第二十章 重组DNA技术(教学)
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高中生物重组技术实验教案
高中生物重组技术实验教案
实验名称：重组技术实验
实验目的：通过实验，让学生了解重组技术的基本原理和应用，培养学生的实验操作能力和科学思维能力。
实验材料：DNA分子模型、重组酶、DNA片段、载体DNA、PCR仪器、琼脂糖凝胶等。
实验步骤：
1. 首先，讲解重组技术的基本原理和应用，并展示实验所需材料。
2. 学生分组进行实验，每组配备一个老师指导。
3. 将载体DNA和DNA片段分别用重组酶切割成合适的长度，然后将它们混合并利用PCR 技术将其连接起来。
4. 将连接好的DNA转化至细菌宿主中，培养并筛选出带有目标基因的细菌。
5. 最后，将细菌中的目标基因进行提取并通过琼脂糖凝胶电泳进行验证。
实验评估：学生根据实验结果进行分析和讨论，并撰写实验报告，总结实验过程中的操作技能和体会。
拓展延伸：可以邀请专业人士来讲解重组技术在医学、农业等领域的应用，并参观相关实验室，进一步拓展学生的实验技能和知识面。
注意事项：1. 实验中需要小心操作化学药品和实验器材，注意安全防护措施。
2. 实验结束后要及时清理实验台和器材，保持实验现场的整洁。
3. 学生要尊重实验材料和动植物，严禁损坏或滥用。
DNA重组及重组DNA技术
特点
分子水平操作和细胞水平表达 定向地改造生物的遗传性状， 获得人类所需要的品种
克隆(clone) 是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。
重组DNA技术的目的 ① 克隆特定基因 ②序
重组DNA技术操作流程图
ACC ACC ACC ACC
AAG AAA AAG AAA
TAC TAC TAC TAC
TTT TTT T TC T TC
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
说明：由于密码存在简并性，合成出来的DNA可能与基因组DNA有所差异，此 问题可通过基因测序解决。如果是为了获得表达产物蛋白质，这种差异也 无所谓。
载体 目的基因
双酶切产生粘性末端
带有与载体 相同粘性末端
重组DNA分子
转化或转染
含重组载 体的细菌
对细菌进 行培养
操作过程可形象归纳为
分 ─ 目的DNA的分离获取 选 ─ 载体的选择与构建 接 ─ 目的DNA与载体的连接 转 ─ 重组DNA转入受体细胞 筛 ─ 重组体的筛选与鉴定
对克隆菌进行筛选、 鉴定和扩增
第二十一章 DNA重组及重组DNA技术
重组DNA技术(recombinant DNA technology)：
又称分子克隆或DNA克隆或基因工程技术，其主要过程包括：在体外 将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件（又称载体）连接，形成重组 DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大 量拷贝。在克隆目的基因后，还可针对该基因进行表达产物蛋白质或多肽 的制备以及基因结构的定向改造。
说明：这种cDNA中不包含内含子， 便于在宿主细胞中表达,适用 于真核生物基因。
S1核酸酶
AAAAAAAA(n) 3 TT T T T TT T (n) 5
重组DNA技术ppt课件
限制性核酸内切酶
切割DNA分子实 质是断开两个核 苷酸之间的磷酸 二酯键。
磷酸二酯键
DNA分子
限制酶的识别序列：
分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修
饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
mRNA 反转录酶
cDNA 复制
双链cDNA 载体
重组DNA分子 受体菌cDNAAAAA逆转录酶AAAA TTTT
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶
目录
（二）克隆载体的选择和构建 （三）外源基因与载体的连接
目的基因
限制性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
T4 DNA连接酶 15ºC
载体自连
目的基因 自连
多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
作为基因工程运载体的条件
①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 ②具多种限制酶切点，以便与外源基因连接。 ③具有某些标记基因，便于进行筛选。 ④载体是安全的，不能对受体细胞有害。 ⑤载体DNA分子大小应合适，以便提取和在体外进行 操作。。
常用的载体：质粒
有标记基因的 存在，可用含 氨苄青霉素的 培养基鉴别
4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)
组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶
基因片断 克隆载体
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
* 从基因组DN带的所 有基因组DNA核苷酸序列不久即将完成。 但要揭示人类4万个基因功能的任务将更为艰巨。
人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因 的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人 类疾病相关基因提供了参照模板。
DNA重组技术(Recombinant DNA)实验原理、用品和步骤
DNA重组技术(Recombinant DNA)实验原理、用品和步骤【实验原理】1．DNA重组技术重组DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。
它包括以下几个步骤：1）重组DNA分子的构建：即将目的基因（DNA或cDNA片段）与载体DNA重组，应用TA 克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。
该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下，目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。
2）将重组DNA分子转化宿主细胞。
3）克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA（TA克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。
挑取菌落，置液体培养基中培养，得到大量含重组DNA的细菌。
4）收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子（质粒），并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。
2．质粒DNA的小量制备常见的质粒DNA提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。
本实验采用的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在PH 12.0~12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒（CC）DNA仍为自然状态。
将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。
大部分染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。
通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒DNA。
3．质粒DNA的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析限制酶存在于原核生物体内，根据其结构和功能特性分为：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。
DNA重组技术PPT课件
18
史密斯在研究流感嗜血杆菌从噬菌体 P22接受DNA的机制时，于1968年发现了一 类新的限制酶，它们分别在特定部位切断 DNA分子，因此可用以研究DNA分子中核 苷酸的顺序和用于DNA重组技术。
16.07.2020
19
基因载体（简称载体）
主要是质粒和温和噬菌体（见转导）两类。
➢ 1952年，英国微生物遗传学家W．海斯和美国微生物遗传学家 J．莱德伯格等在首先认识到大肠杆菌的F因子是染色体外的遗 传因子。
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基因工程
12
DNA重组技术发展简史
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13
重组DNA技术来源于两个方面的基础理论研究 • 限制性核酸内切酶（简称限制酶） • 基因载体（简称载体）。
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限制性核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的应用
阿尔伯 Wemer Arber 瑞士生物学家 巴塞尔Biozentrum大学
DNA重组技术
徐纪茹
2011-03-01
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1
概述
1
点击输入简要文字内容，文字内容需概括精炼，不用多余 的文字修饰，言简意赅的说明分项内容……
2
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3
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5
转化
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接合
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转 导
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8
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融源性转换
DNA重组及重组DNA技术
77
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目录
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶 工程、细胞工程等
基因工程(genetic engineering) —— 实现基因 克隆所用的方法及相关的工作称基因工程， 又称重组DNA工艺学。
目的： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
77
重组体DNA，分别为：
片段重组体(patch recombinant)
拼接重组体(splice recombinant)
77
7
目录
片段重组体 （见模型图左边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲 本DNA。
拼接重组体（见模型图右边产物）： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双 链区的两侧来自不同亲本DNA。
RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其 周围切割双链DNA的一类内切酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
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22
目录
分类：酶的组成、所需因子及裂解DNA的方 式 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）
作用：
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源DNA，保护自身DNA。
77
23
目录
命名：
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属系 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
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24
目录
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
《重组DNA技术简介》课件
载体的构建
选择合适的载体，如质粒或病毒载体，对其进行 限制性内切酶切割、连接和转化等操作，构建成 重组载体。
克隆的表达与分析
对阳性克隆进行培养和诱导表达，收集表达产物 并进行相关分析，如蛋白质纯化、Western blot 等。
03
重组DNA技术的实验操作
基因的克隆与鉴定
基因克隆
将目的基因从原始生物体中提取出来，经过剪切、拼接等操作后 ，将其插入到载体DNA中，形成重组DNA的过程。
04
重组DNA技术的安全性与伦理问题
重组DNA技术的安全性评估
重组DNA技术的安全性
重组DNA技术是一种在分子水平上对DNA进行操作的技术，通过该技术可以实现对生物 遗传信息的精确控制。经过多年的研究和应用，重组DNA技术已经得到了广泛的应用和 认可，被认为是一种相对安全的技术。
安全评估的必要性
各国政府也制定了一些关于重组DNA 技术的法规和政策，例如美国的《人 间重组DNA研究指南》和中国的《人 间遗传资源管理暂行办法》等。这些 法规和政策对技术的研发和应用进行 了规范和管理，以确保技术的安全和 可控性。
重组DNA技术的社会影响与争议
社会影响
争议与挑战
重组DNA技术作为一种先进的生物技 术，对社会产生了深远的影响。该技 术的应用不仅推动了生物医学领域的 发展，也促进了农业、工业等领域的 技术革新。同时，该技术的应用也引 发了一些社会问题和争议。
基因表达的调控对于生物体的生长发 育和环境适应性至关重要。基因表达 受到多种因素的影响，包括DNA的甲 基化、染色质结构的改变、蛋白质因 子的作用等。
重组DNA技术的操作流程
目的基因的获取
通过限制性内切酶将DNA切割成片段，再通过 凝胶电泳和回收试剂盒分离得到目的基因。
《重组DNA技术》课件
发展更精准、高效的基因编辑 技术。
合成生物学
通过合成DNA来构建新的生物 系统。
个性化医疗
根据个体基因信息制定个性化 治疗方案。
1 优势
能够精确操纵DNA序列，有很大的应用潜力。
2 挑战
涉及伦理和法律问题，需要审Fra bibliotek使用和监管。重组DNA技术的伦理和法律问题
1 隐私与安全
个人基因信息的保护和使 用。
2 知识产权
重组DNA技术的专利保护 和共享。
3 道德问题
生命伦理和人类基因改造 的道德考量。
重组DNA技术的未来发展趋势
基因组编辑
重组DNA技术的原理和步骤
1
1. DNA剪切
使用限制性内切酶切割DNA分子，产生特定的DNA片段。
2
2. DNA连接
将不同来源的DNA片段连接起来，形成重组DNA。
3
3. DNA修饰
可以进行DNA序列的修饰，例如插入或删除特定DNA序列。
常见的重组DNA技术方法
PC R
聚合酶链反应，用于扩增 DNA序列。
《重组DNA技术》PPT课 件
DNA重组技术是通过将不同来源的DNA分子进行切割、连接和修饰的一项技 术。它在现代生物技术和分子生物学领域有着广泛的应用。
DNA重组技术的定义
1 基因重组
通过DNA重组技术，可以将不同的基因组合到一起，产生新的基因组。
2 DNA重组
DNA重组技术包括以特定方式剪切、连接和修饰DNA分子，以改变其序列和功能。
蛋白质表达系统
利用重组DNA技术制备大量 特定蛋白质。
基因编辑技术
例如CRISPR-Cas9，用于精 确编辑DNA序列。
重组DNA技术的应用领域
合成生物学
通过合成DNA来构建新的生物 系统。
个性化医疗
根据个体基因信息制定个性化 治疗方案。
1 优势
能够精确操纵DNA序列，有很大的应用潜力。
2 挑战
涉及伦理和法律问题，需要审Fra bibliotek使用和监管。重组DNA技术的伦理和法律问题
1 隐私与安全
个人基因信息的保护和使 用。
2 知识产权
重组DNA技术的专利保护 和共享。
3 道德问题
生命伦理和人类基因改造 的道德考量。
重组DNA技术的未来发展趋势
基因组编辑
重组DNA技术的原理和步骤
1
1. DNA剪切
使用限制性内切酶切割DNA分子，产生特定的DNA片段。
2
2. DNA连接
将不同来源的DNA片段连接起来，形成重组DNA。
3
3. DNA修饰
可以进行DNA序列的修饰，例如插入或删除特定DNA序列。
常见的重组DNA技术方法
PC R
聚合酶链反应，用于扩增 DNA序列。
《重组DNA技术》PPT课 件
DNA重组技术是通过将不同来源的DNA分子进行切割、连接和修饰的一项技 术。它在现代生物技术和分子生物学领域有着广泛的应用。
DNA重组技术的定义
1 基因重组
通过DNA重组技术，可以将不同的基因组合到一起，产生新的基因组。
2 DNA重组
DNA重组技术包括以特定方式剪切、连接和修饰DNA分子，以改变其序列和功能。
蛋白质表达系统
利用重组DNA技术制备大量 特定蛋白质。
基因编辑技术
例如CRISPR-Cas9，用于精 确编辑DNA序列。
重组DNA技术的应用领域
第20章重组DNA技术
具有53聚合酶， 35核酸外切酶活性。
2019年11月1日7时21分
25
（三）Taq DNA聚合酶
是第一个被发现的、耐热的、依赖DNA的DNA聚 合酶， 最佳反应温度为70~75℃。
具有53聚合酶，53 核酸外切酶活性， 对Mg2+浓度非常敏感。
（四）反转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶。
dNTP nppi
OH 5′ 3′
用途：
Co2+ dNTP nppi 5′
(A/G/C/T)n 3′
（1）主要作用是在载体或目的基因 3’末端加上 同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNA重组。
（2）DNA 3’末端的同位素标记。
2019年11月1日7时21分
28
（二）碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase） 能特异地切除DNA、RNA和dNTP上5’-磷酸基团。
10
（二）限制酶的分类：
Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型（基因工程技术中常用Ⅱ型）。
Ⅰ和Ⅲ型限制酶通常是相对分子量较大的多亚 基蛋白质复合物，同时具有内切酶和甲基化酶活性， 反应过程中需有Mg2+和ATP参与。
Ⅱ型限制酶通常以同源二聚体形式存在，只具 有核酸内切酶活性而无甲基化酶活性，反应过程中 只需有Mg2+参与而不需有ATP参与。
如： Bbl Ⅰ CGGN(N)4CCG; GCC(N)4NGGC
2019年11月1日7时21分
17
（四）限制酶的应用及影响因素
1.限制酶的应用 重组DNA技术、基因组DNA物理图谱绘制、基因组
DNA同源性研究、切割基因组DNA纯度、结构及甲基度程度；酶切反应的温度、
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ
2019年11月1日7时21分
25
（三）Taq DNA聚合酶
是第一个被发现的、耐热的、依赖DNA的DNA聚 合酶， 最佳反应温度为70~75℃。
具有53聚合酶，53 核酸外切酶活性， 对Mg2+浓度非常敏感。
（四）反转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶。
dNTP nppi
OH 5′ 3′
用途：
Co2+ dNTP nppi 5′
(A/G/C/T)n 3′
（1）主要作用是在载体或目的基因 3’末端加上 同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNA重组。
（2）DNA 3’末端的同位素标记。
2019年11月1日7时21分
28
（二）碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase） 能特异地切除DNA、RNA和dNTP上5’-磷酸基团。
10
（二）限制酶的分类：
Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型（基因工程技术中常用Ⅱ型）。
Ⅰ和Ⅲ型限制酶通常是相对分子量较大的多亚 基蛋白质复合物，同时具有内切酶和甲基化酶活性， 反应过程中需有Mg2+和ATP参与。
Ⅱ型限制酶通常以同源二聚体形式存在，只具 有核酸内切酶活性而无甲基化酶活性，反应过程中 只需有Mg2+参与而不需有ATP参与。
如： Bbl Ⅰ CGGN(N)4CCG; GCC(N)4NGGC
2019年11月1日7时21分
17
（四）限制酶的应用及影响因素
1.限制酶的应用 重组DNA技术、基因组DNA物理图谱绘制、基因组
DNA同源性研究、切割基因组DNA纯度、结构及甲基度程度；酶切反应的温度、
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ
重组DNA技术培训课件
重要的工具酶
工具酶 限制性核酸内切酶
T4 DNA连接酶
DNA聚合酶 逆转录酶
碱性磷酸酶 T4多聚核苷酸激酶
末端脱氧核苷酸转移酶
活性 识别特异碱基序列，切割DNA 催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基 形成磷酸二酯键 以DNA为模板合成DNA 以RNA为模板合成cDNA 切除5－末端磷酸 催化核酸5'-羟基磷酸化 催化3'-端合成同聚尾
基因工程(genetic engineering)
是将不同来源的DNA片段与载体分子连接形成重组DNA分 子，再导入宿主细胞内进行表达，也称重组DNA技术。
本章主要内容
重要的工具酶 基因克隆常用的载体 重组DNA基本原理 重组技术在医学和制药
工业中的应用
第一节 重要的工具酶
工具酶 基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和 RNA 分 子 的切割、连接 、 聚合、逆转录等 相 关的各种酶类。
Streptomyces albus Subspecies pathocidicus 白色链球菌
酶名称 BamHⅠ
Bgl Ⅱ EcoRⅠ Hind Ⅲ
PstⅠ SalⅠ
识别顺序 GGATCC
ACATCT
同裂酶 BstⅠ
同尾酶
Bgl Ⅱ MboⅠ
GAATTC
AAGCTT HsuⅠ
CTGCAG SalpⅠ
变性
5'
3'
+
标记探针
3'
5'
㈢ Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶）
作用特点 1） Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度范围
70 75℃， 2） 95℃以上高温，半小时不失活， 3） 最适合用于聚合酶链反应（PCR）扩增DNA片
重组DNA技术1概述
类型： cDNA(complementary DNA)：指经 反转录合成的、与RNA互补的单链DNA， 经聚合可合成双链cDNA。 基因组DNA(genetic DNA)：指代表 一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及 线粒体)的所有DNA序列。
重组DNA技术1概述
•大容量载体 • 柯斯质粒载体 • 酵母人工染色体载 体
重组DNA技术1概述
•增强子
•转录起始点 •外 •外 •显 •显
•TATA框 •子1 •子2
•转录终止点
•外
•显 •子3
•AATAAA
•5’ •CAAT框
•内 •内 •含 •含
•3’
•子1 •子2
•真核细胞基因结构示意图
•增强子：在5’端转录起始点上游约100个核苷酸以远处的位置， 能使转录活性增强上百倍。
• 以E.coli的同源重组为例，了解同源 重组机制的Holliday模型。
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
•受 体
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
•四、转座重组
• 由插入序列和转座子介导的基因移 位或重排称为转座（transposition）。
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
•
第二节
•
• 重组DNA技术
• DNA Recombination Technique
重组DNA技术1概述
•大容量载体 • 柯斯质粒载体 • 酵母人工染色体载 体
重组DNA技术1概述
•增强子
•转录起始点 •外 •外 •显 •显
•TATA框 •子1 •子2
•转录终止点
•外
•显 •子3
•AATAAA
•5’ •CAAT框
•内 •内 •含 •含
•3’
•子1 •子2
•真核细胞基因结构示意图
•增强子：在5’端转录起始点上游约100个核苷酸以远处的位置， 能使转录活性增强上百倍。
• 以E.coli的同源重组为例，了解同源 重组机制的Holliday模型。
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
•受 体
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
•四、转座重组
• 由插入序列和转座子介导的基因移 位或重排称为转座（transposition）。
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
重组DNA技术1概述
•
第二节
•
• 重组DNA技术
• DNA Recombination Technique
培训课件：DNA重组技术共31页文档
培训课件：DNA重组技术
41、实际上，我们想要的不是针对犯 罪的法 律，而 是针对 疯狂的 法律。 ——马 克·吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就 像影子 跟随着 身体一 样。— —贝卡 利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进 步。— —杰弗 逊 44、人类受制于法律，法律受制于情 理。— —托·富 勒
45，而不 是为了 束缚他 的才能 。—— 罗伯斯 庇尔
66、节制使快乐增加并使享受加强。 ——德 谟克利 特 67、今天应做的事没有做，明天再早也 是耽误 了。——裴斯 泰洛齐 68、决定一个人的一生，以及整个命运 的，只 是一瞬 之间。 ——歌 德 69、懒人无法享受休息之乐。——拉布 克 70、浪费时间是一桩大罪过。——卢梭
41、实际上，我们想要的不是针对犯 罪的法 律，而 是针对 疯狂的 法律。 ——马 克·吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就 像影子 跟随着 身体一 样。— —贝卡 利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进 步。— —杰弗 逊 44、人类受制于法律，法律受制于情 理。— —托·富 勒
45，而不 是为了 束缚他 的才能 。—— 罗伯斯 庇尔
66、节制使快乐增加并使享受加强。 ——德 谟克利 特 67、今天应做的事没有做，明天再早也 是耽误 了。——裴斯 泰洛齐 68、决定一个人的一生，以及整个命运 的，只 是一瞬 之间。 ——歌 德 69、懒人无法享受休息之乐。——拉布 克 70、浪费时间是一桩大罪过。——卢梭
重组DNA技术讲解培训课件
重组DNA技术讲解
15
（一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的 磷酸基团
来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase，BAP） 或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。用于 脱去DNA（RNA）5′末端的磷酸基团，使5′ -P成为5′ -OH，该 过程称核酸分子的脱磷酸作用。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录和翻译
PCR是一种高效快速的体外DNA聚合程序
重组DNA技术讲解
31
五、通过特异杂交系统获取某些转录因子的编码DNA
A. 无转录因子：报告基因不表达
报告基因
酵
“诱饵”DNA序列
母 B. 有转录因子：报告基因表达 .
单
转录因子
杂
交
系
报告基因
统 C. 有转录因子 AD/DNA结合蛋白－融合蛋白：报告基因表达
另外，Taq DNA聚合酶具有末端转移酶作用， 能在所合成DNA链的3′末端加上一个单独的腺苷酸 残基（A）。
重组DNA技术讲解
21
（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5´ 羟基末端磷酸化
常 用 的 是 T4 多 核 苷 酸 激 酶 （ T4 polynucleotide kinase），该酶含5′多核苷酸激酶 和3′磷酸酶活性，能催化ATP的γ-位磷酸向DNA 和RNA的5′-羟基转移。
转化细胞内 由克隆载体 所携带的所 有 cDNA 片 段的集合29从基因组DNA或cDNA中筛选 目的DNA的策略
（亲和筛选法）筛选
重组DNA技术讲解
30
四、经PCR获取目的DNA
如果已经知道目的基因的序列，就能很 方便地用PCR反应，从基因组DNA或cDNA中 获得目的基因，可不必要经过复杂的DNA文 库构建过程。
15
（一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的 磷酸基团
来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase，BAP） 或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。用于 脱去DNA（RNA）5′末端的磷酸基团，使5′ -P成为5′ -OH，该 过程称核酸分子的脱磷酸作用。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录和翻译
PCR是一种高效快速的体外DNA聚合程序
重组DNA技术讲解
31
五、通过特异杂交系统获取某些转录因子的编码DNA
A. 无转录因子：报告基因不表达
报告基因
酵
“诱饵”DNA序列
母 B. 有转录因子：报告基因表达 .
单
转录因子
杂
交
系
报告基因
统 C. 有转录因子 AD/DNA结合蛋白－融合蛋白：报告基因表达
另外，Taq DNA聚合酶具有末端转移酶作用， 能在所合成DNA链的3′末端加上一个单独的腺苷酸 残基（A）。
重组DNA技术讲解
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（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5´ 羟基末端磷酸化
常 用 的 是 T4 多 核 苷 酸 激 酶 （ T4 polynucleotide kinase），该酶含5′多核苷酸激酶 和3′磷酸酶活性，能催化ATP的γ-位磷酸向DNA 和RNA的5′-羟基转移。
转化细胞内 由克隆载体 所携带的所 有 cDNA 片 段的集合29从基因组DNA或cDNA中筛选 目的DNA的策略
（亲和筛选法）筛选
重组DNA技术讲解
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四、经PCR获取目的DNA
如果已经知道目的基因的序列，就能很 方便地用PCR反应，从基因组DNA或cDNA中 获得目的基因，可不必要经过复杂的DNA文 库构建过程。
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子的3´-OH加上互补的同聚物尾巴，形成人
工黏性末端
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2.多核苷酸激酶：
在重组DNA技术中，多核苷酸激酶
可用于标记DNA的5´末端，也可使缺失 5´-P末端的DNA发生磷酸化作用。
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3.碱性磷酸酶：
能特异地切除DNA、RNA和dNTP上5´ 磷酸基团。在重组DNA技术中，用碱性磷酸 酶去除载体分子或DNA片段的5´-P，以防止 发生自身连接。
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第三节 重组DNA技术中常用载体
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一、质粒载体
质粒 (plasmid)
特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗 传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
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（一）pBR322质粒载体（克隆6kb）
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（二） pUC19 质粒载体
LacZ´基因与β-半乳糖苷酶 X-gal，5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 MCS区段：来自M13噬菌体
酸内切酶，又称为限制酶。
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（一）限制性核酸内切酶的命名
Hin dⅢ 属 种 Haemophilus influenzae Rd株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表菌株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
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（二）限制性核酸内切酶的类型
Ⅰ型限制性核酸内切酶
Ⅱ型限制性核酸内切酶（应用广泛）
Ⅲ型限制性核酸内切酶
作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统， 限制外源DNA， 保护自身DNA
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（三）Ⅱ型限制性核酸内切酶
特点：
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三、DNA聚合酶
能够把脱氧核糖核苷酸连续地添加到双链 DNA分子引物链的3´-OH末端，催化核苷酸 的聚合作用 类型： 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段 Taq DNA聚合酶 逆转录酶
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四、其它修饰酶
1.末端脱氧核苷酸转移酶： 主要作用是在外源DNA片段及载体分
EcoRⅤ
5′
5′ 3′ 3′ 5′
***********GAT —OH ***********CTA — P
P — ATC************* OH— TAG*************
3′
5′
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同裂酶（isoschizomer） 又称异源同工酶，
同尾酶（isocaudamer） 识别序列与切割位 可变酶 此类酶是Ⅱ型限制酶的特例，识别
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（1）产生5 突出粘性末端 (sticky end) 5′ 3′ 3′
EcoR I
**********GAATTC******** **********CTTAAG********
5′ 5′
P
5′
3′
*********G —OH *********C T T A A — P
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基本概念
基因工程(genetic engineering) —— 实现基因
克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，
又称重组DNA工艺学。 目的： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
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要，已发展出用动物病毒改造的病毒载体。
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目前常用的病毒载体有整合型和游离型两类
逆转录病毒载体 （整合型）
腺病毒载体 （游离型）
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病毒载体的改造
目标基因
包装细胞
带目标基因假病毒
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三、人工染色体载体
5
自然界DNA重组和基因转移是经常发生的
一、同源重组是最基本的DNA重组方式 二、细菌的基因转移与重组
接合作用
转化作用
三、病毒的作用
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重组DNA技术的发展简史
1960－1970年重组DNA工具的研究90（载体、酶）。
1972年，Berg 等第一次完成DNA体外重组实验。
3.接
4.转
5.筛
6.表达
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第二节 重组DNA技术中常用工具酶
工 具 酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ 功 识别特异序列，切割DNA 催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键， 使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 ①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、 35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合 成，双链DNA 3末端标记等 能
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限制性内切核酸酶
名 称 识别序列及切割位点 名 称 识别序列及切割点 5’…PuGCGC▼Py...3’ 5’…GGTAC▼C...3’ 5’…CTGCA▼G...3’
切割后产生５’突出末端: BamHⅠ Bgl Ⅱ 5’…G▼GATCC...3’ 5’…A▼GATCT...3’
与质粒载体相比，其突出优点是可插入较
大外源DNA片段
噬菌体的感染效率远高于质粒载体的转化 效率
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三、病毒载体
质粒载体、噬菌体载体都是以原核细 胞（如大肠杆菌）作为宿主细胞。近年来 为适应真核细胞重组DNA技术的需要，特 别是为实现真核基因表达或基因治疗的需
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作为基因工程载体所需具备的基本条件
能自主复制
有多个单一酶切位点，称为多克隆位点（MCS）， 利于外源DNA分子插入
具有两个以上的选择性遗传标记，便于重组体的筛 选和鉴定 分子量小，以容纳较大的外源DNA 拷贝数高 具有较高的遗传稳定性
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Hae Ⅱ Kpn Ⅰ Pst Ⅰ
EcoR Ⅰ
Hind Ⅲ Hpa Ⅱ Mbo Ⅰ Nde Ⅰ
Apa Ⅰ
5’…G▼AATTC...3’
5’…A▼AGCTT...3’ 5’…C▼CGG...3’ 5’…▼GATC...3’ 5’…GA▼TATG...3’ 5’…GGGCC▼C...3’
Sph Ⅰ
Alu Ⅰ EcoR Ⅴ
第二十章
重组DNA技术
recombinant DNA technique
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1
基本概念
DNA克隆
克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷 贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
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2
基本概念
Ⅱ型限制酶识别双链DNA中4～8个核苷
酸组成的特定序列，从其识别序列内切割
DNA分子中的磷酸二酯键，产生含5´-P和3´OH的产生粘性末端或平末端。 功能： 根据需要在特定的位点精确切割双链 DNA分子。
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识别序列特点： 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
定义
为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达
有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
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克隆载体(cloning vector)
为使插入的外源DNA序列被扩增而特意
设计的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
催化两条双链DNA分子的互补粘性 末端或平末端的5 磷酸基团与3 羟基形 成磷酸二酯键
功能： 将两条双链DNA片段连接起来，实 现DNA的体外重组
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常用的DNA连接酶
1.大肠杆菌DNA连接酶 2.T4 DNA连接酶
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Pst I
5′
3′ 5′
P — G*********** OH— A C G T C***********
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（3）产生平末端 (blunt end)
5′ 3′ 5′ 3′ 3′
*************GATATC************* *************CTATAG*************
Klenow片段
反转录酶
多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析