第十章 原生质体培养和体细胞杂交
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植物生理学-第十章 植物的生长生理
植物细胞的生长分为三个时期： 分裂期、伸长期和分化期
细胞分化的理论基础是：细胞全能性
（一）细胞分化的内部调控机理 1、通过极性控制分化 极性是分化产生的第一步，极性的存
在使形态学上端分化出芽，下端分化出根。 极性产生的原因： 受精卵的第一次不均等分裂 IAA在茎中的极性传导
2、通过激素控制分化 IAA促进愈伤组织分化出根，CTK促 进分化出芽。 3、通过基因调控分化 如开花基因活化，可导致成花。 （二）外界条件对细胞分化的调节 1、糖浓度
4、种子寿命
种子寿命（seed longevity）：从种子 成熟到失去发芽力的时间。
顽拗性种子：不耐脱水和低温，寿 命很短，如：热带的 可可、芒果种子
正常性种子：耐脱水和低温，寿命 较长，如：水稻、花生
种子寿命与种子含水量和贮藏温度 有关。
二、影响种子萌发的外界条件 1、足够的水分 吸水是种子萌发的第一步：
不同作物种子萌发时需要温度高 低不同，与其原产地密切相关。
4、光 — 有的种子萌发需光
需光种子：光下才能萌发的种子， 如莴苣、烟草、杂草种子
需暗种子：光抑制种子萌发，如 茄子、番茄、瓜类种子
对光不敏感种子：有光无光都可
三、种子萌发时的生理生化变化 （一）种子吸水
种子的吸水分为三个阶段：
急剧吸水阶段 — 吸胀性吸水 吸水停顿阶段 胚根出现 大量吸水阶段 — 渗透性吸水
2、种子生活力 种子生活力（seed viability）：指种子 能够萌发的潜在能力或种胚具有的生命力。
鉴定种子生活力的方法：
（1）利用组织还原能力（TTC染色法）
TTC
2H 脱氢E
氧化态 无色
三苯甲瓒
还原态 红色2、利用原生质来自着色能力 —（染料染 色法）活种子的原生质膜有选择透性，不选 择吸收染料，原生质（胚）不着色。
细胞分化的理论基础是：细胞全能性
（一）细胞分化的内部调控机理 1、通过极性控制分化 极性是分化产生的第一步，极性的存
在使形态学上端分化出芽，下端分化出根。 极性产生的原因： 受精卵的第一次不均等分裂 IAA在茎中的极性传导
2、通过激素控制分化 IAA促进愈伤组织分化出根，CTK促 进分化出芽。 3、通过基因调控分化 如开花基因活化，可导致成花。 （二）外界条件对细胞分化的调节 1、糖浓度
4、种子寿命
种子寿命（seed longevity）：从种子 成熟到失去发芽力的时间。
顽拗性种子：不耐脱水和低温，寿 命很短，如：热带的 可可、芒果种子
正常性种子：耐脱水和低温，寿命 较长，如：水稻、花生
种子寿命与种子含水量和贮藏温度 有关。
二、影响种子萌发的外界条件 1、足够的水分 吸水是种子萌发的第一步：
不同作物种子萌发时需要温度高 低不同，与其原产地密切相关。
4、光 — 有的种子萌发需光
需光种子：光下才能萌发的种子， 如莴苣、烟草、杂草种子
需暗种子：光抑制种子萌发，如 茄子、番茄、瓜类种子
对光不敏感种子：有光无光都可
三、种子萌发时的生理生化变化 （一）种子吸水
种子的吸水分为三个阶段：
急剧吸水阶段 — 吸胀性吸水 吸水停顿阶段 胚根出现 大量吸水阶段 — 渗透性吸水
2、种子生活力 种子生活力（seed viability）：指种子 能够萌发的潜在能力或种胚具有的生命力。
鉴定种子生活力的方法：
（1）利用组织还原能力（TTC染色法）
TTC
2H 脱氢E
氧化态 无色
三苯甲瓒
还原态 红色2、利用原生质来自着色能力 —（染料染 色法）活种子的原生质膜有选择透性，不选 择吸收染料，原生质（胚）不着色。
植物细胞原生质体的制备与融合
植物细胞原生质体的制备与融合。
1、相关概念：（1）原生质体：是指那些已去除全部细胞壁的细胞。
细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。
此外，在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体称为原生质球或球状体。
（2）原生质体融合：即体细胞杂交。
用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。
若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。
2、原生质体的制备：在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。
在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。
如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。
游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。
基本程序如下：取材→除菌→酶解（加酶、渗透压稳定剂）→原生质体的收集与纯化→洗涤→原生质体活力的测定。
（1）取材与除菌：原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。
但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣。
因为，由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。
常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。
对外植体的除菌要因材而异，悬浮培养细胞一般无需除菌。
对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2-3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理。
最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。
（2）酶解：现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。
①配制酶解反应液:反应液应是一种pH值在5.5-5.8的缓冲液，内含纤维素酶0.3%-3.0%以及渗透压稳定剂，细胞膜保护剂和表面活性剂等。
③酶解：除菌绿。
反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。
经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。
原生质体培养与体细胞杂交
看护培养
在适宜的培养条件下，原生质体数小时后开始形成新的细胞壁。这时，在显微镜下可见原生质体由圆球形逐渐变为方形、多边形等。约24-36h后，原生质体开始发生第一次分裂；以后随着细胞分裂，原生质体就形成细胞团。
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但是，在细胞分裂开始以后，培养基中的甘露醇或山梨醇的浓度要逐渐降低，否则会影响细胞的继续生长、分裂。待原生质体形成的细胞团（愈伤组织）达到1mm时，应将细胞团转移到新鲜的培养基上继续培养。所形成的愈伤组织就可以按照普通的愈伤组织进行培养和植株再生。
第九章 原生质体培养与体细胞杂交
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原生质体的获得 原生质体的培养 体细胞杂交
202X
原生质体的获得
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原生质体的概念 原生质体的用途 原生质体的分离
202X
原生质体的概念
指植物细胞除去细胞壁以外的部分
植物原生质体是没有细胞壁的裸露细胞，它在一些研究方面具有独特的优势。
原生质体的分离 ——酶解法 注意事项 酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行灭菌，并且随配随用.
原生质体的分离 ——酶解法 酶解就是将无菌材料放入酶解液中、释放出原生质体的过程。 有菌材料，则必须进行表面消毒处理。叶片、幼茎和根等材料要切成小片，叶片最好撕去下表皮。 悬浮细胞则要离心后再酶解。
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原生质体的培养方法
原生质体的培养方法
液体—固体结合培养 液体浅层—固体平板培养双层培养法：培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基，再将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。优点是固体培养基中的营养可以缓慢释放倒液体培养基中。如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂。
马铃薯原生质体培养和体细胞杂交
• 一、马铃薯原生质体的分离与纯化
• 马铃薯原生质体分离、培养和植株再生都必须在无菌条件下进 行。
• （一）外植体的选择
• 要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组 织作材料。细胞悬浮培养物是最常采用的作为分离原生质体的 材料。而叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料。
• 马铃薯试管苗叶片、实生种子子叶和下胚轴都是获得马铃薯原 生质体的常用供体材料。
项目十 马铃薯原生质体培养
和体细胞杂交
• 知识目标 • 1.了解马铃薯原生质分离、培养的基本理论和方法； • 2.掌握马铃薯体细胞杂交的原理和方法。
• 技能目标
• 掌握马铃薯原生质分离、原生质体培养、体细胞杂 交的方法技术。
• 原生质体是去除细胞壁的裸露植物细胞。 • Klereker在1892年首先用利刃对细胞进行机械切割
• 最简便的固液结合培养方法是在培养皿的底部先铺一 薄层含凝胶剂的固体培养基，再在其上进行原生质体 的液体浅层培养。固体培养基中的营养成分可以慢慢 地向液体中释放，以补充培养物对营养的消耗，培养 物所产生的一些有害物质，也会被固体部分吸收，对 培养物的生长更有利。
• （二）马铃薯原生质体的培养过程
• 2. 液体浅层培养
• 即含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层。 是目前较常用的一种方法。其优点是方法操作简便， 对原生质体伤害较小，便于添加培养基和转移培养 物。缺点是原生质体在培养基中分布不均匀，容易 造成局部密度过高或原生质互相粘连而影响进一步 的生长发育．并且难以定点观察。
• 3. 固液结合培养法
• 目前常用的融合方法有：
• (一) 物理方法
• 主要采用电融合的方法。这是70年代末80年代初开始发 展起来的一项融合技术。
细胞工程植物原生质体培养和体细胞杂交
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细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
(三) 渗透压稳定剂
➢ 常用：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖和盐类 等。
➢ 不同物种原生质体分离时，所需的渗透压稳定 剂也不同。
➢ 原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中更 为稳定。
➢ 较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和 出芽，但同时也可能会抑制原生质体的分裂。
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
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•马铃薯原生质体再生植株
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
四、原生质体培养过程中的遗传变异
• 适应性变异 为非遗传变异，会随着环境条件的改变丧失其变异 特征。
漂浮法 不连续梯度法
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
沉降法
• 方法：比重小的等渗溶液中，对酶解物先过滤， 再低速离心，使完整的原生质体沉降于管底。
• 渗透压调节剂：甘露醇。 • 筛网过滤：除去大的组织碎片和残渣，孔径
44~169μm，依原生质体大小来定。 • 离心：900~4500r/min。
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细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
（二）酶的种类、组合和酶解时间
• 草本植物：2~3种酶混合液。纤维素酶为 0.5%~3%，果胶酶为0.1%~1%。
• 木本植物 ：纤维素酶同草本，果胶酶更多。 • 成熟花粉粒和四分体小孢子：除纤维素酶类和果
胶酶类外，尚需降解胼胝质层的蜗牛酶和胼胝质 酶，浓度为0.5%~2%。
➢ 温度： 一般为24~30℃，但不同物种间差异比较大。
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细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
三、原生质体再生过程
1、细胞壁再生 2、细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 3、植株再生
植物原生质体培养与体细胞杂交 PPT
常用得 PEG 和高 pH高Ca 相结合诱导融合得 具体操作程序:
混合双亲原生质体悬液,吸一小滴悬液于小 培养皿中,5~15min后原生质体沉到底面形成薄层;
每一小滴悬液慢慢加3小滴PEG溶液。PEG 溶液得组成:2难度ml 溶液(内含0、1 mol 葡萄糖、 10、5 mmol CaCI2、0、7 mol KH2PO4,KOH调节 pH到 5、5)加1g PEG-1560(或4000、6000,其她浓度)
45%,温度为19-21 度条件下生长得叶片可得到理想得原生
质体。
2、酶得种类
植物细胞壁就是由纤维素(25%~50%)、半纤维 素(50%左右)、果胶质(5%)组成。因此常用三种相 应得酶来降解细胞壁。一般认为纤维素酶和果胶 酶就是必需得,有些材料要加半纤维素酶。
商品酶制剂常含有杂质,对原生质体有不良影响, 有时要纯化。常用得方法就是将酶液在4 oC下过 Bio-Gel P6 或 Sephadex G-25。
3、渗透压得调控
如果溶液得渗透压和细胞内得渗透压不同,原生 质体有可能被涨破或收缩。因此在酶液、洗涤液和 培养液中渗透压应和原生质体内得相等或略大一些。 广泛使用得渗透压调节剂就是山梨醇和甘露醇,此 外还有蔗糖、葡萄糖、和麦芽糖,浓度约在0、40~0、 80mol/L。加入CaCl2、KH2PO4等能够提高原生质 膜得稳定性,增加完整原生质体得数目和活力。
6、原生质体得活力鉴定
(1)细胞壁染色法:
荧光增白剂——细胞壁染色剂,既可以鉴定细 胞壁就是否除净,也可检查原生质体细胞壁得再生 情况。染色后在荧光显微镜下观察(360~440nm), 染料与细胞壁形成显眼得绿色荧光,无细胞壁处则 无荧光反应,略带红色。
(2) 原生质体活力得测定:
原生质体融合和体细胞杂交的关系
原生质体融合和体细胞杂交的关系下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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原生质体培养和体细胞杂交
第6、7章 原生质体培养 与和体细胞杂交
第7章 原生质体培养绿体 线粒体 质膜 液泡 细胞核 内质网 微管 细胞壁
第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交
第一节、原生质体分离及 纯化
• 一、原生质体分离
双子叶外植体
胚性细胞
第一节、原生质体分离 及纯化
（一）材料来源
• 多数植物分离原生质体的经典材料----叶肉细胞。
第一节、原生质体分离 及纯化
2、漂浮法
原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原 生质体漂浮在液体的表面。 • 步骤： • 第一步：400目网筛过滤。 • 第二步：离心。 • 第三步：吸去上清液，洗涤液重悬，离心 沉淀。2-3次。 • 第四步：收集溶液表面原生质体，用培养 液洗1次。
第一节、原生质体分离 及纯化
第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交
第二节 原生质体培养
一、培养基
碳源
pH 培养基 渗透压 生长物质 氮源
钙镁
第二节、原生质体培养
二、培养方法
培养方法 液体浅层培养
平板培养法 双层培养法
饲养层培养法
第二节、原生质体培养
1、液体浅层培养
原生质体 悬浮液
2x105/ml
1mm厚液体培养基
第二节、原生质体培养
方法三种 离心沉淀法 漂浮法 界面法
第一节、原生质体分离 及纯化
1、 离心沉淀 法
• 原理：应用原生质体的比重大于溶液，离 心后原生质体沉于底部。 • 步骤： • 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 • 第二步离心（500-1000r/min，离心5-6min ）。 • 第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再 离心沉淀。如此2-3次。 • 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生
植物原生质体培养和体细胞杂交
❖ 脱壁的原生质体对光非常敏感，分离原生质 体一般是在黑暗条件下进行的。
❖ 在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上 培养4h后，叶片组织可完全分离 。
❖ 悬浮细胞需在25℃～33℃条件下酶解24h 。
渗透压稳定剂
❖ 原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将 引起细胞破碎。因而在酶液、原生质体洗涤 液、培养液中必须调整渗透压，维持细胞内 外渗透压平衡，防止细胞涨破或过分收缩而 破坏内部结构。
酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度
❖ 渗透压稳定剂 ❖ 质膜稳定剂 ❖ 分离条件：
离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续 时间。
❖ 分离用具
酶的种类、组合、浓度
几种草本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%)
材料
纤维 素酶
半纤 维素
酶
崩 溃 酶
果 胶 酶
离析 酶
蜗 牛 酶
研究者
烟草叶片 1.0
沉降法
❖ 利用比重原理，在具有一定渗透压的溶 液中，先进行过滤然后低速离心，使纯 净完整的原生质体沉积于试管底部。
❖ 优缺点：
纯化原生质体比较简单。 由于原生质体沉积于试管底部，造成相互
挤压，常引起原生质体的破碎。
12mL
0.45M 甘露醇
碎片带
❖ 又称界面法，采用两 种密度不同的溶液形 成不连续梯度，通过 离心使原生质体与破 损细胞分别处于不同 液相中，从而纯化原 生质体的方法。
Organogenesis
Somatic genetics
Protoplast system
Cell physiology
Cell fusion
Organelle, DNA uptake
Cell cloning
❖ 在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上 培养4h后，叶片组织可完全分离 。
❖ 悬浮细胞需在25℃～33℃条件下酶解24h 。
渗透压稳定剂
❖ 原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将 引起细胞破碎。因而在酶液、原生质体洗涤 液、培养液中必须调整渗透压，维持细胞内 外渗透压平衡，防止细胞涨破或过分收缩而 破坏内部结构。
酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度
❖ 渗透压稳定剂 ❖ 质膜稳定剂 ❖ 分离条件：
离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续 时间。
❖ 分离用具
酶的种类、组合、浓度
几种草本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%)
材料
纤维 素酶
半纤 维素
酶
崩 溃 酶
果 胶 酶
离析 酶
蜗 牛 酶
研究者
烟草叶片 1.0
沉降法
❖ 利用比重原理，在具有一定渗透压的溶 液中，先进行过滤然后低速离心，使纯 净完整的原生质体沉积于试管底部。
❖ 优缺点：
纯化原生质体比较简单。 由于原生质体沉积于试管底部，造成相互
挤压，常引起原生质体的破碎。
12mL
0.45M 甘露醇
碎片带
❖ 又称界面法，采用两 种密度不同的溶液形 成不连续梯度，通过 离心使原生质体与破 损细胞分别处于不同 液相中，从而纯化原 生质体的方法。
Organogenesis
Somatic genetics
Protoplast system
Cell physiology
Cell fusion
Organelle, DNA uptake
Cell cloning
植物原生质体的培养与体细胞杂交
。异变因基和体色染、异变征特态形为现表要主。代后给递传地定稳能 �异变因基和体色染及涉因异变传遗�征特异变其失丧而变改的件条境环随它�异变传遗非 为异变性应适 。异变性传遗和异变性应适括包 �异变的泛广着在存中程过养培体离物植 异变传遗�二� 。株植成育发接直后构结体 状胚成形或根定不和芽定不成形可 �中基养培化分到移转织组伤愈的成形养培体质生原 生再株植、3 。致所衡平不的裂分质胞和裂分核是能可这 �象现裂分丝有的常正不生发会中程过养培体质生原 。大很化变率板植体质生原此因 �裂分丝 有胞细行进能都定一不胞细生再但 �提前的裂分丝有则规行进是在存的壁胞细体质生原 裂分胞细、2 。大增积体或芽现出会常 体质生原的全不育发壁胞细而 �裂分丝有胞细的常正行进步一进体质生原的壁胞细整完生再 。成完生再壁胞细天数至天两 �壁胞细生再始开后时小数养培经体质生原 �下况情常正 。件条 决先的裂分胞细是生再的壁胞细而 �力能在潜的裂分和生再有具都体质生原的力活有具 生再壁胞细、1 程过生再体质生原�一� 。程过的株植整完 出化分体状胚过通或织组伤愈过通或后最 �团胞细成形裂分续持胞细生再 �壁胞细复恢快很 �下件条养培的好良和法方养培的当适在体质生原的化纯、离分指是程过生再体质生原 异变传遗与程过生再体质生原、六 。法方种一的养培荡震�后珠糖脂琼成形待�中 液养培入滴滴液的右左 lm5.0 以后然 �匀均合混液体质生原的纯提与液糖脂琼的温适用 养培珠糖脂琼、4 。法 方的面表基养培脂琼体固在布涂 �合混液浮悬体质生原的度浓定一与脂琼的积体等将指是法 养培层双体固-体固�散扩的分成害有和放释步逐的分成养营于利又�长生的体质生原于利 既�合结的养培体固与养培体液是。法养培层双体固-体液为法方养培的面表基养培脂琼体 固在布涂液浮悬体质生原度浓定一将。养培层双体固-体固和养培层双体固-体液为分又 养培层双、3 。法方的 养培止静层浅中皿养培于置 lm4—3 出取�度密胞细定一到整调液养培用体质生原将是 养培层浅体液、2 。察观点定于便 �动游其免避�定固置位体质生原使。法方的板平体固层薄成制内皿养培在�合混基养培脂 琼的℃54 于处的积体等与度密胞细定一照按体质生原的积体定一将指�养培板平叫又 养培层薄体固、1
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借助于精巧的显微操作技术将融合体和杂种细胞直接挑选
出来进行单独培养。
杂种或胞质杂种植株的鉴定
通过杂种植株和亲本植株的形态学特征来鉴定
杂种和亲本的核型分析 杂种和亲本的同工酶谱分析 分子生物学的方法 杂种植株和亲本植株的其它特性
体细胞杂交技术在农业上的应用
通过体细胞杂交培育抗病的新品种 通过体细胞杂交获得新种
源遗传物质、低等生物等等，它是理想的起始材料和受体；
在同一时间内获得的大量原生质体在遗传上是同质的，可为细胞生物学、发
育生物学、细胞生理学、细胞遗传学等提供良好的实验体系。
植物原生质体在离体培养条件下能够再生细胞壁，继续生长和分裂，形成愈
伤组织，分化再生成完整植株，即植物原生质体仍然保持着细胞的“全能 性”。这就给高等植物细胞工程和基因工程的发展提供了诱人的前景。
原生质体活力的测定
测定原生质体活性有多种方法
观察胞质环流形态观察法 活性染料染色（酚藏花红染色法） 荧光素双醋酸酯（FDA）染色
原生质体培养的培养基和培养方法
培养基
原生质体培养和组织培养一样，培养基中需要大量元素和微量元素
做营养源、需要糖类物质做碳源、还需要许多有机营养、需要补充 一些内源激素。一般采用的是改变了的细胞培养基。
可以是种类的也可以是种间的，甚至是属间、科间很远缘的。包括 化学方法和电融合法 化学方法：硝酸钠 、高钙-高pH、聚乙二醇（PEG）融合法等 电融合法
融合体的发育过程
细胞壁再生
核融合
细胞增殖
杂种细胞选择
设计一个选择程序，使在某种条件下只有杂种细胞生长， 而任一亲本却不能在此条件下生长，或生长速度缓慢、或 中途夭折。
培养方法
固体培养、液体培养及固液结合培养。
原生质体在培养过程中发生的变化
细胞壁的形成
细胞分裂和愈伤组织的形成
植株的再生
（图）
体细胞杂交
体细胞杂交的概念
用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体
诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植 株的整个过程，以及研究其亲代、子代的性状表现和有
均匀一致且质量好。
一步法：将纤维素酶和果胶酶配臵成混合酶液一起使用。此法由于
减少了操作步骤，减少了微生物的污染，是目前经常采用的方法。
（图）
影响原生质体产量和活力的因子
材料的选择
酶的种类、组合和酶解时间
渗透压的调控
材料的预处选择
一般来说，植物各个器官，如：根、茎、叶、花、果实种子
的消毒方法基本相同。
PH
酶液的PH对原生质体的产量和活力影响很大。 植物材料不同，要求的PH有差异。一般为5.5-5.8。 如果供体材料是植物组织器官，要在酶液中加 PH 缓冲剂。
原生质体的收集与纯化
原生质体的纯化方法主要有三种：沉降法、漂浮法和不连续
梯度离心法。
沉降法（目前广泛采用的方法）：
渗透压稳定剂的使用浓度不宜过高或过低，以细胞轻度质
壁分离为宜，一般浓度在0.3-0.6mol/L之间。
材料的预处理、灭菌处理
材料的预处理
有不少文献报道在游离原生质之前对材料进行预处理能
提高原生质体的分裂频率。
这些预处理包括暗处理、预处理、低温处理等。
材料的灭菌处理
一般来说，灭菌方法与前面介绍的用于组织和器官培养
酶的种类、组合和酶解时间
选择纯度高的酶类，根据酶解材料细胞壁的特性以及酶的
活性大小确定适宜的酶液组合。
酶的浓度不宜过高，酶解时间不宜过长，最好不超过8小 时。
渗透压的调控
植物细胞壁对植物细胞有良好的保护作用。去除细胞壁之 后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体 有可能涨破或收缩 。 渗透压稳定剂主要可分为两大类：一是由糖醇和可溶性糖 组成的有机溶剂，目前大多采用这一类，一般使用甘露醇 或山梨醇；另一类是无机盐溶液，由氯化钙、硫酸镁、氯 化钾或培养基中的无机盐组成。
将酶解后收集起来的原生质体混合液过滤，除去未消化的细胞团块和筛管、
导管等杂质，收集滤液；
将收集到的滤液离心，用吸管谨慎地吸去上清液； 将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中，再次离心，去上清液，如此重复
三次；
用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。一般原
生质体的培养密度为5x103—104个/ml。
关的理论与实际问题。
体细胞杂交步骤
原生质体制备→原生质体融合→杂种细胞选择→杂种细
胞培养→由杂种组织再生植株→杂种或胞质杂种植株的 鉴定
原生质体融合
自发融合
在酶解细胞壁过程中，有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体，
它是由不同细胞间胞间连丝的扩展和粘连造成的
诱导融合
指加入诱导剂或用其他方法使两亲本原生质体融合，因此诱导融合
通过原生质体融合转移细胞质基因控制的性状
分离叶肉原生质体的技术流程
体细胞杂交过程
原生质体培养的技术流程
化学诱导融合的机制
电融合
及愈伤组织细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。
选用愈伤组织或悬浮细胞系，要注意选择继代后处于旺盛分 裂时期的材料；愈伤组织同时要注意挑选淡黄色、颗粒状的 材料。
选用植株上的外植体，一定要注意植株的年龄、生长发育状
态、外植体组织器官的成熟度等，即选择生长健壮植株上较
幼嫩的组织。最好事先培养无菌试管苗，可免去消毒程序， 提高原生质体的活力。
原生质体（Protoplast）的概念及作用
定义
原生质体是指除去全部细胞壁的“细胞”，或者是一个为质膜所包围的“裸
露细胞”。
作用
植物原生质体没有细胞壁，仍可进行植物细胞的各种基本生命活动，非常有
利于探讨许多细胞生理问题；
植物原生质体没有细胞壁，可用以进行诱导融合，引入细胞器、大分子、外
原生质体的制备（分离）
机械法
把叶肉细胞、愈伤组织细胞或悬浮细胞放在高渗的糖或盐溶液中，
使之发生质壁分离，原生质体收缩呈球形，然后用利刀切割。
此法获得的原生质体数量很少，手续精细而繁琐，只适用于液泡化
的细胞。
酶法
两步法：先用果胶酶处理叶片小块，使之释放出单个细胞，然后再
用纤维素酶消化掉细胞壁，释放出原生质体。此法获得的原生质体
第十章
原生质体培养和体细胞杂交
原生质体培养
原生质体培养和体细胞杂交
原生质体的分离
原生质体培养的培养基和培养方法
体细胞杂交（图）
体细胞杂交技术在农业上的应用
原生质体的分离
原生质体的概念及作用
原生质体的制备（分离）
影响原生质体产量和活力的因子
原生质体的收集与纯化
原生质体活力的测定