基因工程实验报告的实验步骤

实验一：大肠杆菌5α和21感受态细胞的制备
【实验步骤】
1 从平板上挑取新活化的大肠杆菌5α单菌落，接种到5 培养基中，37℃振荡培养过夜。

2 取1培养物接种到100 培养基（250三角瓶）中，37℃振荡培养2~3h。

3 将菌液转移到50离心管（2管）中，冰上放置15。

4 4℃4000 离心5，弃去上清液，倒置使培养液流尽。

5 用20 冷2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4℃4000 离心5，弃去上清液。

6 用10 冷2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30。

7 4℃4000 离心5，弃去上清液，用2 的冷2溶液悬浮。

8 分装到数个管中，每管200 ，冷冻保存备用。

实验二：目的基因质粒（或218）
和表达载体质粒（32或30）的转化及大量提取
【实验步骤】
一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）
1、取200 新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒 2 （32a，18），混匀，冰上放置30。

2、将管放到42℃保温90s，冰浴 2。

3、加入800 液体培养基，37℃慢摇复苏1 h。

4、将100 的复苏细胞涂布在含有（100）的培养皿中，正置平皿30（使菌液被培养基吸收）。

5、倒置平皿37℃培养16 h，出现菌落。

二、质粒的提取
1 挑取单菌落接种于100 加入50 的液体培养基中，振荡培养过夜。

2 过夜培养的菌液加入1.5 的小指管（20个每组）中，每次1 ，4℃，12000 ，离心1，4次，弃上清。

3 加入150溶液Ⅰ悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10。

4 加入350溶液Ⅱ（新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5。

（不能再剧烈震荡）
5 加入300溶液Ⅲ（冰上预冷），颠倒混匀20次，不能剧烈震荡，冰浴10。

6 4℃，12000 ，离心10 ，取上清转移至另一离心管中。

7 向上清中加入0.6倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置20 。

8 4℃，12000 ，离心10 ，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。

9 用1 70%乙醇洗涤质粒沉淀2次，每次4℃，12000 ，离心3，吸去上清。

10 55℃烘干至无酒精，加入20 ，所有集成一管后加入 1~2，37℃消化1~2h，-20℃保存。

11 电泳分析。

制胶：0.14g琼脂糖，20 1×缓冲液，溶解后倒入制胶板，放入梳子，冷却凝固待用。

点样：6质粒+1上样缓冲液。

电压：180V，电泳至蓝色带距离点样孔3。

实验三目的基因质粒和表达载体质粒的酶切及其产物的分离纯化
【实验步骤】
1 酶切
酶切体系
试剂小量酶切大量酶切
灭菌水 5 —
质粒10 88
Ⅰ0.5 1
Ⅲ0.5 1
10× 4 10
终体积20 100
按以上酶切体系加入0.5 管中，37℃放置3h，电泳回收片段。

（点样：酶切体系100上样缓冲液20。

）
2 酶切产物的回收
1)将单一的目的条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分放入干净的离心管中，称取
重量。

2)向胶块中加入3倍体积溶胶液（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100，则加入300溶
胶液），50-55℃水浴放置10，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

注意：溶胶时，如果溶胶液变为红色（正常情况下为淡黄色），可向含有的胶溶液中加10-30 3N醋酸钠（5.2）将溶液调为淡黄色，否则将会影响与吸附柱的结合，影响回收效果。

3)将上一步所得的溶液加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），13，000 离心30-60s，
倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合的能力较弱。

4)向吸附柱中加入700漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），13，000 离心
30-60s，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

5)向吸附柱中加入500漂洗液，13，000 离心30-60s，倒掉废液。

6)将离心吸附柱放回收集管中，13，000 离心2，尽量出去漂洗液，将吸附柱开盖于室温
1-2，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

7)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65-70℃预热的洗
脱液，室温放置2。

13，000 离心2收集溶液。

8)产物-20℃保存。

完毕后电泳检测回收与纯化效果：回收纯化后，电泳检测应为单一的一条带，如果切胶过程中不慎带上染带，回收后电泳结果可能会出现两条以上的带，这时应重复上述方法进行回收与纯化。

实验四目的基因与表达载体的重组及重组子的筛选与鉴定
【实验步骤】
1载体与目的基因的连接
1)在一1.5 管中加入2酶切后的载体与6目的片段。

2)添加1的10×以及1的T4连接酶，总体积10。

3)16℃水浴条件下保温过夜连接。

2感受态细胞与连接产物的转化
1)取感受态细胞21（实验一制备）200，加入6连接产物，轻轻用枪吹打混匀（不可震
荡）。

2)冰浴30。

3)热激：42℃保温90S，冰浴2。

4)加入800 培养基，37℃慢慢复苏30。

5)将复苏菌液4000离心1，先吸去800μL上清，再将细胞吹散成细胞悬液，取50μL细
胞悬液直接涂布在含氨苄青霉素（）100、和的选择平板上。

6)将平板正向放置30左右至液体被吸收，倒置平板37℃培养16—20h出现菌落，其中白
色为重组质粒。

3 重组子的鉴定（蓝白斑筛选，小提质粒比大小和酶切分析）
1）将白色单菌落接入3 含抗生素（）的液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

2）按实验二的方法提取质粒，20 溶解沉淀。

3）双酶切质粒20 体系，方法同上。

4）1%琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒和它的酶切产物。

（酶切鉴定重组子可见重组成功的重组子有两个条带：一为切为线性的32a质粒条带，一为目的基因条带。

）
实验五目的基因在大肠杆菌中的诱导表达及表达产物的分析
实验I 、外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
【实验步骤】
1. 分别挑取白斑菌落（重组菌株）、蓝斑菌落（非重组菌株）于5 含的液体培养基中，37℃，190振荡培养过夜(注意取菌株要在超静工作台上操作，一定注意无菌)。

2.分别取过夜培养菌1接种到5含的液体培养基中（蓝，白斑各3管，作好标记），于37℃摇床培养4h左右，达到1个值。

3.因为诱导剂的量,诱导条件,诱导时间，培养基成分都可影响诱导表达，所以可按如下6组设计培养
摇瓶时间（）温度℃样液
5 7 32 白
5 7 37 白
5 7 42 白
5 7 32 蓝
5 7 37 蓝
5 7 42 蓝
4.分别取 6支试管按上述表格控制条件,摇瓶培养5h。

5. 取1摇瓶后菌液于离心管，共6支，4℃低温离心，12000 ，5 ，收获菌体，弃上清，取沉淀（菌体可放-20℃存放备用）。

6.向每支试管沉淀均加入200μL 液，将细胞悬浮。

7. 每管加入200μL 2 X 。

开水煮沸5，再冰浴2，4℃,12000 ，5 ，取上清液做凝胶电泳。

8.观测结果及分析（实验Ⅱ）。

实验Ⅱ检测表达蛋白
【实验步骤】
1．配制分离胶
分离胶配方
双蒸水分离胶缓冲
液
30%胶贮液10 10
6.7 5 8 200μL 15μL 150μL
①按要求装好胶板
②按比例调好分离胶，混匀后加入两玻璃夹缝中，到上口约2处，并小心在胶面上加入 1 蒸馏水，约 40 ，等胶自然凝聚后倾斜倒，出蒸馏水，并在两玻璃板夹缝中水平插入 1.5 的梳子(在胶面上加入蒸馏水称水封，其目的是保持胶面平整和防止空气进入，影响凝胶)。

2.按配方配制好浓缩胶
浓缩胶配方双蒸水浓缩胶缓冲
液
胶贮液10 10
6.1 2.5 1.3 100μL 15μL 75μL
混匀后加入到分离胶上，并没过梳子，待凝固后小心拨出梳子。

3．样品制备
菌体样品与 2×上样缓冲液 l:1 混匀，并在 100 C 沸水浴中保温 3-5 ，取出待用。

4.点样，电泳：开始电泳后，先恒压80V，样品进入分离胶后恒压120V，至电泳带跑到前沿后停止电泳。

5.固定、染色、脱色：电泳完毕，将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下凝胶，将凝胶浸泡于染色液中染色30左右，最后加脱色液放到脱色摇床上脱色至区带清晰为止。