阴性和假阳性原因分析与解决方案一、假阴性：不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。

或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

PCR检测中假病毒内标和外标的制备(新)

•
稳定性假病毒是核酸片段与包装蛋白形成的复合体，所以假病毒
内标、外标能耐受核酸酶，在血清等物质中可以长期、稳定的存在，且易于保存。
DNA假病毒外标、内标的制备
一、实验设计
、实验设计：
利用M13mp18噬菌体克隆技术，提出DNA假病毒质控品这一新的质控品制备技术，并以乙型肝炎病毒（HBV）的检测为模型，说明这一技术制备的质控品。
700 600 500 400 300 200 100 0 -100 0 5 10 15 20 25 30 35 40
Fluorescence
Ct
DNA假病毒、质粒及单链DNA耐受DNA酶实验比较
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
A
B
C
Lane 1: blank Lane 2: L3 Lane 3: L3+DNase I Lane 4: L4 Lane 5: L4+DNase I Lane 6: pUC19/Msp I marker Lane 7: L5 Lane 8: L5+DNase I Lane 9: L6 Lane 10: L6+DNase I
A （第1天）
B （37 ℃,
第30天）
内标对外标定量工作曲线的影响
将HBV DNA假病毒外标作梯度稀释，考察RBCS内标对HBV外标工作曲线的影响
红色箭头：未加RBCS假病毒内标
黑色箭头：加RBCS假病毒内标
外标对内标的影响
理想的内标是不论外标浓度的高低，内标本身都能够扩增。将 HBV假病毒外标作梯度稀释，加入大约1000 copies/mL的RBCS假病毒内标后，用实时荧光PCR考察不同浓度的HBV假病毒外标对RBCS假病毒内标的影响。

新冠核酸检测技术PCR实验室质量体系文件第三部份项目类SOP

文件审批者：发布日期：年月日第三部分项目类SOPSOP_18-35 临床标本的处理（核酸纯化）程序1.目的保证标本处理标准化、规范化，使不规范操作因素对实验结果造成的影响减至最小。

2.范围新冠病毒核酸提取。

3.职责新冠病毒标本检测项目的工作人员按此文件操作执行。

4.工作流程4.1接收样本在接收样本前，检测人员需要按照三级防护标准穿戴好，穿着防护衣、护目镜、隔离衣，并戴上N95口罩、双层手套，穿上靴套等。

然后用75%的乙醇对实验室内的生物安全柜的空间和台面以及核酸提取仪等进行消毒，还需对标本转运箱进行消毒，并核对被检样本姓名、性别、年龄、编号及检测项目等，待确认转运箱完好后将其放入生物安全柜。

4.2病毒灭活已经使用含胍盐的灭活型标本采样管的实验室，这一环节无需进行灭活处理，直接进行核酸提取，而使用非灭活型标本采样管的实验室，则有56℃孵育30分钟热灭活的处理方式，病毒灭活后为避免开盖后气溶胶污染实验室和检测人员，常温静置15分钟以上再执行下一步操作。

4.3核酸提取1) 标本操作人员穿戴三级防护用品，在生物安全柜内将离心管依次编号。

2）取出病毒提取试剂，对应标本编号。

3）用旋涡混匀器对标本进行混匀，把可能含有病毒核酸的细胞从拭子标本中洗脱下来。

4）在生物安全柜当中，一人开盖，一人加样，用移液器加混悬液200uL标本到提取液当中。

5) 裂解10分钟。

6）把裂解好的核酸提取盒放入半自动核酸提取仪当中，按预先设置好的程序提取核酸。

7）核酸提取完成后在生物安全柜内，将提取的核酸加至PCR扩增反应体系。

4.4 核酸分析，等待结果在生物安全柜内，将提取的核酸加至PCR扩增反应体系，然后将构建好的扩增体系放入扩增仪，进行核酸扩增后分析。

4.5消毒，废物处理一系列步骤完成后，需要对实验废物进行处理，并对实验仪器、桌面、地面进行消毒。

待检测结果出来后，对检测到的阳性、可疑阳性样本按SOP_18-20《新型冠状病毒核酸检测结果分析与报告管理制度》、SOP_18-21《新型冠状病毒核酸检测疑似阳性结果、可疑结果处置应急预案》进行处置。

HIV假病毒的制备及感染性检测

假病毒包装和检测方法，假病毒感染CEM细胞来源: 日期：2011-4-11(共有0 条评论) 我要评论我们现在以一个具体的实例来说明假病毒的包装和检测方法。

(一)材料1．质粒pNL-Luc-R-Env-或pNL-Luc-R+Env-：质粒包含HIV-1前病毒克隆pNL4.3的大部分基因组，荧光素酶基因Luc代替了HIV的nef基因，HIV的env基因发生了移码突变，R-为vpr基因发生了移码突变，使宿主细胞生长不能到达G2期。

pSV7d-Env：质粒把HIV-1的外壳蛋白基因(如HXB2、JR．FL、ADA、BAL的env基因)插入质粒载体pSV7d。

两个质粒为Amp抗性，都可以转化大肠杆菌细胞进行扩增。

2．细胞系和培养基HOS细胞或U87细胞的培养基为DMEM／10％FBS／1％青霉素／链霉素。

悬浮细胞的培养基为RPMI／10％FBS／1％青霉素／链霉素。

一般情况下，需要加入puromycin(1ug／m1)来维持共受体分子的长期表达。

3．Ca3(P04)2转染试剂2×HBS：1．0g HEPES、1．6g NaCl、0．074g KCl、0．025g Na2 HP04。

加去离子水至100ml，调pH至7．05～7．15，灭菌后4~C保存；2．0mol／L CaC12：29．40g CaCl2.H2O，加去离子水至100ml，灭菌；去离子水，灭菌。

4．感染试剂和荧光素酶检测试剂Polybrene(Sigma)8mg／ml溶于PBS，-20℃保存；荧光素酶检测试剂盒(Pro-mega)。

(二)方法1．假病毒粒子的包装1)转染前一天，传293或293T细胞至10cm培养皿，细胞数为2×10^6个／10ml DMEM ／10％FBS2)用10ug的pNL-Luc-R+Env-和10ug的pSV7d-Env两个质粒共转染293细胞。

转染前纯化质粒，用乙醇沉淀质粒再用450ul去离子水重悬这两个质粒，加入70ul的2．0mol ／L CaCl2，再逐滴加入500u1的2×HBS，冰上静置30min，逐滴加人293细胞中；3)转染24h后换培养基；4)转染48h后收上清，用0．45umol／L的滤膜过滤细胞沉淀；5)分装成lml小管，一80℃保存，取少量检测p24蛋白含量或逆转录酶含量。

pcr假阴性和假阳性[总结]

PCR假阴性和假阳性假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

⑤模板核酸变性不彻底。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。

或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR 扩增效率。

简述PCR反应实验步骤及步骤

简述PCR反应实验步骤及步骤引言聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一种重要的分子生物学技术，能够在短时间内扩增DNA片段，从而使得微量的DNA样本能够被检测和分析。

PCR反应的成功与否直接关系到后续实验的可靠性和准确性，因此正确地掌握PCR反应的步骤和操作非常重要。

实验步骤1. 样本提取和准备从待测的样本中提取DNA，并进行纯化和浓缩。

样品可以是从生物体中提取的任何组织或细胞，如血液、组织切片、培养细胞等。

提取的DNA需要经过纯化步骤，以去除潜在的抑制物质和杂质。

此外，还需要将DNA样品浓缩到适当的浓度。

2. PCR反应体系的配制将反应体系所需的各种试剂和物质按照一定的比例配制在一起。

常用的反应体系包括DNA模板、引物（即用于扩增DNA的两个特异性寡核苷酸序列）、聚合酶（如Taq 聚合酶）、反应缓冲液、Mg2+、dNTPs等。

3. PCR反应的循环条件PCR反应一般包括三个主要的温度环节，即变性、退火和延伸。

具体的循环条件根据扩增片段的长度和引物的Tm值确定。

一般而言，PCR反应的循环条件如下：•变性：在94-98℃的高温下，使DNA双链解开为两个单链，以供引物结合。

•退火：在55-65℃的温度下，引物与DNA模板特异性结合，实现引物的定向扩增。

•延伸：在72℃的温度下，聚合酶将dNTPs加入到扩增产物的3’末端，延伸合成DNA链。

4. PCR反应循环的重复次数PCR反应循环的重复次数取决于所需扩增片段的多少。

一般情况下，PCR反应的循环次数为25-35次，每个循环约30秒至2分钟。

反应次数过多可能导致非特异性产物的扩增。

5. PCR产物的分析PCR反应结束后，需要对扩增产物进行分析和检测。

一般的分析方法包括琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链式反应产物序列分析等。

通过这些方法可以确认PCR反应的成功与否，以及检测目的片段的存在与否。

结论PCR反应是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因检测、遗传疾病诊断、基因工程和生物学研究等领域。

PCR假阳性等问题共31页word资料

PCR检测常见问题与解决途径利用PCR方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。

尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。

为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。

一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。

本文对PCR检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。

一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。

如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。

实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。

（二）造成假阳性的原因1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。

因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。

4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。

据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。

5. 实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。

常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制(精)

常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制一、RNA病毒(蓝耳病、猪瘟、乙脑、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒等包括病料的处理、RNA的提取、反转录、和PCR扩增、凝胶电泳四个步骤。

1、病料的处理取组织病料约2克,加入4-5毫升灭菌的PBS或者生理盐水,置研磨器(灭菌中研磨或者用剪刀细心剪碎,置-20℃中反复冻融三次,即可用于检测。

2、RNA的提取1取上述冻融三次的病料约200微升置1.5毫升的离心管中,加入500-600微升TRIzol剧烈振摇30秒后,静置5分钟后,再次剧烈振摇30秒后,静置5分钟。

2在加入200微升的氯仿,上下颠倒混匀30s,静置5分钟,4℃ 12000g 离心15 min。

离心完毕后,取上清约400-500微升(注意不要吸到中间层白色物质置新的灭菌好的离心管中,加入等体积的异丙醇,颠倒数次后(不可剧烈震动静置10分钟,4℃12000g离心10 min.可见管底部有少量白色沉淀,倒掉异丙醇,加入1毫升75%的乙醇(DEPC水配制,振摇,将白色沉淀悬浮,4℃7500g离心5 min。

弃去上清,干燥沉淀物(将离心管倒置于卫生纸或者其它吸水纸上,室温约5 min即可加入20μLDEPC 水溶解用于RT-PCR,或于-20℃保存备用。

两步法:1、反转录在10μL的反转录体系中加入:上述步骤中提取的RNA7μL、5×Buffer 2μL、0.5μL或者下游引物0.5μL;65℃10分钟, 10 mM dNTP 0.25μL、Oligo (dT18迅速放置-20摄氏度冰箱中2分钟,加入M-MLV 100U/μL 0.25μL(反转录酶37℃水浴1h,即可做为PCR扩增的模板,立即用于PCR扩增或置于- 20 ℃保存备用。

2、PCR扩增设立阳性和阴性对照,阳性对照一般为病毒液,阴性对照用灭菌的双蒸水做为PCR反应模板。

反应总体系为25μLcDNA 2μL,(模板25mmol/L Mg2+ 1.5μL,2.5mmol/L dNTPs 2.0μL,10× Mg2+ free PCR Buffer 2.5μL,20mmol/ L上下游引物各1μL,Taq DNA聚合酶(5U/μL0.2μL无菌双蒸水补至25.0μL。

pcr检测流程步骤

pcr检测流程步骤PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和扩增DNA。

下面将介绍PCR检测的流程步骤。

第一步：样品采集PCR检测的第一步是采集样品。

样品可以是人体组织、血液、唾液、尿液等。

采集样品时要保证样品的纯净性和完整性，避免污染和损伤。

第二步：DNA提取提取样品中的DNA是PCR检测的关键步骤。

常用的DNA提取方法包括酚-氯仿法、盐析法、磁珠法等。

提取过程中要注意避免DNA的降解和污染，保证提取到的DNA质量和浓度。

第三步：DNA扩增DNA扩增是PCR检测的核心步骤。

扩增过程中需要使用特定的引物（一对寡核苷酸序列）和DNA聚合酶。

引物与待扩增的DNA序列互补结合，并由DNA聚合酶在不断变温循环的条件下进行DNA 链的合成。

循环反复进行多次，可以在短时间内扩增出大量目标DNA序列。

第四步：凝胶电泳凝胶电泳是PCR检测的常用分析方法。

通过将PCR产物置于凝胶中，通过电场作用使DNA分子向电极迁移，根据DNA分子的大小和电荷差异，可以将PCR产物分离。

凝胶电泳的结果可以通过紫外光照射或染色剂染色来观察，从而判断PCR是否成功以及目标DNA片段的大小。

第五步：结果分析通过凝胶电泳后，可以根据PCR产物的带型和大小来判断PCR是否成功。

如果目标DNA片段的带型明显且与预期一致，则说明PCR成功扩增出目标DNA序列。

而如果没有扩增出目标DNA序列，则说明PCR反应失败，需要重新优化反应条件。

第六步：数据解读根据PCR检测的结果，可以对目标DNA序列进行定性和定量分析。

定性分析可以判断样品是否存在目标DNA序列，定量分析可以确定目标DNA序列的浓度。

通过数据解读，可以得出与待测物相关的信息，如基因型、病毒感染程度等。

PCR检测的流程包括样品采集、DNA提取、DNA扩增、凝胶电泳、结果分析和数据解读。

每个步骤都有其重要性和特殊要求，只有在严格遵循操作规程的情况下，才能获得准确可靠的PCR检测结果。