细胞分选技术

R2
Fil e : P rep Ch i n a Dem o 0 60 1 01 1.0 11 S am pl e ID: 0 .5 , P an NK PE sel e cti o n Ga te : G 1 T ota l E ve n ts: 1 00 00 Ga te % G ate d % T ota l G1 1 00 .00 9 6.4 0 G2 9 5.3 3 9 1.9 0
1.100
Density in g/mL
From: “Centrifugation Techniques III”, Nycomed Amersham
人
和 小鼠
低温冷藏的外周 血单个核细胞
脾细胞
的特点 Sep
• 负选, 只需要离心机 • 可以同时分选多份样品
– 取决于离心机的容量
• 分选的细胞量在
小鼠脾或骨髓细胞
Cell Antigen Targeted % Purity CD90+ (Thy1.2) 99 CD4+ 97 CD8+ 95 CD19+ 99 Pan NK (CD49b+) 92 CD11c+ (Spleen) 91 CD11c+ (BM) 94 Sca1+ 92 c-Kit+ 92
% Purity = # desired cells in enriched fraction x 100 # total nucleated cells in enriched fraction = % of total events in the desired cell gate (FACS profile)
分选方法的选择 • 样品种类 • 样品数量 • 每次需要分选的细胞数
常见问题
样品的前处理 • Ficoll
• 离心机 • 全血和单采的细胞
• 细胞计数
• 稀释液 • 细胞数
常见问题
分选过程中 • 细胞浓度 • 缓冲液 • 细胞混匀动作要点
Calculating Purity and Recovery
小鼠脾细胞
Cell Type T Cells CD4+ T Cells CD8+ T Cells B Cells % Purity 97 95 91 99
可正选或去除任何一种细胞
• PE 标记的抗体分选Kit • FITC 标记的抗体分选Kit • Biotin 标记的抗体分选Kit
Cell
细胞分选常见的问题
M1
Fil e : P rep Ch i n a Dem o 0 60 1 01 1.0 05 S am pl e ID: S tart Ga te : G 2 T ota l E ve n ts: 1 00 00 Ma rker % G ate d % T ota l A ll 1 00 .00 8 5.0 2 M1 4 .3 5 3 .7 0
StemCell Technologies Inc. 细胞分选产品
细胞分选和基本原理
• 细胞分选是把一种细胞从多细胞样品中分 离出来 • 用抗体标记细胞，同时被用的抗体被萤光 标记或连接免疫磁珠或其它 • 利用萤光和免疫磁珠的特性来分离细胞
细胞分选常用方法
•
•
密度梯度离心(Ficoll)离心
抗体标记分离
3. Dense Particles 5. Spin 10-20min at 1200xg
的细胞分选资料
人的外周血细胞(PBMC)
Cell Type CD3+ CD4+ CD8+ CD19+ CD19+,no anti-CD43 CD56+ n 5 5 5 5 5 5 % Purity 97 +/- 1 95 +/- 1 89 +/- 8 94 +/- 4 93 +/- 6 84 +/- 5
M1
Fil e : P rep Ch i n a Dem o 0 60 1 01 1.0 11 S am pl e ID: 0 .5 , P an NK PE sel e cti o n Ga te : G 2 T ota l E ve n ts: 1 00 00 Ma rker % G ate d % T ota l A ll 1 00 .00 9 1.9 0 M1 9 7.2 9 8 9.4 1
负选资料
人的外周血细胞(PBMC)
Cell Type T Cells CD4+ T Cells Naive CD4+ T Cells Memory CD4+ T Cells CD8+ T Cells B Cells NK Cells Progenitor Enrichment (previously frozen cells) % Purity 98 93 94 95 97 99 86 BM 36-49 CB 26-87 MPB 31-65
• Abbiotin
anti-biotin TAC(小鼠)
加入免疫磁珠 孵育后稀释
放置磁极中 倒出未标记的细胞
正选资料
人的外周血细胞(PBMC)
Cell Antigen Targeted % Purity CD3+ T Cells 99 CD4+ T Cells 99 CD8+ T Cells 97 CD14+ 99 CD19+ 98 CD56+ 94 CD33+ 95 CD34+ (Frozen CB) 92 CD34+ (Fresh MPB) 97
Tetrameric Antibody Complex (TAC)
Magnetic Nanoparticle (160 nm)
Relative Sizes of Magnetic Particles used in Cell Separation
Cell
的细胞分选过程
标记 结合磁珠 分选
• Ab (TAC) (人)
室温下 20分钟 用缓冲液 稀释
标记
离心
Hale Waihona Puke Baidu
收集
的密度分离液DM-L
• 为了最大限度回收淋巴细胞，StemCell专门研制了 一种适合RosetteSep™的密度分离液—— DM-L • DM-L 的密度：1.081 g / mL • DM-L 的渗透压与人外周血的渗透压相同(isoosmolar) • 适用于以下的淋巴细胞分选: – CD3+ T cells - CD8+ T cells – CD4+ T cells - B cells
Density of Fresh Leukocytes
Monocytes Lymphocytes Basophils Neutrophils Eosinophils Erythrocytes
DM-L: 1.081 g/mL Ficoll: 1.077 g/mL
1.060
1.070
1.080
1.090
R1
R1
Fil e : P rep Ch i n a Dem o 0 60 1 01 1.0 05 S am pl e ID: S tart Ga te : G 1 T ota l E ve n ts: 1 00 00 R2 Ga te % G ate d % T ota l G1 1 00 .00 9 7.6 3 G2 8 7.0 8 8 5.0 2
直接标记人的细胞
AntiCell
AntiParticle
Cell
Tetrameric Antibody Complex (TAC)
Magnetic Nanoparticle (160 nm)
间接标记小鼠细胞
Cell
Biotin/Fluo Antibody Antibiotin/Fluo
AntiParticle
FACS Gate
R1
R2
panNK+ Selected from Mo Spleen
S ta rt
Start
0 .5 , Pa Selected NK+nNK P E se l ectio n Fil e : P rep Ch i n a Dem o 0 60 1 01 1.0 05 S am pl e ID: S tart Ga te : No G ate T ota l E ve n ts: 1 00 00 Ga te % G ate d % T ota l G1 9 7.6 3 9 7.6 3 G2 8 5.0 2 8 5.0 2 Fil e : P rep Ch i n a Dem o 0 60 1 01 1.0 11 S am pl e ID: 0 .5 , P an NK PE sel e cti o n Ga te : No G ate T ota l E ve n ts: 1 00 00 Ga te % G ate d % T ota l G1 9 6.4 0 9 6.4 0 G2 9 1.9 0 9 1.9 0
% Recovery =
# desired cells in enriched fraction x 100 # desired cells in start
= (% purity in enriched) x (total nucleated cells in enriched) x 100 (% purity in start) x (total nucleated cells in start)
小鼠的脾细胞
Cell Type CD3 CD4 CD8 B Cells n 5 12 7 8 % Purity 93 +/- 2 89 +/- 3 88 +/- 2 97 +/- 1
Values are the mean ± SD
新型，高效，易行的免疫磁珠分选技术 • 新：不用柱子，只需用磁极，所用的磁珠很小 • 高效：效率-分选过程不用洗细胞(省时省力); 效果-分选的细胞纯度高 • 易：操作过程简单易行 • 广：可做正选和负选 • 适应性强：在理论上可以分选任何一种细胞
– 106 cells in Eppendorf - 109 cells in 50 mL tube
• 适用于低温冷藏的人外周血单个核细胞(PBMC)和 小鼠脾细胞
直接标记人的细胞
Anti-cell
Unwanted Cell
Anti- particle
Tetrameric Antibody Complex (TAC)
Data analysis
的技术要领
• 细胞稀释后，用吸管混匀细胞（不要倒置试管） • 倒出未标记的细胞时，让液体连续流淌，试管停 留在最后的位置约2秒钟，但不要刻意抖下最后 一滴细胞液
Product Information Available
缺点
• 需要特异性的靶细胞标记 • 可能引起细胞活化 • 需要多种抗体标记不需要的 细胞
细胞分选产品
StemCell Technologies Inc. 的细胞分选原理
• 利用抗体四聚体(Tetrameric Antibody Complex, TAC)来分选细胞
Cell Cell
TAC 直接标记
磁珠 间接标记
TAC
磁珠
• • • •
适用于人的全血细胞样品 是一种负选方法 基本原理：抗体标记和免疫密度离心法 需要的仪器：离心机
Direct Labeling of Human Cells
不需要的细胞
分选的过程
把RosetteSep™ 抗 体混合液加入细胞 样品中 把细胞样品置于 密度分离液上
Dense Particle(1mm)
间接标记小鼠的细胞
Biotinylated Antibody AntiBiotin AntiParticle
Unwanted Cell
Tetrameric Antibody Complex (TAC)
Dense Particle(1mm)
SpinSep 的分选过程
Label
1. Antibody Cocktail
Layer & Spin
Collect
6. Collect almost entire volume 7. Wash to remove Density Medium
4. Layer over SpinSep® Density 2. Anti-Biotin TAC (mouse Medium only)
1. 免疫密度离心 2. 免疫磁珠 3. 流式
正选 和 负选
正选
需要得细胞
标记需要得细胞
负选
需要得细胞
标记不需要得细胞
正选和负选的比较
正选 负选
优点
• 只需要一种抗体 • 分离出的细胞纯度高 • 对于比例小的细胞群，正选容 易得到高纯度 • 需要的细胞没有被抗体等标记 • 对需要的细胞，不需要特异性的 细胞标记