米黑根毛霉脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质研究

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一种改良的米黑根毛霉脂肪酶基因及其在酵母展示中的应用[发明专利]

专利名称：一种改良的米黑根毛霉脂肪酶基因及其在酵母展示中的应用
专利类型：发明专利
发明人：林影,韩双艳,郑穗平,韩振林,黄登峰,王小宁
申请号：CN200810198949.1
申请日：20081007
公开号：CN101481695A
公开日：
20090715
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种改良的米黑根毛霉脂肪酶基因及其在酵母展示中的应用。

改良的米黑根毛霉脂肪酶基因序列为SEQ.ID.No2。

含有所述基因的重组载体pMD18－T－RML，RML是指脂肪酶基因；携带该质粒的菌株Escherichia coli TOP10/pMD18－T－RML保藏号为：CCTCC M208136。

本发明将该基因转入到毕赤酵母宿主菌中，实现米黑根毛霉脂肪酶在毕赤酵母中的展示表达，提供的毕赤酵母菌能有效展示米黑根毛霉脂肪酶，该脂肪酶能广泛应用于制造脂肪酸甲酯、己酸乙酯、具有不同熔点且不含各式脂肪酸的三甘酯以及一些“重构脂”等。

申请人：华南理工大学
地址：510640 广东省广州市天河区五山路381号
国籍：CN
代理机构：广州粤高专利代理有限公司
代理人：何淑珍
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南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母中的分泌型表达及酶学性质初探

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母中的分泌型表达及酶学性质初探李迅;邓若冰;王飞【摘要】将南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA(含pAOX1启动子)和pGAPZαA(含pGAP启动子)中,转入毕赤酵母表达宿主KM71H,经三丁酸甘油酯平板活性筛选获得高效表达的酵母工程菌株.分泌型表达CLAB酵母工程菌的酶活较高,经摇瓶发酵96 h后,CLAB活力达到11.1U/mL.经发酵罐高密度发酵84h后,CLAB活力达到179.2 U/mL,蛋白质量浓度为1.36 mg/mL.体积分数12％SDS-PAGE凝胶电泳显示重组CALB相对分子量为36 kDa.该酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0.在pH7.5 ～9.5较稳定,经55℃保温1h,残余酶活还有48.5％.5 mmol/L Mg2+、Ni+、Co2+和体积分数0.10％SDS对CALB酶活影响很小,而Zn2强烈抑制酶催化反应,体积分数0.05％ Triton X-100对CALB稍有激活作用.【期刊名称】《四川师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(037)006【总页数】6页(P911-916)【关键词】南极假丝酵母脂肪酶B;毕赤酵母;分泌表达;酶学性质【作者】李迅;邓若冰;王飞【作者单位】南京林业大学化学工程学院,江苏南京210037;江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室,江苏南京210037;南京林业大学化学工程学院,江苏南京210037;江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室,江苏南京210037;南京林业大学化学工程学院,江苏南京210037;江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室,江苏南京210037【正文语种】中文【中图分类】Q556+.1;Q786随着传统化学合成工艺带来的负面影响越来越受到人们重视，人类迫切需要找到绿色工艺来取代现有的工艺，以减少对环境的破坏.以生物酶类为催化剂的合成工艺可以很好地克服化学工艺的高能耗及高污染的缺陷，同时还具有选择性专一等特点，目前已应用于有机合成、手性化合物拆分和医药中间体等领域.脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)，也称羧酸酯酶(carboxylesterases)，它催化长链脂酰甘油水解为甘油、游离脂肪酸和单、双甘油酯［1］.南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)，是一种优良的脂肪酶，CALB为催化剂的合成工艺具有低能耗、无污染、转化率高、选择性专一等优点，CALB没有界面活性［2］，有极强的立体选择性，且具有广谱的底物接受性，对非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活性［3-5］，因此具有很高的潜在工业价值，广泛应用于有机合成、手性化合物拆分和医药中间体等领域［6-10］.但商业化的CALB价格昂贵，如诺维信公司生产的Novozyme 435价格在300元/g左右，限制了其在工业化大规模生产中的应用.目前，CALB基因已成功被克隆，并在米曲霉(Aspergillus oryae)［11］、大肠杆菌(Escherichia coli)［12］、毕赤酵母(Pichia pastoris)［13］、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)［14］等宿主菌中实现表达，但 CALB在大肠杆菌中表达无法正确后修饰，其大多为包涵体［12］，而在酿酒酵母中容易过度糖基化而影响CALB活力［15］.而巴斯德毕赤酵母表达系统除了菌体生长速度快，表达量高，遗传稳定性好，分泌效率高等特点，而且自身分泌的蛋白较少，减少了分离纯化的成本［16］，本研究将 CALB基因克隆至载体pPICZ A和pGAPZ A中，转至KM71H中，筛选获得高效表达CALB的酵母工程菌株，并对重组酶的酶学性质进行初步分析.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株和质粒南极假丝酵母(C.antarctica，NRRL No.Y-7954)来源于美国农业研究菌种保藏中心.大肠杆菌(E.coli)DH5，毕赤酵母(P.pastoris)KM71H和质粒pPICZαA和pGAPZαA购自Invitrogen(Carlsbad，California，USA)公司.引物由上海生工生物工程有限公司合成.1.1.2 试剂与仪器对硝基苯酚辛酸酯(pNPO，4-nitrophenyl octanoate)，RNase A，氨苄青霉素(Amp)购自Sigma公司;Ex-Taq聚合酶，DNA ATailing试剂盒，限制性内切酶等购自TaKaRa公司;PCR纯化、低分子量标准蛋白质和提质粒试剂盒购自BIOMIGA公司;Yeast extract，Peptone购自 Oxoid公司.其余生化试剂和药品均为分析纯.1.1.3 培养基 LB培养基、YPD和YPDS培养基等参考Invitrogen公司的毕赤酵母表达手册.1.2 方法1.2.1 载体构建及酵母电转化抽提南极假丝酵母的基因组DNA，以此为PCR模板，参照GeneBank上发表的南极假丝酵母脂肪酶B基因序列(Gene-Bank登录号:Z30645)设计两端特异性引物，上游引物:5'-CCCGAATTCGCCACTCCTTTGGTGAAGC-3’(斜线为EcoRI酶切位点);下游引物:5'-CCCGGTACCTCAGGGGGTGACGATGCCGGAGCAG-3’(斜线为KpnI酶切位点).(采用PCR方法扩增获得目的基因calb)PCR产物经EcoRI和KpnI双酶切后连入pPICZαA和pGAPZαA，获得重组载体pPICZαA-CALB 和pGAPZαA-CALB.重组质粒经Sac I线性化后电激整合入毕赤酵母KM71H细胞基因组中，涂布含抗生素Zeocin 100 μg/mL的YPDS平板，30℃培养48 h后，挑取单菌落于YPD培养基中进行培养.1.2.2 CALB重组工程菌的筛选和表达挑取单菌落接种于含体积分数5%三辛酸甘油酯的YNB为基础培养基的平板上，30℃培养箱中培养3 d以上，并每天补充100 μL甲醇至平板盖上，观察并选取水解圈较大的重组子接种于YPD培养基中培养，用于后续进一步诱导表达.以pPICZ A为表达载体的毕赤酵母工程菌表达过程如下:用灭菌的竹签挑取单菌落接种于含25 mL BMGY培养基的250 mL摇瓶中，30℃、200 r/min培养至OD600为2～6，约24 h，严格无菌操作.在8 000 r/min下离心5 min，弃上清，将菌转入新鲜的BMMY培养基中，至OD600约为1.0，严格无菌操作，30℃、200 r/min恒温摇床培养96 h，每24 h添加一次甲醇至终体积分数为0.5%.12 000 r/min离心5 min，发酵液上清液即为粗酶液.以pGAPZαA为表达载体的毕赤酵母工程菌表达过程如下:挑取鉴定正确的阳性单菌落至含有50 mL YPD液体培养基的250 mL锥形瓶中，在30℃和 250 r/min的条件下振荡培养 96 h，12 000 r/min离心5 min，发酵液上清即为粗酶液.1.2.3 CALB的高密度发酵将筛选得到的高产脂肪酶基因工程菌挑取单菌落接种于BMGY培养基中摇瓶培养，再转接至大瓶BMGY培养基中培养，并作为发酵罐种子液.将种子液接种于发酵罐中，控制溶氧值DO为35%，自动流加氨水维持pH值为8.0，发酵24 h左右基础培养基碳源耗尽，DO迅速上升至90%，此时以40%的流速恒速补加甘油，直到工程菌OD600达到200，停止补加甘油.待甘油停加2 h后，开始进入甲醇诱导阶段，5 mL/h的速度流加甲醇，每小时以10%递增速度补加甲醇，直到10 mL/h的速度，维持此流加速度.培养至84 h.1.2.4 测定方法以pNPO为底物的分光光度法测定脂肪酶酶活.取100 μL适宜质量浓度的酶液(质量浓度控制在所测吸光度为0.1～1之间)和850 μL 的0.05mol/L Tris·HCl(pH7.5)缓冲液混合，空白样则用缓冲液代替酶液的体积，预热5 min，加入50 μL 13.5 mmol/L pNPO 作为底物，在40℃准确反应5 min后，立即加入100 μL异丙醇终止反应.将反应液13 000 r/min离心5 min，取上清，在410 nm处测吸光值.一个酶活单位(U)定义为在pH7.5、40℃条件下，每分钟释放1 mol对硝基苯酚(pNP)所需要的酶量.蛋白质量浓度的测定方法采用Bradford 法［17］.1.3 酶学性质测定1.3.1 最适温度和温度稳定性分别在20、30、40、50、60和70℃下测定pNPO酶活，以确定重组CALB的最适反应温度.将适宜质量浓度酶液分别放在30、40、55和60℃下保温2 h测定 pNPO酶活，依次在 20、40、60、80、100 和120 min 取样，以确定重组 CALB的温度稳定性.将所取酶样按照1.2.4方法测定pNPO酶活，酶活测定条件均为pH8.0和40℃，每个样品重复3次.1.3.2 最适pH值和pH稳定性分别在pH值为5～10的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液下测定pNPO酶活，以确定CALB的最适反应pH值.将酶液分别在不同pH的0.1 mol/L缓冲液(pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5 和 10.0)中16 ℃条件下放置1 h后，在40℃，pH8.0的条件下按照1.2.4方法测定pNPO酶活，以测定CALB的pH稳定性，每个样品重复3次.1.3.3 金属离子和表面活性剂对重组脂肪酶的影响将酶与不同的金属离子(Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Ni+、Ba2+和 Co2+，5 mmol/L;体积分数0.1%SDS和0.05%Triton-X100)混合后常温放置1 h，然后取样在pH8.0值为和40℃条件下按照1.2.4方法测定pNPO酶活，对照样不加添加剂，其他条件相同，每个样品重复3次.2 结果与分析2.1 重组载体的构建以南极假丝酵母NRRL Y-7954基因组DNA为模板，PCR扩增得到CALB成熟肽编码序列，PCR产物经EcoR I和Kpn I双酶切后连入pPICZ A和 pGAPZ A，获得重组载体pPICZ A-CALB和pGAPZ A-CALB.重组质粒经双酶切(EcoR I和Kpn I)鉴定正确(图1)后转入毕赤酵母KM71H中表达.2.2 启动子对重组CALB表达的影响对比不同质粒pPICZαA(启动子为 AOX)和pGAPZαA(启动子为GAP)对CALB基因在毕赤酵母中表达的影响，结果显示，以AOX启动子型的重组菌较GAP启动子型的重组菌具有更高的表达量和酶活，pPICZαA-CALB+KM71H重组菌培养4 d后酶活达11.11 U/mL，蛋白质量浓度为0.45 mg/mL，较原始菌中脂肪酶酶活(2.56 U/mL)高四倍多.而pGAPZαA-CALB+KM71H重组菌培养4 d后酶活仅为0.52 U/mL，蛋白质量浓度为0.020 mg/mL因此，选择AOX启动子型的重组菌(pPICZαA-CALB+KM71H重组菌)进行后续的研究(见图2).2.3 CALB的筛选和高密度发酵挑选三丁酸甘油脂平板中有较大水解圈的重组菌，将菌体保存于-80℃含有体积分数15%甘油的YPD管中，并对这些重组菌进行摇瓶发酵，测定脂肪酶活力，其中pPICZαA-CALB重组菌产脂肪酶酶活最高为42.90 U/mL，蛋白质质量浓度为0.51 mg/mL，比酶活为83.79 U/mg，较未筛选之前(见2.2)有大幅提高，并且酶活高于相关文献报道［15，18］.选择该菌株进行高密度发酵，培养至84 h，发酵液酶活可达179.19 U/mL，蛋白质质量浓度为1.36 mg/mL，SDS-PAGE蛋白电泳分析如图3，显示重组蛋白亚基为37 kDa，且目的蛋白的条带相对单一，可进行下一步脂肪酶酶学定性.2.4 酶学性质测定2.4.1 最适温度和温度稳定性如图4(A)所示，CALB在40℃时酶活达到最大.在30～40℃范围内，保温60 min，重组CALB酶活都能保持70%以上，在55℃时，CALB酶活降低较快，保温60 min后残余CALB酶活为未保温样品的48.5%.可认为，该酶在在30～55℃范围内，能保持较高的反应活性，也有较好的温度稳定性.2.4.2 最适pH值和pH稳定性如图5所示，CALB在弱碱环境具有较好的活性，在pH值为8.0时，活性最高.在酸性条件下，酶活都低于最高酶活的30%.CALB的pH稳定性结果如图5(B)所示.在pH7.5～9.5之间的缓冲液中处理1 h后仍保持60%以上的水解活力，pH8.5时酶的稳定性最大，之后酶的稳定性呈下降趋势.该酶在酸性条件下稳定性较差，在pH为6.5以下保温1 h后基本测不到酶活.由此表明，CALB在弱碱性条件下具有较好的稳定性.2.4.3 金属离子和表面活性剂的影响不同的金属离子和表面活性剂对重组CALB的影响结果如图6所示，发现Zn2+对CALB的抑制作用最强，CALB酶活为未加金属离子样品的26.1%.Mg2+、Ni+、Co2+对酶活几乎没有影响;在 Ca2+、Mn2+、Cu2+、Ba2+的作用下，脂肪酶的酶活都有较多的下降.非离子表明活性剂 Triton X-100(体积分数0.05%)可提高CALB的活性，而阴离子表面活性剂SDS(体积分数0.1%)对CALB的活性略有抑制作用.3 结论但由于CALB的高成本难以实现工业应用，本研究克隆CALB基因至毕赤酵母中进行分泌型表达，通过活性平板筛选和高密度发酵，无需经过纯化步骤即得到较高纯度的重组CALB，较高纯度的重组CALB比酶活达到131.8 U/mg.重组CALB最适反应温度为40℃，最适pH值为8.0，重组CALB在55℃范围内保温1 h，仍能保持48.5%的活力，重组的CALB在pH7.5～9.5之间的溶液中比较稳定，发现Zn2+对CALB有强烈的抑制作用;Mg2+、Ni+和Co2+对酶活几乎没有影响;非离子表明活性剂Triton X-100可提高CALB的活性，而阴离子表面活性剂SDS对CALB的活性略有抑制作用.此结果与孙金鹏等［13］的研究结果差异较大，分析是和酶活测定方法不同有关，也可能和CALB基因来源的菌株不同有关.后续研究会利用大孔树脂等材料对CALB进行固定化研究，有望进一步降低CALB的使用成本.参考文献［1］粟慧君，马骏，蔡莉，等.合成有机载体固定化猪胰脂肪酶性质研究［J］.四川师范大学学报:自然科学版，2008，31(5):586-589.［2］Uppenberg J，Hansen M T，Patkar S，et al.The sequence，crystal structure determination and refinement of two crystal forms of lipase B from Candida antarctica［J］.Structure，1994，2:293-308.［3］Kirk O，Christensen M W.Lipases from Candida antarctica:unique biocatalysts from a unique origin［J］.Organic Process Research ＆Development，2002，6(4):446-451.［4］Senanayake S P J N，Shahidi F.Incorporation of docosahexaenoic acid(DHA)into evening primrose(Oenothera biennis L)oil via lipase-catalyzed transesterification［J］.Food Chemistry，2004，85(4):489-496. ［5］Sivalingam G，Chattopadhyay S，Madras G.Enzymatic degradation of poly(ε -caprolactone)，poly(vinylacetate)and their blends by lipases ［J］.Chemical Engineering Science，2003，58(13):2911-2919.［6］Rodriguez J M，Roura E，Contreras E.Biosynthesis of ethylbutyrate using immobilized lipase:a statistical approach［J］.Process Biochemistry，2005，40(1):63-68.［7］Monteiro C M，Lourenco N M，Afonsoo C A.Separation of secondary alcohols via enzymatic kinetic resolution using fatty esters as reusable acylating agents［J］.Tetrahedron:Asymmetry，2010，21:952-956.［8］De Gonzalo G，Brieva R，Sánchez V M，et al.Enzymatic resolution of trans-4-(4'-fluorophenyl)-3-hydroxymethylpiperidines，key intermediates in the synthesis of(-)-paroxetine［J］.J Organic Chem，2001，66(26):8947-8953.［9］Barbosa O，Ortiz C，Torres R，et al.Effect of the immobilization protocol on the properties of lipase B from Candida Antarctica in organic media:Enantiospecific production of atenolol acetate［J］.J Mol Catalysis B:Enzymatic，2011，71(3/4):124-132.［10］Jun C，BW J，Joo J C，et al.Thermostabilization of Candida antarctica lipase B by double immobilization:Adsorption on a macroporous 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毕赤酵母表达罗氏耶尔森氏菌（Yersinia rohdei）植酸酶和酶学特性研究

毕赤酵母表达罗氏耶尔森氏菌（Yersinia rohdei）植酸酶和酶学特性研究陈磊;许晶;韩红娟;邱瑾;孙百慧;彭日荷;姚泉洪【摘要】按毕赤酵母偏爱密码子，将来自Yersinia rohdei的植酸酶基因（YrAPPA）进行了化学合成，并成功在毕赤酵母GS-115中异源分泌表达，重组植酸酶分泌量能达到72μg/mL。

酶学特性研究结果表明：酶比活达到1500U/mg，重组植酸酶的最适反应温度和 pH分别为55℃和4.5；纯化的重组植酸酶能耐受60℃高温，且pH 3—7.5范围内重组植酸酶有良好的稳定性；Cu2＋、Zn2＋、Fe3＋对植酸酶活性有抑制作用；重组植酸酶有抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解特性。

%Yersinia rohdei phytase gene (YrAPPA)was chemically synthesized according to the codon usage of Pichia pastoris and successfully expressed in P.pastoris GS-1 1 5 ,with the secretion yield of recombinant phytase being up to about 72 μg/mL.The enzymatic characterization showed that the specific activity of enzyme is 1 500U/mg,and the optimal reacting temperature and pH of recombinant phytase are respectively 55 ℃ and 4.5;The purified recomb inant phytase can tolerate high temperature at 60 ℃ and has a good stability within pH 3—7.5;The phytase whose activity is inhibited by Cu2+,Zn2+ and Fe3+ has characteristics resistant to trypsin and pepsin.【期刊名称】《上海农业学报》【年(卷),期】2016(032)006【总页数】8页(P18-25)【关键词】植酸酶;酶学特性;毕赤酵母;电击转化;异源表达【作者】陈磊;许晶;韩红娟;邱瑾;孙百慧;彭日荷;姚泉洪【作者单位】上海海洋大学食品学院，上海201306; 上海市农业科学院生物技术研究所，上海201106;上海市农业科学院生物技术研究所，上海201106;上海市农业科学院生物技术研究所，上海201106;上海海洋大学食品学院，上海201306; 上海市农业科学院生物技术研究所，上海201106;上海海洋大学食品学院，上海201306; 上海市农业科学院生物技术研究所，上海201106;上海市农业科学院生物技术研究所，上海201106;上海市农业科学院生物技术研究所，上海201106【正文语种】中文【中图分类】Q78植酸即肌醇六磷酸及其盐类，广泛存在于植物组织和相应的粮食产品中，占其总量的1%—3%，其中磷含量占植物总磷的60%—90%，是磷和肌醇的主要储存形式［1-2］。

毕赤酵母高效表达人乳铁蛋白的研究

毕赤酵母高效表达人乳铁蛋白的研究姜铁民;贾士乾;陈历俊;吕加平;周伟明;张列兵【期刊名称】《中国乳品工业》【年(卷),期】2005(033)005【摘要】将人乳铁蛋白全长基因克隆至酵母表达载体pPIC9K中,并建立hLF/pPIC9K/SMD1168酵母表达系统,在细胞高密度发酵条件下,乳铁蛋白表达量约1 000 mg/L,并具有天然蛋白相似的糖基化结构.本研究为商业化生产人乳铁蛋白提供了理论依据.【总页数】4页(P4-7)【作者】姜铁民;贾士乾;陈历俊;吕加平;周伟明;张列兵【作者单位】北京三元食品股份有限公司,北京,102206;北京三元食品股份有限公司,北京,102206;北京三元食品股份有限公司,北京,102206;北京三元食品股份有限公司,北京,102206;北京三元食品股份有限公司,北京,102206;北京巴斯德科技有限公司,北京,100094【正文语种】中文【中图分类】TQ931【相关文献】1.雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达及其酶学性质研究 [J], 王建荣;刘丹妮;李鹏;刘金山;周平发;陈丽芝;聂金梅;钟开兴;李阳源2.角毛壳茵木聚糖酶基因xyn24在毕赤酵母中的高效表达及产酶的固定化研究 [J],王艳君;杨谦3.MAP30全长基因的克隆及在巴斯德毕赤酵母中的高效表达研究 [J], 朱振洪;杨威威;葛立军;万海同4.大肠杆菌K12植酸酶热稳定性突变体在毕赤酵母中的高效表达和性质研究 [J], 周玉玲;邹由;付玲;江维;战飞翔;康立新;马向东;马立新5.米黑根毛霉脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质研究 [J], 罗文;王治元;苗长林;吕鹏梅;何东;李惠文;杨玲梅;袁振宏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

促进米黑根毛霉脂肪酶分泌的毕赤酵母内源信号肽的筛选

促进米黑根毛霉脂肪酶分泌的毕赤酵母内源信号肽的筛选苗杨利，李站胜，韩双艳（华南理工大学生物科学与工程学院，广东省发酵与酶工程重点实验室，广东广州 510006）摘要：米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor miehei Lipase，RML）在造纸、食品、化妆品以及医药等行业应用广泛。

本研究通过SignalP 4.1在线预测软件预测出9种具有分泌潜力的毕赤酵母内源信号肽序列：FLO10、CPR5、PRY2、DSE4、NUP145、MSB2、SSP120、FRE2、FLO9。

以广泛应用的酿酒酵母α-交配因子（α-mating factor，α-MF）信号肽为对照，考察这九种内源信号肽对增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）和RML在蛋白酶缺陷型PichiaPink TM表达系统的分泌效果。

结果发现FLO10、PRY2、DSE4、MSB2、SSP120、FRE2能有效介导EGFP分泌，且PRY2、DSE4、MSB2、FRE2介导EGFP的分泌水平优于α-MF，分别是α-MF 的2.15倍、1.15倍、1.33倍、1.30倍；FLO10、PRY2、DSE4、FRE2能有效介导RML的分泌，且FLO10介导RML的分泌水平最高，是α-MF 的1.50倍，说明内源信号肽FLO10更能有效分泌RML。

本研究为提高米黑根毛霉脂肪酶在蛋白酶缺陷型毕赤酵母的表达量奠定了一定的基础。

关键词：蛋白酶缺陷型毕赤酵母；信号肽；增强型绿色荧光蛋白（EGFP）；米黑根毛霉脂肪酶（RML）文章篇号：1673-9078(2019)010-155-163 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2019.10.022 Screening Endogenous Signal Peptides in Pichia pastoris for Promoting the Secretion of Lipase from Rhizomucor MieheiMIAO Y ang-li, LI Zhan-sheng, HAN Shuang-yan(Key Laboratory of Fermentation and Enzyme Engineering, School of Bioscience and Bioengineering, South ChinaUniversity of Technology, Guangzhou 510006, China)Abstract: Rhizomucor miehei Lipase (RML) is widely used in the paper, food, cosmetics, pharmaceutical industries. In this study, nine potential endogenous signal peptide-like sequences with a secretory potential from Pichia pastoris were predicted by a SignalP 4.1 online software: FLO10, CPR5, PRY2, DSE4, NUP145, MSB2, SSP120, FRE2 and FLO9. Using the widely used α-mating factor (α-MF) signal peptide of Saccharomyces cerevisiae as the control, the effects of the nine endogenous signal peptides on the secretion of the enhanced green fluorescent protein (EGFP) and RML in a protease-deficient PichiaPink TM expression system were investigated. The results showed that FLO10, PRY2, DSE4, MSB2, SSP120 and FRE2 could effectively mediate the secretion of EGFP. Moreover, the secretion level of EGFP mediated by PRY2, DSE4, MSB2 and FRE2 were 2.15, 1.15, 1.33, 1.30 folds, respectively, that of α-MF. FLO10, PRY2, DSE4 and FRE2 could effectively mediate RML secretion, with the highest secretion level of RML with FLO10 (which was 1.50 folds that of α-MF). This study laid a foundation for improving the expression of RML in protease-deficient Pichia pastoris.Key words: protease-deficient Pichia pastoris; signal peptide; enhanced green fluorescent protein (EGFP); Rhizomucor miehei Lipase (RML)酵母表达系统是目前外源蛋白表达最常用的真核表达系统[1]，表达载体中各表达元件均会显著影响外收稿日期：2019-01-24基金项目：国家科技支撑计划项目（2012AA022205）作者简介：苗杨利（1993-），女，硕士，研究方向：酶学与酶工程、发酵工程通讯作者：韩双艳（1976-），女，教授，研究方向：生物催化、酶工程、发酵工程源蛋白的表达效率。

重组毕赤酵母发酵产脂肪酶及其应用

重组毕赤酵母发酵产脂肪酶及其应用引言:脂肪酶是一种重要的生物催化剂，在食品加工、工业生产和生物医学领域中具有广泛的应用前景。

而重组毕赤酵母发酵产脂肪酶则成为了一种备受关注的方法，本文将从发酵产脂肪酶的原理、重组毕赤酵母的构建、脂肪酶应用以及前景展望等方面进行阐述。

一、发酵产脂肪酶的原理脂肪酶是一类催化脂肪水解的酶，其生产过程通常采用微生物发酵。

重组毕赤酵母发酵产脂肪酶的原理是通过将脂肪酶的基因导入毕赤酵母中，通过发酵过程使其表达并产生脂肪酶。

脂肪酶的基因导入毕赤酵母后，经过转录、翻译等生物过程，最终在酵母细胞内合成脂肪酶。

这种方法具有高效、经济、环境友好等优点，因此备受关注。

二、重组毕赤酵母的构建重组毕赤酵母的构建是实现发酵产脂肪酶的关键。

首先，需要从天然来源中提取脂肪酶基因。

然后，将脂肪酶基因与毕赤酵母的表达载体连接，并导入毕赤酵母细胞中。

接下来，通过筛选和培养优化等方法，得到高效表达脂肪酶的重组毕赤酵母菌株。

通过这一构建过程，可以实现大规模、高效率产脂肪酶的目标。

三、脂肪酶的应用脂肪酶在食品加工、工业生产和生物医学领域中有着广泛的应用。

在食品加工领域，脂肪酶可用于改善食品的质感和口感，例如在奶制品中应用脂肪酶可使其更加顺滑、细腻。

在工业生产领域，脂肪酶可用于生产生物柴油和洗涤剂等，具有良好的环境友好性。

在生物医学领域，脂肪酶可用于药物制剂、诊断试剂和生物传感器等，对疾病的治疗和检测有着重要的作用。

四、前景展望重组毕赤酵母发酵产脂肪酶技术的发展为脂肪酶的生产和应用提供了新的途径。

随着基因工程技术的不断进步，重组毕赤酵母发酵产脂肪酶的效率将进一步提高，产量将大幅增加。

同时，脂肪酶的应用领域将不断扩展，为食品工业、化工工业和医药领域带来更多的创新和应用。

结论:重组毕赤酵母发酵产脂肪酶是一种高效、经济、环境友好的方法。

通过构建重组毕赤酵母菌株，可以实现大规模、高效率产脂肪酶的目标。

脂肪酶在食品加工、工业生产和生物医学领域中有着广泛的应用，且前景广阔。

毕赤酵母高密度发酵产脂肪酶条件的研究

ｔｈａｔｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆＯ．５％ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ（ｗ／ｖ）ａｎｄ１％ｐｅｐｔｏｎｅ（ｗ／ｖ）ｉｎ３ｐｏｔｒｉｏｎｓ（ｏｎｃｅｅｖｅｒｙ４８ｈｏｕｒｓ）ａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎｃｏｕｌｄｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｌｉｐａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｔｈｅｍａｘｉｍｕｍｅｎｚｙｍｅａｃ —
（１．ＬａｉｙｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｉｍｉｔｅｄＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｈｅｎｇｚｈｏｕ３１２４００，Ｃｈｉｎａ；
２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈ￣ｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００１４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｌｉｐａｓｅｂｙｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｉｎ１５Ｌｆｅｒｍｅｎｔｅｒ．
ｗｅｒｅｐＨ５．０，ｆｅｍｅｒｎｔａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ３０。Ｃ，ｓｔｉｒｉｎｇｓｐｅｅｄ２５０ｒ／ｍｉｎ，ｉｎｏｃｕｌｕｍｖｏｌｕｍｅ５％，ｄｉｓ－ｓｏｌｖｅｄｏｘｙｇｅｎ２０％一３０％，ｍｅｔｈａｎｏｌ１２９Ｌａｎｄｆｅｍｅｒｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ１６０－１７０ｈ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄ

一种毕赤酵母整合高效表达胞外N-糖基化枯草芽孢杆菌亮氨酸氨肽酶

专利名称：一种毕赤酵母整合高效表达胞外N-糖基化枯草芽孢杆菌亮氨酸氨肽酶的方法
专利类型：发明专利
发明人：田亚平,席宏星,周楠迪
申请号：CN201410227057.5
申请日：20140527
公开号：CN104004672A
公开日：
20140827
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种毕赤酵母整合高效表达胞外N-糖基化枯草芽孢杆菌亮氨酸氨肽酶的方法，属于生物酶工程技术领域。

本发明所构建的亮氨酸氨肽酶在重组毕赤酵母中的整合表达，不仅具有很好的遗传稳定性，且N-糖基化后的氨肽酶温度稳定性与底物亲和力都获得一定的提升，为氨肽酶的产业化和在食品领域中的应用奠定了优良的基础。

申请人：江南大学
地址：214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学生物工程学院
国籍：CN
代理机构：无锡市大为专利商标事务所(普通合伙)
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黑曲霉脂肪酶全基因合成及其在毕赤酵母中的表达

ｂ）ｌＡ２２７ｂ）ｌＡ３２４ｂ）ｌＡ４２０ｂ）再以基因头ｌ１和基因尾ｌ２ｐ、ｉｐ（３ｐ、ｉｐ（３ｐ和ｉｐ（１ｐ。ｉｐｉ６为引物，ｌＡ１ｌＡ２、ｉＡ３和ｐ以ｉｐ、ｉｐｌｐ
ｌＡ４混合物为模板进行第二轮ＰＲ扩增，到的产物经加Ａ处理后，接到栽体ｐｉｐＣ得连ＭＤ１一上，取重组子测序。通８Ｔ挑过ＰＲ扩增对人工合成的基因进行校正，到完全正确的ｌｐ基因。将优化后的基因克隆到表达栽体ｐＩ９上，得Ｃ得ｉＰＣＫ获的重组质粒ｐＩｇｌ经线性化后转化毕赤酵母Ｇｌ５菌株，建分泌型表达ＬＰ的酵母工程茵，４８梯度筛选，ＰＣＫ— ｐｉＳ１构ＩＧ１得到高拷贝稳定整合菌株。为重组黑曲霉脂肪酶的规模化制备奠定了基础。关键词：曲霉；肪酶；基因合成；赤酵母；达黑脂全毕表中图分类号：８Ｑ７６文献标识码：Ａ文章编号：６２５２（０００ —０４ — ０１７— ４５２１）６０５５
自行保存；ｒＳＡＲＨＳＤＰｉＴｍｅＮＡ聚合酶、４ＤＴＮＡ连接酶、限制性内切酶（ｏＲ、ｔ）ＴａＲＥｃＩＮｏ，Ｋａａ公司；Ｉ
Ｓｌ，生物工程（连）限公司；粒提取试剂盒、ａ宝Ｉ大有质ＰＲ产物纯化试剂盒、回收试剂盒，ｙｅＣ胶Ａｘｇｎ公司；电泳仪、转仪，ｉＲａ公司。电Ｂｏｄ

根癌农杆菌介导脂肪酶在无孢黑曲霉中的高效表达

根癌农杆菌介导脂肪酶在无孢黑曲霉中的高效表达潘力;王云艳;王斌;何攀;李俊星【摘要】黑曲霉(Aspergillus niger)具有高效的蛋白表达和分泌能力.为实现异源蛋白在无孢黑曲霉中的高效重组表达,在优化遗传筛选标记的基础上,建立了根癌农杆菌介导的、以潮霉素抗性基因为筛选标记的黑曲霉转化体系.利用该体系介导米黑根毛霉脂肪酶(RML)转化黑曲霉SH-1,通过PCR鉴定、酶活检测、镍柱亲和层析及SDS-PAGE电泳检测等确定成功获得了RML的黑曲霉转化子,并通过发酵条件优化实现了RML的高效表达,对硝基苯酚比色法测得转化子酶活最高可达15U/mL,是其在酵母中表达水平的10倍以上.%Aspergillus niger (A. niger) owns effective capabilities of protein expression and secretion. In order to implement the effective recombinant expression of heterologous protein in non-spore A. niger, several selection markers were evaluated and hygromycin B resistance gene was selected to establish an Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens)-mediated transformation system of A. niger. Then, Rhizomucor miehei lipase ( RML) was transformed into A. niger SH-1 via the A. tumefaciens-medialed transformation and was verified by means of PCR identification, enzyme activity assay, Ni affinity chromatography and SDS-PAGE. Finally, RML transformants effectively expressing RML protein were obtained after the fermentation optimization. The p-nitrophenol colorimetry results show that the transformants possesses a lipase activity of 15U/mL, which is more than ten times that expressed in yeast.【期刊名称】《华南理工大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(040)005【总页数】6页(P84-89)【关键词】无孢黑曲霉;根癌农杆菌介导转化;米黑根毛霉脂肪酶;基因表达【作者】潘力;王云艳;王斌;何攀;李俊星【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】Q812黑曲霉(Aspergillus niger)是丝状真菌中的重要类群，具有高效的蛋白表达、分泌和修饰能力，被美国食品及药物管理局(FDA)认定为安全菌株，在食品、医药、饲料、工业酶制剂等领域正受到越来越多的关注［1-4］.在基因工程中，外源基因进入黑曲霉细胞后会整合在其染色体上，重组子具有很高的遗传稳定性［5］，有利于异源基因的高效表达，因此黑曲霉作为异源蛋白的重组表达系统日益受到重视.黑曲霉作为表达系统的关键技术是遗传转化方法的建立.根癌农杆菌介导的转化(ATMT)具有操作简便、重复性好等优点［6］，其效率远高于原生质体转化、电转化等传统方法［7］，已成功应用于丝状真菌的遗传转化［8-11］.目前，ATMT 介导丝状真菌转化局限于基因功能研究［6］，钟耀华［12］曾利用 ATMT 转化瑞氏木霉分析其生长代谢突变子.然而，由于遗传筛选标记的限制，利用ATMT介导黑曲霉表达异源蛋白的研究鲜见报道.本研究以在轻工食品行业具有重要应用的米黑根毛霉脂肪酶(RML)为研究对象，在优化遗传筛选标记的基础上，采用根癌农杆菌介导RML表达载体转化无孢黑曲霉，并对转化子表达RML进行初步的发酵条件优化，以期为RML的大规模工业应用奠定基础.1 材料与方法1.1 菌种与质粒无孢黑曲霉SH-1，华南理工大学生物科学与工程学院微生物实验室保藏;根癌农杆菌LBA4404，由广东省农科院惠赠.华南理工大学生物科学与工程学院微生物实验室构建了3种根癌农杆菌工程菌:LBA4404A含pHGW-PT表达载体、潮霉素(HygB)抗性基因、吡啶硫胺素(PT)抗性基因;LBA4404B含pHGW-amdS表达载体、HygB抗性基因、乙酰胺酶基因(amdS);LBA4404C含脂肪酶表达载体pHGWRML、HygB抗性基因、RML基因表达盒(3'端添加His6组氨酸标签)［13］.1.2 培养基根癌农杆菌LC培养基、黑曲霉诱导培养基(IM培养基)、黑曲霉基础培养基(MM 培养基)、乙酰胺培养基参照文献［8］配制.黑曲霉淀粉培养基:牛肉膏3g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉2 g/L，淀粉10 g/L，NaCl 2g/L，琼脂 1.7%，pH=5.5.YPD 培养基:葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L.察氏培养基(CD培养基):蔗糖 20 g/L，硝酸钠 3 g/L，KCl 0.5g/L，MgSO40.5 g/L，K2HPO41 g/L、FeSO4 0.01g/L，琼脂粉 1.5%，pH=5.5.1.3 试剂与仪器HygB购自美国Merck公司;PT、乙酰丁香酮、牛血清白蛋白(BSA)、对硝基苯酚辛酸酯(pNPC)购自Sigma-Aldrich公司;三丁酸甘油酯购自百灵威公司;其它试剂为国产分析纯.主要仪器包括德国Eppendorf公司PCR仪，美国Thermo Scientific SORVALL高速冷冻离心机，美国Bio-RAD公司蛋白、核酸电泳仪，美国Pall公司纯水仪，美国GE公司蛋白质纯化系统AKTATM purifier，瑞士TECAN公司Sunrise多功能酶标仪等.1.4 黑曲霉药物敏感性试验制备100 μg/mL 潮霉素、0.1 μg/mL 吡啶硫胺素的水溶液.参照文献［8］制备含0.01 mol/L乙酰胺的培养基.各取200μL黑曲霉菌种涂布分别加有100μg/mL HygB、0.1μg/mL PT的 CD 固体培养基.取200μL黑曲霉菌种涂布含有0.01mol/L乙酰胺的固体培养基.各取200μL黑曲霉菌种涂布不加上述药物的CD培养基平板，作为对照.30℃培养4天后观察黑曲霉在药物作用下的生长情况.1.5 ATMT法介导的黑曲霉转化体系的建立参照文献［8］报道的转化方法.将在淀粉培养基平板上活化后的黑曲霉单菌落转移至CD液体培养基中34℃培养5天待用.将含有待转化质粒的根癌农杆菌在LC培养基平板(含20 μg/mL利福平和100μg/mL壮观霉素)上活化，挑取较大的单菌落接种于LC液体培养基(含上述药物)，28℃、250r/min培养24 h;取1.5 mL根癌农杆菌培养液离心弃上清，加入5mL IM液体培养基(含5 μL 0.2 mol/L乙酰丁香酮)重悬菌体，28℃、100 r/min避光培养4～5h，待菌体D(600)值为1.0左右时取出待用.将100μL黑曲霉培养物与100 μL根癌农杆菌培养物混合均匀后涂布于含0.2 mmol/L乙酰丁香酮的IM培养基平板上，22.5℃避光培养3天;将培养物转移至含0.2 mol/L头孢噻肟和100 μg/mL潮霉素的MM培养基平板，30℃培养4～6天，待转化子长出后提取基因组DNA进行聚合酶链式反应(PCR)鉴定，所用引物见表1.1.6 根癌农杆菌介导的脂肪酶RML转化黑曲霉1.6.1 脂肪酶表达载体pHGW-RML转化黑曲霉脂肪酶表达载体pHGW-RML转化黑曲霉的方法参见1.5.筛选标记为HygB抗性基因.1.6.2 RML转化子的PCR鉴定和表观酶活检测将在筛选平板上出现的转化子，用灭菌牙签转接至含0.5%(体积分数)三丁酸甘油酯的CD培养基平板上，30℃培养3～5天，观察转化子周围有无水解圈出现.提取转化子的基因组DNA作为模板，对筛选标记基因、RML基因进行PCR扩增，以鉴定RML表达载体是否已整合在黑曲霉基因组上，所用引物见表1.表1 PCR引物序列Table 1 Sequences of PCR primers引物名称引物序列(5'－3')扩增片段长度/bp HygB-forward HygB-reverse解链温度/℃CTTGTTCGGTCGGCATCTAC GTCGCCTAAGGTCACTATCAG 56561166 PT-forward PT-reverse CGATGGAATGGCTAACAGAT TCAAAGACCGTAAGACAAAT 5050 1141 amdS-forward amdS-reverse GGCCCTGAAGGTCGGAT TACTGATGTCTATTGGAAGAAAACT 5555 3430 RML-forward RML-reverse CTGCTTTGGCTGTCCCTATC GGTGACGGCGACCTTGTA 57576441.6.3 RML转化子蛋白的提取及鉴定将在CD培养基(含0.08%琼脂)中培养5～7天的黑曲霉RML转化子菌液经离心浓缩后获得RML转化子种子培养液(D(600)值＞2.0).吸取2mL种子液接种50mL YPD液体培养基，30℃、250r/min振荡培养3天，发酵液用四层擦镜纸过滤除去培养基及菌丝，滤液离心得蛋白粗提液.蛋白粗提液经超滤浓缩并测定浓度后备用.蛋白粗提液的亲和层析纯化参照镍柱产品使用说明及分子克隆方法［14］进行，测定所得RML蛋白样品的浓度，并采用10%分离胶进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测.1.6.4 RML转化子发酵条件的初步优化及脂肪酶酶活测定对转化子表达脂肪酶的发酵优化主要针对3个因素:碳源、温度和pH.碳源选用葡萄糖，用量分别为2%、3%、4%和5%;培养温度分别为30、33和36℃;pH 值选择4.5、5.5 和 6.5.其它培养基成分与 YPD培养基相同，样品于250r/min恒温振荡培养5～8天.自第3天开始取样测定脂肪酶活力，以确定合适的发酵培养条件.脂肪酶活力测定方法:将脂肪酶底物pNPC溶于水中，添加0.5%Triton作乳化剂，经匀浆制备浓度为2.5mmol/L的底物溶液.将500 μL底物溶液、20 μL RML 转化子发酵液和 480 μL 50mmol/L Tris-HCl缓冲液混合，配制1 mL酶活反应体系，于45℃预热后反应10 min，加入20 μL 5%三氯乙酸终止反应.取200μL反应液至96孔板，用酶标仪测定D(405)值.脂肪酶活力单位(U)定义为每分钟水解底物pNPC生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量.2 结果与讨论2.1 黑曲霉筛选标记的确定在含100μg/mL潮霉素的CD培养基平板上，黑曲霉SH-1的生长受到完全抑制，而在不加HygB的平板上黑曲霉生长旺盛(见图1(a)、1(b))，说明黑曲霉对HygB敏感.同样，0.1μg/mL的PT可以抑制黑曲霉在CD平板上的生长，而在不加PT的平板上黑曲霉生长正常(见图1(a)、1(c)).因此HygB、PT的抗性基因可以作为黑曲霉遗传转化的筛选标记.在以乙酰胺为唯一氮源的培养基平板上，黑曲霉SH-1生长十分缓慢(见图1(a)、1(d))，说明黑曲霉利用乙酰胺作为氮源的能力较弱.来源于构巢曲霉的乙酰胺酶能有效分解乙酰胺提供氮源，而序列分析表明黑曲霉的乙酰胺酶基因(amdS)与构巢曲霉amdS基因只有22.31%的同源性，导致黑曲霉利用乙酰胺的能力十分有限，这为黑曲霉的遗传转化提供了一个很好的筛选标记.图1 黑曲霉SH-1对潮霉素B、吡啶硫胺素、乙酰胺的生长敏感性Fig.1 Growth sensitivity of A.niger SH-1 tohygromycin B，pyrithiamine and acetamide 2.2 以HygB抗性基因为筛选标记的黑曲霉遗传转化体系的建立本研究以HygB抗性基因作为筛选标记，利用ATMT法介导表达载体pHGW-PT、pHGW-amdS转化黑曲霉SH-1.在筛选平板上获得4个具有HygB抗性的pHGW-PT转化子(见图2(a))，其在含PT的平板上生长旺盛，而宿主菌基本没有生长(见图2(b))，经PCR扩增在转化子中获得了HygB、PT抗性基因的 PCR产物(见图3(a)、3(b)).pHGW-amdS转化宿主菌得到3个转化子(见图4(a))，其在乙酰胺培养基平板上生长旺盛而野生型宿主菌则生长较差(见图4(b))，经PCR扩增在转化子中得到了HygB抗性基因和amdS基因的PCR产物(见图5(a)、5(b)).以上结果表明，以HygB抗性基因作为筛选标记可以有效地获得转化子，间接证明了PT抗性基因和amdS基因可以作为遗传筛选标记.由此建立了以HygB为筛选标记的黑曲霉遗传转化体系.图2 黑曲霉SH-1的pHGW-PT表达载体转化Fig.2 Transformation of A.niger SH-1 with pHGW-PT expression vector1－4—转化子;5—宿主菌图3 pHGW-PT转化子的PCR鉴定Fig.3 PCR identification of pHGW-PT transformantsM—DNA标准物;1—质粒对照;2－4—转化子;5—宿主菌2.3 黑曲霉RML转化子的鉴定用pHGW-RML表达载体转化黑曲霉后，在含头孢噻肟和潮霉素的筛选平板上出现4个转化子(见图6(a))，将其转移至含三丁酸甘油酯的CD培养基平板，培养5天后转化子菌落周围出现底物水解圈，而宿主菌则没有水解圈(见图6(b))，表明RML基因已在黑曲霉中表达.以所得转化子基因组DNA为模板，经PCR获得了HygB抗性基因、RML基因的PCR产物(见图7(a)、7(b))，将扩增得到的RML基因的PCR产物(644 bp)进行测序，测序结果与RML基因原始序列完全一致，表明所得黑曲霉RML转化子是阳性克隆.由于所用宿主为不产孢子的无孢黑曲霉，有利于根癌农杆菌介导的遗传转化的顺利进行;实验结果证明，转化效率较高.图4 黑曲霉SH-1的pHGW-amdS表达载体转化Fig.4 Transformation ofA.niger SH-1 with pHGW-amdS expression vectorA1、A2、A4—转化子;W—宿主菌图5 pHGW-amdS转化子的PCR鉴定Fig.5 PCR identification of pHGW-amdS transformantsM—DNA标准物;1—质粒对照;2—宿主菌;3—转化子图6 黑曲霉RML转化子的底物水解鉴定Fig.6 Hydrolyzing verification ofA.niger transformants bearing RML gene1－4—RML转化子;5—宿主菌图7 黑曲霉RML转化子的PCR鉴定Fig.7 PCR identification of A.niger RML transformantsM—DNA标准物;1—RML转化子;2—宿主菌;3—质粒对照2.4 RML蛋白的亲和层析及SDS-PAGE鉴定将活化的RML转化子在YPD培养基中培养3天后收集发酵液上清，经超滤浓缩后进行亲和层析，洗脱峰非常明显，说明带有His6组氨酸标签的RML蛋白与镍柱可以牢固结合并有效洗脱，纯化效果较好(见图8(a)).将纯化后的RML蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，在相对分子质量33000处出现了显著的单一目的蛋白条带，与RML蛋白的大小吻合［15］(见图8(b))，因此本研究构建的黑曲霉RML转化子成功表达了重组脂肪酶.图8 重组脂肪酶的亲和层析纯化及SDS-PAGE电泳鉴定Fig.8 Affinity chromatography of recombinant lipase and its verification by SDS-PAGEM—蛋白质标准物;1—宿主菌;2—纯化前蛋白粗提液;3—亲和层析纯化后蛋白样品2.5 黑曲霉RML转化子发酵条件优化丝状真菌的培养温度一般是30℃.本研究选择30、33和36℃ 3个温度梯度进行试验(pH=5.5，葡萄糖用量为2%)，培养时间设定为6天，结果表明30℃培养时黑曲霉发酵液脂肪酶酶活最高(3.3 U/mL)，因此选择30℃作为最适的培养温度.丝状真菌生长pH 值一般选择5.5，本研究选择 4.5、5.5 和 6.5 进行试验(培养温度为30℃，葡萄糖用量为2%)，培养时间设定为6天，结果表明在pH=4.5时，发酵液的脂肪酶酶活最高(6.4 U/mL)，因此选择pH=4.5为最佳pH值.对于碳源(葡萄糖)用量的优化，选择2%、3%、4%和5%4个梯度配制YPD培养基，培养温度和pH按照上述优化后的条件:30℃、pH=4.5.转化子发酵培养至第7天时，葡萄糖用量为5%的发酵液的脂肪酶酶活达到最高(15 U/mL).在培养过程中发现，第4天时葡萄糖用量为2%的发酵液的酶活最高，第5天时葡萄糖用量为3%的发酵液的酶活最高，第6天时葡萄糖用量为4%的发酵液的酶活最高，而在第7天时葡萄糖用量为5%的发酵液的酶活达到最高.推测原因可能是初始葡萄糖浓度过高导致产生“葡萄糖效应”即代谢物阻遏效应，从而影响了基因的表达.因此，在转化子发酵过程中维持培养基中葡萄糖的浓度在一个合适的水平，对于脂肪酶的高效表达十分重要.经优化，用对硝基苯酚比色法测定RML转化子的酶活，其最高可以达到15U/mL，是其在酵母中表达水平(0.3 U/mL［16］、1.4U/mL［17］)的10倍以上.江慧芳等［18］研究表明脂肪酶酶活的测定方法不同会导致测定结果在数值上存在差异，本研究采用的对硝基苯酚比色法测定的脂肪酶酶活在数值上仅为橄榄油－碱滴定法的1%左右.徐苏炜等［19］在毕赤酵母中表达RML基因，用橄榄油－碱滴定法测定的脂肪酶酶活为102U/mL;Brocca等［20］重组表达来源于皱褶假丝酵母的脂肪酶lip1，采用碱滴定法测定的酶活为150 U/mL;将其换算为对硝基苯酚比色法测定的酶活则只有1.02 U/mL和1.50U/mL，远小于本研究获得的重组黑曲霉的脂肪酶酶活，表明黑曲霉重组表达系统是非常有潜力的异源蛋白表达系统.3 结语将植物基因工程的技术应用于丝状真菌，建立了根癌农杆菌介导的黑曲霉转化体系，对提高工业微生物育种效率作了有益的尝试.利用该黑曲霉转化体系表达脂肪酶RML，经PCR鉴定、酶活检测、镍柱亲和层析及SDS-PAGE电泳检测等成功获得了脂肪酶RML的黑曲霉转化子，通过发酵条件优化实现了RML的高效表达，转化子的RML酶活是其在酵母中表达水平的10倍以上，为RML在油脂、食品、生物柴油、医药和日化等诸多领域的应用奠定了基础，也为异源蛋白在黑曲霉中的高效表达提供了研究线索.在此基础上，本研究将利用所获得的脂肪酶开展油脂转化生产生物柴油等工作，为重组脂肪酶的工业应用进行工艺探索.参考文献:［1］ Baker S E.Aspergillus niger genomics:past，present and intothe future 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Biotechnology，2008，83(3):329-335.［17］江逢春，林影，叶燕锐.利用Sed1p锚定蛋白在毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶及其应用［J］.微生物学通报，2010，37(10):1506-1511.Jiang Feng-chun，Lin Ying，Ye Yan-rui.Surface display of Rhizomucor miehei lipase in Pichia pastoris using Sed1p as an anchor protein and its application ［J］.Microbiology China，2010，37(10):1506-1511.［18］江慧芳，王雅琴，刘春国.三种脂肪酶活力测定方法的比较及改进［J］.化学与生物工程，2007，24(8):72-75.Jiang Hui-fang，Wang Ya-qin，Liu parison and improvement of three determination methods for lipase activity［J］.Chemistry ＆ Bioengineering，2007，24(8):72-75. ［19］徐苏炜，林影，韩振林，等.米黑根毛霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达［J］.食品与发酵工业，2008，34(11):10-15.Xu Su-wei，Lin Ying，Han Zhen-lin，et al.High level expression of Rhizomucor miehei lipase gene in Pichia pastoris［J］.Food and Fermentation Industries，2008，34(11):10-15.［20］ Brocca S，Schmidt-Dannert C，Lotti M，et al.Design，total synthesis，and functional overexpression of the Candida rugosa lip1 gene coding for a major industrial lipase［J］.Protein Science，1998，7(6):1415-1422.。

南极假丝酵母脂肪酶a在毕赤酵母中的表达,纯化及酶学性质研究

南极假丝酵母脂肪酶a在毕赤酵母中的表达,纯化及酶学性
质研究
南极假丝酵母脂肪酶a（PSA）是一种重要的酶，它可以分解植物油及动物油，发挥重要的作用。

在过去的几十年里，许多研究者一直在努力研究南极假丝酵母脂肪酶a在毕赤酵母中的表达、纯化和酶学性质。

首先，研究者们构建了一种用于表达南极假丝酵母脂肪酶a的表达载体，并将其植入毕赤酵母株中，以表达目标基因。

研究表明，南极假丝酵母脂肪酶a在毕赤酵母细胞中表达出较高的水平。

其次，研究者们采用钙离子调节和离心纯化等技术，对由毕赤酵母表达的南极假丝酵母脂肪酶a进行了纯化，并经过充分的鉴定确认了其纯度高达74%。

最后，研究者们进行了酶学性质的研究，发现酶最适合反应的pH和温度分别为8和45℃。

此外，该酶对NaCl的最适激活激活浓度为1％，该酶的最大酶学活性为28.8 U/ml。

因此，本研究结果表明，成功地构建了毕赤酵母载体，用于表达南极假丝酵母脂肪酶a，并将其纯化，进行了酶学性质研究，为进一步研究该酶的应用提供了依据。

今后，研究者们将进一步研究该酶的活性机制，以及它在催化过程中的结构变化情况，为进一步探究该酶在生物合成领域中的应用潜力提供可行的路径。

综上所述，本研究成功构建了一种毕赤酵母载体，用于表达南极
假丝酵母脂肪酶a，并将其纯化，进行了酶学性质研究，为进一步研究该酶的应用提供了依据。

未来，研究者们将进一步分析该酶的活性机制，以及它在催化过程中的结构变化，以及它在生物合成领域中的应用前景。

华根霉脂肪酶在黑曲霉中的重组表达研究

华根霉脂肪酶在黑曲霉中的重组表达研究张谦;王剑英;林智;贾佳;郭宏涛【摘要】将华根霉脂肪酶基因RCL在黑曲霉中进行了重组表达。

通过PCR技术分别获得黑曲霉Pgpd启动子和RCL-TtrpC融合片段并克隆至质粒pCHAMBIA230，构建出RCL超表达载体pCHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-TtrpC。

将该载体通过冻融法转化农杆菌EHA105，进而通过农杆菌介导转化法转化黑曲霉，随机挑选7株转化子，进行PCR和Southern杂交鉴定，均为阳性。

对这7株转化子进行发酵和脂肪酶活力测定，结果显示，所有转化子均能表达RCL，其中T6转化子的脂肪酶活力最高，达到71 U/mL。

SDS-PAGE分析表明，重组表达的RCL的分子量约为37 kD。

%This article carried out the recombinant expression ofRhizopus chinensis lipase(RCL)gene inAspergillus niger. Promoter of Pgpd fromA. niger and RCL-TtrpC fusing fragment were respectively obtained by PCR and further cloned to plasmidpCHAMBIA2302 to generate the RCL over-expression vectorpCHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-TtrpC. The resulting vector was introduced intoAgrobacterium tumefaciens EHA105, and then transformed intoA. niger through the mediation ofA. tumefaciens. Seven randomly selected transformants were analyzed by PCR and Southern blot. As a result, all the transformants were found to be positive. Then, the seven transformants were subjected to fermentation and lipase assay, and the results showed that all the transformants secreted recombinant RCL, among which transformant T6 produced the highest lipase specific activity, reaching upto approximately 71 U/mL. The fermentation broth was further analyzed bySDS-PAGE, which revealed the molecular weight of the recombinant RCL was 37 kD.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】6页(P165-170)【关键词】重组表达;华根霉;脂肪酶;黑曲霉;根癌农杆菌【作者】张谦;王剑英;林智;贾佳;郭宏涛【作者单位】深圳技师学院，深圳 518116;深圳市绿微康生物工程有限公司，深圳 518055;深圳市绿微康生物工程有限公司，深圳 518055;深圳市绿微康生物工程有限公司，深圳 518055;深圳市绿微康生物工程有限公司，深圳 518055【正文语种】中文华根霉脂肪酶（Rhizopus chinensis lipase，RCL）是丝状真菌华根霉（R. chinensis）产生的脂肪酶，其全长ORF由389个氨基酸残基构成，包含26个氨基酸的信号肽，94个氨基酸的前导肽和269个氨基酸的成熟肽［1］。

黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母GS-115系统中的表达

黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母GS-115系统
中的表达
黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母GS-115系统中的表达
将黑曲霉(Aspergillus niger)NRRL3135中的植酸酶基因转入毕赤酵母GS-115中,并整合到染色体DNA上,然后进行诱导表达.通过SDS-PAGE对表达产物进行鉴定,发现重组毕赤酵母GS-115分泌了1个约100 kD的蛋白,分泌的蛋白较大.用脱糖基化酶endoglycosidase H降解后,形成了约50 kD的蛋白,与植酸酶基因产物的理论值相符.通过对表达产物的酶学性质研究,发现该表达产物在pH 2.5和pH5.5时具有较高植酸酶活性,同时该表达产物的最适温度约为55℃.这说明植酸酶得到正确的分泌表达.
作者：康伟王智詹冬玲雷霆冯雁 KANG Wei WANG Zhi ZHAN Dong-ling LEI Ting FENG Yan 作者单位：吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室,长春,130023 刊名：吉林农业大学学报ISTIC PKU 英文刊名：JOURNAL OF JILIN AGRICULTURAL UNIVERSITY 年，卷(期)：2006 28(6) 分类号：Q786 关键词：植酸酶毕赤酵母GS-115 黑曲霉。

毕赤酵母分泌表达华根霉脂肪酶(r27RCLC)的糖基化鉴定

毕赤酵母分泌表达华根霉脂肪酶(r27RCLC)的糖基化鉴定杨敏;喻晓蔚;吴厚军;徐岩【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2014(033)010【摘要】研究了毕赤酵母GS115中能够高效分泌表达的华根霉脂肪酶(r27RCLC)的糖基化情况.运用糖基化抑制剂衣霉素处理表达目的蛋白的毕赤酵母细胞,通过SDS-PAGE比较分析经衣霉素处理后的脂肪酶r27RCLC分泌表达量的变化,结果显示酶的分泌表达受到很大的抑制,说明脂肪酶r27RCLC在表达时候很可能发生了糖基化,且糖基化对其有重要影响.通过生物化学方法,利用内切糖苷酶PNGaseF和Endow酶切处理脂肪酶r27RCLC,SDS-PAGE和Western Blot,结果显示r27RCLC未发生糖基化.将样品r27RCLC通过胰蛋白酶酶解等步骤处理,进行MADLI-TOF-MS质谱分析,结果发现MADLI-TOF-MS鉴定结果与内切糖苷酶酶切处理结果一致,进一步证明毕赤酵母分泌表达的华根霉脂肪酶r27RCLC未发生糖基化.【总页数】7页(P1018-1024)【作者】杨敏;喻晓蔚;吴厚军;徐岩【作者单位】江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122【正文语种】中文【中图分类】Q814【相关文献】1.优化密码子及诱导温度提高雪白根霉脂肪酶在毕赤酵母中的表达 [J], 王建荣;刘丹妮;夏雨;杨玲;刘金山;唐业;陈丽芝;黄佳乐;李阳源2.NH4+离子对重组毕赤酵母产华根霉脂肪酶发酵过程的影响 [J], 赵林水;喻晓蔚;徐岩3.少根根霉(Rhizopus arrhizus)脂肪酶基因在毕赤酵母中的分泌表达 [J], 牛卫宁;谭天伟4.重组毕赤酵母产华根霉脂肪酶的陶瓷膜微滤除菌工艺研究 [J], 谢甲有;喻晓蔚;徐岩5.重组毕赤酵母表达华根霉脂肪酶发酵液的絮凝除菌条件研究 [J], 李飞;喻晓蔚;徐岩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。