拟除虫菊酯降解菌的分离_筛选及鉴定

摘要: 分离出 1 株能以拟除虫菊酯类杀虫剂为唯一碳源和能源的降解菌 w 10j15, 经鉴定为阴沟肠杆菌 (E n terobacter cloa2
cap ). 在 30 ℃、pH 7. 0 基础培养基发酵液中, 该菌对 100 m g ·L - 1 的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的降解率分别为
52. 43%、50. 76% 和 56. 89% , 对有机磷农药也有一定的降解力, 对甲胺磷、敌敌畏和毒死蜱的降解率分别为 21. 00%、11. 99%
2. 21% - 4. 72%.
2. 2 联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的含量与峰面积关系的标准 表 1 水样中联苯菊酯、甲氰菊酯和氯
氰菊酯的添加回收率
曲线
T ab le 1 A dd itive recovery rates of b ifen th rin,
图 1 表明, 联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的含量与峰面积呈 fenp ropath rin and cyperm eth rin in samp les
Abstract: A bacteria l stra in nam ed a s w 10j15, w h ich cou ld u se syn thetic p yreth ro id in secticides a s so le ca rbon and energy sou rces, w a s iso la ted, and ha s been iden tified a s E n terobacter cloacap. A t the condition of 30 ℃, pH 7. 0, the rem ova l ra tes of b ifen th rin, fenp rop a th rin and cyp erm eth rin w ith the con ten t of 100 m g ·L - 1 w ere 52. 43% , 50. 76% and 56. 89% , re2 sp ectively. T he stra in cou ld a lso degrada te o rganop ho sp ho ru s p esticides, the degrada tion ra tes of m etham idop ho s, dich lo r2 vo s and ch lo rp yrifo s w ere 21. 00% , 11. 99% and 12. 05% , resp ectively. Key words: syn thetic p yreth ro id in secticides; screen ing; iden tifica tion; E n terobacter cloacap
第2期
王兆守等: 拟除虫菊酯降解菌的分离、筛选及鉴定
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基础培养基组分[11 ]: N H 4NO 3 1. 00 g、M gSO 4 ·7H 2O 0. 50 g、(N H 4) 2SO 4 0. 5 g、KH 2PO 4 0. 50 g、N aC l 0. 50 g、K2H PO 4 1. 50 g、水 1000 mL , pH 7. 0.
和 12. 05%.
关键词: 拟除虫菊酯; 筛选; 鉴定; 阴沟肠杆菌
中图分类号: S482. 35,Q 939. 121. 09
文献标识码: A
文章编号: 100627817 (2003) 0220176205
Isola tion , screen ing and iden tif ica tion of syn thetic pyrethro id in sectic ides-degrad ing stra in s
2 结果与分析
2. 1 水样中联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的添加回收率 水样中联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的添加回收率试验结果见表 1.
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福建农林大学学报 (自然科学版)
第 32 卷
从表 1 可以看出, 联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的添加回收率为 95. 47% - 103. 21% , 变异系数为
随着生活水平的提高, 人们健康意识、环境意识明显增强. 环境问题越来越受到关注, 有关微生物降解 环境污染物、清除垃圾、保护生态环境方面的研究越来越受到重视. 用微生物降解杀菌剂、除草剂、石油、塑 料、多环芳烃、人工合成高分子化合物, 对受污染的土壤和水体的生物进行修复, 已成为当前环境科学研究 的热点[3- 10]. 农药微生物降解的研究从本世纪 40 年代开始, 而用微生物降解方法解决农药残留问题, 则是 一个较新的研究领域. 因目前无公害、绿色、有机食品倍受青睐, 用微生物降解方法解决农药残留问题可为 绿色食品生产提供一条新的途径. 有关农药微生物降解的研究, 在对有机磷和有机氯的降解方面的研究较 多, 菊酯类研究较少. 本文就拟除虫菊酯降解菌的筛选、鉴定及降解效能的测定进行初步研究.
W AN G Zhao 2shou, L IN Gan, L I X iu2x ian, L IAN G X iao 2x ia, YOU M in2sheng3
(Co llege of P lan t P ro tection, Fu jian A gricu ltu re and Fo restry U n iversity, Fuzhou, Fu jian 350002, Ch ina)
1 材料与方法
1. 1 试验材料 富集培养基组分[11]: 蛋白胨 10 g、N aC l 1. 0 g、KH 2PO 4 1. 0 g、水 1000 mL、葡萄糖 1. 0 g, pH 7. 0.
收稿日期: 2003- 03- 11 基金项目: 加拿大国际发展署 (C IDA ) 资助项目 (098 S470742192). 作者简介: 王兆守 (1972- ) , 男, 硕士. 研究方向: 生物农药与仿生农药. 3 通讯作者.
f Fu jian A gricu ltu re and Fo restry U n iversity (N a tu ra l Science Edition)
第 32 卷 第 2 期 2003 年 6 月
拟除虫菊酯降解菌的分离、筛选及鉴定
王兆守, 林 淦, 李秀仙, 梁小虾, 尤民生3 (福建农林大学植物保护学院, 福建 福州 350002)
良好的线性关系. 联苯菊酯标准曲线方程为:
农药在农业生产中不可或缺, 但农药的大量使用, 造成的污染也逐渐成为突出的现实问题. 拟除虫菊 酯是 20 世纪 70 年代开发出来的一类农药, 可用于防治茶树、蔬菜、果树、棉花、花卉、林木及卫生害虫等, 是目前仅次于有机磷、氨基甲酸酯的一类杀虫剂, 为杀虫剂中第三大类, 约占杀虫剂总量的 20%. 在我国 其施用面积已占杀虫剂总施用面积的三分之一以上. 这类农药普遍具有对环境稳定、降解速度慢和在加工 中降解率低等特点. 它们的广泛应用对生态环境产生了一定的影响. 联合国粮农组织和世界卫生组织 (FAO W HO ) 已对它们在农产品中的残留限量作出严格的规定, 如在茶叶出口方面, 2000 年 7 月 1 日实 施的菊酯类农药最大残留限量标准比以往更加严格[1- 2].
普通培养基组分: 牛肉膏 5. 0 g、蛋白胨 10. 0 g、N aC l 5. 0 g、水 1000 mL , pH 7. 0- 7. 2. 上述培养基经 121 ℃灭菌 30 m in.
1. 2 试验方法 1. 2. 1 菌株培养 取农药厂车间下水道污泥 4 份, 分别拌均, 各取 10 g, 在无菌操作条件下, 分别加到含 100 mL 50 m g·L - 1的联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯无菌液体富集培养基的三角瓶中 (250 mL ). 在 30 ℃ 下 180 r·m in- 1摇床上培养 7 d; 之后按 10% 的接种量将其转接到下一批富集培养基 (同上) 中, 继续培养 7 d; 再转接到含 200 m g·L - 1的联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯无菌液体的富集培养基中, 培养 7 d; 接着 转接到含 200 m g·L - 1的联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯无菌液体的基础培养基中, 继续培养 7 d, 再转接 2 次. 最后, 各取 0. 1 mL 基础培养基发酵液分别转接到对应的普通培养基平板上, 涂布平板, 置于 30 ℃恒 温培养箱中培养 48 h, 选取不同形态特征的菌株分别进行 3 次分离纯化[11- 16]. 1. 2. 2 水样中联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的添加回收率的测定 分别设计了 1、10、100 m g·L - 13 个 质量浓度的添加回收试验. 即将 3 种菊酯标样分别用丙酮配成 10000 m g·L - 1标准混合液; 之后在 3 种水 样 20 mL 中分别添加 2、20、200 ΛL 菊酯标准混合液, 充分混匀后, 取水样 2 mL , 分别用于 4、4、3 mL 的石 油醚的提取; 再用气相色谱仪进行测定, 每次进样 1 ΛL. 每种处理重复测 6 次, 取其平均值, 计算添加回收 率和变异系数. 1. 2. 3 标准曲线的绘制 采用外标法. 对样品中所含的每一组分用标准样作质量浓度与峰面积的关系图. 将联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的标样分别用石油醚稀释成 1、10、20、40、60、80、100 m g·L - 17 种质量 浓度, 然后用 H P 6890 气相色谱仪测定各稀释样品. 每次进样 1 ΛL , 每处理重复 3 次. 取峰面积的平均值作 标准曲线. 1. 2. 4 降解效能的测定 在以上述 3 种 100 m g·L - 1的菊酯混合药液为唯一碳源的基础培养基中, 接种 定量的降解菌株, 设不接菌为对照, 每处理重复 3 次, 30 ℃下在 180 r·m in- 1摇床上培养 3 d. 吸取 2 mL 培 养 液, 分 别 加 入 4、4、3 mL 的 石 油 醚 进 行 萃 取, 加 入 无 水 硫 酸 钠 吸 水, 并 定 容, 再 用 气 相 色 谱 仪 (H P 6890) 检测. 测试条件[17- 25]: 柱温采用程序升温, 起始温度 170 ℃, 以每分钟上升 30 ℃的速度升至 260 ℃, 保持 10 m in. 检测器 (F ID ) 温度为 300 ℃, 进样口温度 270 ℃, 不分流, 载气为 H e (99. 999% ) , 流量为 25 mL ·m in- 1, H e 流量为 30 mL ·m in- 1, 空气流量为 400 mL ·m in- 1, 进样量均为 1 ΛL. 1. 2. 5 降解率 降解率 % = 对照样品对残照留样量品- 残处留理量样品残留量×100[26]. 1. 2. 6 菌株的鉴定 选取降解力强的菌株, 测其降解力稳定性; 再取稳定性好的菌株, 采用 AM S2 V IT EK120 全自动微生物分析系统进行鉴定. 1. 2. 7 菌株生长和拟除虫菊酯农药降解率关系曲线的测定 将细菌等量接种到各基础培养基发酵液 (含 3 种菊酯各 100 m g·L - 1) 中, 30 ℃下, 在 180 r·m in- 1摇床上培养. 分别在 12、24、36、48、60、72、84、96、 108 h 后取出 (每处理 3 个重复) , 置 4 ℃冰箱中保存. 之后, 取样进行气相色谱分析, 剩余的发酵液离心后 取菌体, 并适当稀释后测D (415 nm ) , 绘制农药降解率曲线和菌体生长曲线. 1. 2. 8 菌株对其它农药降解力的测定 分别将w 10j15 接种到含有机磷农药乐果、敌敌畏、甲胺磷、毒死蜱 ( 100 m g ·L - 1) 的基础培养基中, 每一处理重复 3 次. 30 ℃下, 在 180 r·m in- 1 摇床上培养 3 d, 测定 w 10j15 对有机磷的降解力. 提取及检测方法参照文献[ 27 ].