牛卵母细胞孤雌激活研究

２．３ 化学激活与电激活方法比较 见表 ２，乙醇 ＋ ６－ＤＭＡＰ 和电激活 ＋ 乙 醇 ＋６－ＤＭＡＰ 两种激活方法都对卵母细胞有 较高的激活率， 两者的差异不显著。核移植 时，当供体细胞移入受体细胞时，需要对卵 母细胞进行融合。这说明采用电激活（ １ ． ６ｋｖ／ｃｍ，１ 次）＋ 乙醇 ＋６－ＤＭＡＰ 可以用于核 移植。
２
１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ 、０．０５％ＢＳＡ）中平衡 １－ ２
２ｍｉｎ 后转入充满融合液的极间距为 ０．１ｍｍ 的融合槽中，在解剖镜下用吸管调整各个卵 母细胞之间的距离进行激活，激活后的卵放 到 Ｆ Ｍ 液中，待全部激活后将卵移入 Ｈ － Ｍ１９９ 中洗涤，然后放入 ＩＶＭ 中，在培养箱 中培养 ３０ｍｉｎ。计算融合率。实验分 ６ 组，固 定脉冲时间为 ２０ μ ｓ，在 ３ 种电压（１．７ｋＶ／ ｃｍ，１．６ｋＶ／ｃｍ，１．５ｋＶ／ｃｍ）下分别对卵母 细胞通以一个直流脉冲和两个直流脉冲（２ 次激活间隔时间 ０．５ｓ）。评估不同的直流脉 冲对卵母细胞电融合率的影响。
参考文献 ［１］ 曾松亭．我国超级稻产业的科技发展与 展望．广东农业科学．２００６ 年第 ７ 期 ［２］ 李克勤．发展超级稻 提高水稻综合生 产能力 ［Ｊ］．中国稻米．２００５ 年 ０１ 期 ［３］ 陈友订．广东省超级稻育种研究进展与 展望 ［Ｊ］．广东农业科学．２００５ 年 ０１ 期 ［４］ 江奕君，林青山．华南双季超级稻育种 的实践与体会［Ｊ］．广东农业科学．２００５ 年 ０１ 期 ［５］ 林青山，江奕君．华南超级稻育种及示 范推广［Ｊ］．广东农业科学．２００５ 年 ０４期 ［６］ 谢华安．中国特别是福建的超级稻研究 进展 ［Ｊ］．中国稻米．２００４ 年 ０２ 期 ［７］ 雷秉乾．加强超级稻研究开发 促进水 稻生产再上台阶［Ｊ］．湖南农业．２００５ 年 ０６ 期 ［８］ 青先国，王学华．超级稻研究的背景与 进展［Ｊ］．农业现代化研究．２００１ 年 ０２期 ［９］ 林贤青．超级稻在不同水分管理条件下 的营养、生理和生态特性研究［Ｄ］．浙江大 学．２００５ 年 ［１０］ 程式华．粮食安全与超级稻育种．中国 稻米 ［１１］ 李克勤．发展超级稻提高水稻综合生 产能力．中国稻米 ［１２］ 徐庆国． 超级稻的研究现状与发展对 策探讨． 作物研究 ［１３］ 陈温福，徐正进，张龙步．水稻超高产育 种 －－ 从理论到实践．沈阳农业大学学报 Ｊ ［１４］ 陈友订．广东省超级稻育种研究进展 与展望．广东农业科学
摘 要 本文探讨了 Ｈ Ｙ Ａ （透明质酸酶）的浓度和作 用时间对牛体外成熟卵母细胞脱卵丘的影 响，不同强度电脉冲 ＋ 乙醇 ＋６－ＤＭＡＰ 对牛体 外成熟卵母细胞的孤雌激活作用以及和乙醇 ＋ ６ － Ｄ Ｍ Ａ Ｐ 激活的比较。对电融合脉冲强度， 脉冲次数进行了优化。结果表明：卵母细胞 成熟培养 ２２ｈ，用 ０．２０％ＨＹＡ 作用 １０ｍｉｎ 或 ０． ５０％ＨＹＡ 作用 ５ｍｉｎ 效果较好。在激活电压 １ ． ６ｋＶ／ｃｍ、２０ μ ｓ／ 次、间隔 １ｓ ，脉冲次数 为 １ 次的条件下的激活效果较好，在此条件 下与乙醇 ＋６－ＤＭＡＰ 激活相比较，孤雌激活胚 胎的囊胚率分别为 １９．６％ 和 ２６．９ ％，差异不 显著。 关键词 牛；卵母细胞；孤雌激活
１．２．４．２ 乙醇，６－ＤＭＡＰ 的激活和发育 培养
将电激活后的卵放入无水乙醇 ７ ％＋ ＩＶＣ 中静置激活 ７ｍｉｎ，再在含 ２ｍｍｏｌ／Ｌ ６－ Ｄ Ｍ Ａ Ｐ 的培养液中，于 ３ ８ ． ５ ℃、５ ％ Ｃ Ｏ ２ 和饱和湿度条件下活化 ４ｈ。待激活完毕，用 Ｉ Ｖ Ｃ 液洗涤 ３ 次，然后移入 Ｉ Ｖ Ｃ （Ｓ Ｏ Ｆ － ａａ＋３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）培养，第 ２ 天起检查卵 裂率，培养 ７ｄ 后检查囊胚率。
农 业
中国科技信息 ２００８ 年第 ２０ 期 ＣＨＩＮＡ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ Ｏｃｔ．２００８
牛卵母细胞
孤雌激活研究
邓守龙 １．２ 王安江 ２ 曹文广 １ １．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 １００１９３ ２．新疆农业大学动物科学学院 ８３００５２
ＦＳＨ，２０ μ ｇ／ｍＬ ＬＨ，１ μ ｇ／ｍＬ １７－Ｅ ， ２
１００ＩＵ／ｍｌＰ／Ｓ 的 ＴＣＭ－ １９９）中洗涤。然后， 将 ＣＯＣｓ 移入成熟培养液中，在培养箱中成 熟培养 ２２ｈ。
１．２．３ 体外成熟卵的检查 观察第一极体排出情况：将充分扩展 的 ＣＯＣｓ 置于含 ０．２％ 或 ０．５％ 透明质酸酶的 Ｈ－Ｍ１９９ 中，培养箱中消化颗粒细胞 １０ｍｉｎ 或 ５ｍｉｎ 后，将带有少量致密卵丘的卵母细 胞移入新鲜的 Ｈ－Ｍ１９９ 中，用 １００ μ Ｌ 的移 液枪反复吹打去掉成熟卵母细胞表面的卵丘 细胞，使卵母细胞成为裸卵。在体视显微镜 下，选择排出第一极体进入 Ｍ Ⅱ期的卵母 细胞进行孤雌激活。 １．２．４ 牛卵母细胞的孤雌激活及发育培 养 １．２．４．１ 电激活 选择明显具有第一极体的成熟卵母细 胞，在激活液 ＦＭ（０．３ｍｏｌ／Ｌ 甘露醇、０． ５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈｅｐｅｓ、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ 、０．
２
收集的 Ｃ Ｏ Ｃ ｓ 先用 Ｈ － Ｍ １ ９ ９（Ｔ Ｃ Ｍ １ ９ ９ ＋ １ ０ μ ｇ／ｍｌＨｅｐｅｓ ＋０．０５％ＦＢＳ＋１００ＩＵ／ｍｌＰ／Ｓ） 洗涤，再用成熟培养液（含 ２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，０． ５５ｍｇ／ｍｌ 丙酮酸钠，１０％ＦＣＳ，１０ μ ｇ／ｍＬ
表 １ 不同电场强度对牛体外成熟卵母细胞激活的影响
有必要对融合条件进行探索。孤雌激活是很 好的技术工具，本文研究了牛卵母细胞孤雌 激活方法的优化。
１ 材料与方法
１．１ 材料 本研究用于卵母细胞成熟、激活以及 孤雌胚发育的生化试剂：ＴＣＭ１９９（ＧＩＢＣＯ）、 胎牛血清 Ｆ Ｃ Ｓ （ Ｇ Ｉ Ｂ Ｃ Ｏ ） 、双抗（ Ｐ ／ Ｓ ， ＧＩＢＣＯ），其它均购自 Ｓｉｇｍａ 公司。电融合 仪（澳大利亚 ＣｒｙｏＬｏｇｉｃ，ＶＯＬ ＴＡＩＮＥＰ－１）。 配制各种液体所用的水均为ＭｉｌｌｉＱ过滤的超 纯水。 １． ２ 方法 １．２．１ 卵巢卵母细胞的采集 屠宰场采集牛卵巢，为本地黄牛和奶 牛卵巢。将采集的卵巢置于３８．５℃含青霉素 １００ＩＵ／ｍｌ，链霉素 １００ μ ｇ／ｍｌ 的灭菌生理 盐水的保温瓶中，２ｈ 内运回实验室。用预温 的生理盐水清洗卵巢。用带 １２＃ 针头的 １０ｍＬ 注射器吸取卵巢表面 ２ － ８ｍ ｍ 大小的卵泡， 卵泡液收集于 ６ｃｍ 灭菌培养皿中。然后在体 视显微镜下挑选含有完整卵丘细胞层且胞质 均匀的卵丘 － 卵母细胞复合体（ＣＯＣｓ），并 用 ＤＰＢＳ（１３６．８７ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ＋２．６８ｍｍｏｌ／ Ｌ ＫＣｌ＋１．４７ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ ＰＯ ＋８．０９ ｍｍｏｌ／
为了克服胚胎体外激活、融合中存在 的缺陷，近年来人们对牛卵母细胞的激活体 系和方法进行了系统研究。牛卵母细胞的人 工激活方式很多，目前常用的激活方法是物 化联合激活法，电激活与乙醇、６ － Ｄ Ｍ Ａ Ｐ 联合使用可取得较佳的激活效果，但最佳的 激活方法目前还不一致。电激活可使一部分 重构胚发生碎片化和死亡，相当一部分重构 卵在电激活后死掉或者发生形态异常，所以
卵母细胞的充分激活是提高核移植效 率的关键因素之一，目前核移植效率很低。 早期胚胎的质量与体内胚胎相比仍有很大差 距，在早期胚胎体外培养时，如果胚胎所处 的条件不当，就会出现“发育阻断”现象，导 致这些发育异常的因素是克隆动物体内的某 些基因不正常表达和细胞核的甲基化异常造 成的。因此，重构胚的激活方法和激活是否 完全对克隆胚胎的发育有十分重要的影响。
３ 、提高超级稻生产机械化水平 水稻生产的全程机械化是提高我国稻 农收入的一个重要手段。经过近几年的发 展，我国水稻机械化水平在一定程度上得 到了较大的提高。过去，我国的水稻生产 机械主要用于北方稻区，且多为中大型机 械，这在广阔平整的北方稻田有一定的用武 之地。根据统计资料，北方稻区水稻播种面 积和产量虽只有全国的 １０％，但机插面积占 全国的 ９２％，其中东北占近 ８０％，机械直播 面积占全国的 ６５％，机械收获面积占全国的 ２５％。而在我国水稻主产区的南方地区，超 级稻生产的机械化程度较低，除了在水稻种 植的前期和水稻生长过程中的管理阶段初步 实行了机械化外，超级稻生产的两个重要阶 段——移栽和收获，机械化程度很低，特别 是移栽机械化目前仍处于攻坚阶段。移栽与 收获这两个阶段是我国水稻生产较为费工费 劳时期，人工费用的 ５０％ 以上集中在这两个 阶段，目前收割机械化水平有了较大提高， 而提高我国南方稻产区超级稻生产移栽机械 化将是我国水稻机械今后研究的重点和难 点。若要提高稻农的种稻收益，超级稻生产 的机械化是一项必备要件。根据研究和分析 的结果，实行机械化生产的稻产区，水稻产 后损失少，亩产量较高，与手工劳动和半机 械化生产相比，亩成本利润率高出 １０－１５ 个 百分点，每亩的纯收入高出５０．６－６０．３元，超 级稻由于其产量高，影响大，机械化生产尤 其是小型水稻生产机械显得尤为重要。
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作用 ５ｍｉｎ 两种方法都有较高的卵裂率，０． ２ ０ ％ Ｈ Ｙ Ａ 作用 ５ ｍ ｉ ｎ 或 ０ ． ５ ０ ％ Ｈ Ｙ Ａ 作用 １０ｍｉｎ 处理卵母细胞，其卵裂率仅为 ５０％ 和 ２１．４％，与前两者相比差异显著。
２．２ 不同电激活方法对牛卵母细胞激活 的影响
卵母细胞经脱卵丘后，各组的激活率， 卵裂率，囊胚率见表 １。１．６ｋＶ／ｃｍ，直流脉 冲重复次数为 １ 次的效果最好，但与 １．６ｋＶ／ ｃｍ，直流脉冲重复次数为 ２ 次的差异不显 著，说明在 １．６ｋＶ／ｃｍ 的直流电压下可以很 好的激活牛的卵母细胞。
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Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４＋０．３３ｍｍｏｌ／Ｌ 丙酮酸钠，用时加 入 １０％ 的 ＦＣＳ）清洗后备用。
１．２．２ ＣＯＣｓ 筛选与体外成熟培养 培养前，将洗卵液 Ｈ－Ｍ１９９ 和成熟培养 液分别置于 ３５ｍｍ 玻璃皿中和四孔板中加入 ５００ｕｌ 成熟液并覆盖３００ｕｌ的石蜡油，在３８． ５℃、５％ＣＯ 、饱和湿度下培养箱中平衡 ２ｈ。