【CN109627322A】一种从Cohn组分上清中分离纯化人血清白蛋白的方法【专利】

技术领域 [0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种从Cohn组分Ⅴ上清中分离纯化人血清白蛋白 的方法。
背景技术 [0002] 人血清白蛋白(Human Serum Albumin ,HSA)是血浆中含量最丰富的一种蛋白质， 约占 血浆蛋白 总含量的 60％ 左右。在人体内 ，血清白蛋白的 主要生理功能是维持血液渗透 压 和携带血液中 多 种配基 (包括脂肪酸 、氨基酸 、类固醇 、金 属离子及药物) 与组织进行交 换，临床用于手术输血和危重病人补液，治疗创伤休克、发烧、水肿和低白蛋白血症等，而且 能增强人体抵抗能力，是目前临床用量最大的药用蛋白。 [0003] 目前人血清白蛋白的制备主要采用低温乙醇沉淀工艺，其主干通常是Cohn法或其 变法或简法。大规模生产中先将血浆蛋白 分成几个大的组分 ，再从其中分离出不同的 药 用 蛋白。其中组分I中主要成分为纤维蛋白原、VIII因子等，组分II主要为丙种球蛋白 ，组分 III主要为α及β球蛋白 ，组分IV主要为α及β球蛋白 、转铁蛋白等 ，组分Ⅴ主要为白蛋白。 [0004] 在CN104004084A、CN103394076A、US5346992A、US5250662等公开的工艺中，白蛋白 的分离主要以冷乙醇沉淀法得到组分V沉淀为原料，进一步结合沉淀、超滤或层析等技术提 高纯度。在沉淀过程中 ，白蛋白的收率较低 ，部分白蛋白随组分I、组分II、组分III和组分IV 沉淀而流失，还有一部分白蛋白残留于组分V上清中。从组分I、组分II、组分III和组分IV沉 淀中回收白蛋白的方法均有报道，例如从Kistler-Nitchmann工艺组分IV沉淀中回收白蛋 白 (刘鹏翰 ,从低温乙醇法FIV组份中分离人血白蛋白的研究 .药物生物技术 ,1997(02): p .114-117 .) ；苏志国等以Cohn组分IV为原料，提取人血清白蛋白(CN102977180A) ；张林等 从低温乙醇沉淀组分I+II+III中回收白蛋白 (CN102311496A) 。组分Ⅴ上清则作为废液被丢 弃或用于回收乙醇，目前为止未见从组分V上清中分离纯化白蛋白的报道。 [0005] 有部分工艺不进行组分V沉淀，即以组分IV沉淀后所得上清为原料，经超滤脱醇后 得到白蛋白。如采用多步浓缩和超滤脱醇 ，可以 将白蛋白浓度提高以达到富集的目的 ，同时 使乙醇残留降 到较低水平 (刘隽湘 ，输血疗法与血液制品[M] ，北京 ，人民 卫生出版社 ， 1996) 。但是该工艺需要使 用大量缓冲液稀释原液 ，并且超滤操作时间长 ，长时间处于较高 浓度的乙 醇中不利于蛋白 活性的 保持。虽 然通过降 低超滤膜的 截留率可以 提高 操作速率 ， 但是却对蛋白收率有很大影响。另一方面 ，超滤法对白蛋白的纯化作用有限 ，无法有效分离 与白蛋白 分子量 相近的 杂蛋白 。CN105037487A公开了一种人血白蛋白的 制备方法 ，以 健康 人血浆上清为原料 ，采 用Kistler-Nitchmann低温乙 醇法沉淀 、分离组分I+II+III 和组分 IV ，对组分IV分离后上清液进行脱醇处理 后 ，再配合一步离子交换层析 ，超滤 ，加入适量的 辛酸钠作为稳定剂 ，经巴氏 病毒灭活处理后得到人血白蛋白成品。经高效液相色谱法检测 该工艺制备的人血白蛋白的纯度≥99％，多聚体含量≤1％，收率达到28～30g/L血浆。制品 的纯度更高 ，杂蛋白 含量更低 ，使得临床 用药更加安全。但是此方法缓冲液 用量大 ，操作时 间长。
权利要求书2页 说明书5页 附图2页
CN 109627322 A
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权 利 要 求 书
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1 .一种从Cohn组分Ⅴ上清中分离纯化人血清白蛋白的方法，其特征在于，包括以下步 骤 ：将Cohn组分Ⅴ的上清液上样至含有阴离子交换层析介 质的 层析柱中 ，使 用洗脱液洗脱 层析柱，收集洗脱液得到人血清白蛋白。
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权 利 要 求 书
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清白蛋白；最后使用清洗液清洗层析柱，其中清洗液为含有浓度为0 .2～1M的氯化钠的pH值 为4 .0～6 .0、浓度为20～100mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。 Nhomakorabea3
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说 明 书
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一种从Cohn组分Ⅴ上清中分离纯化人血清白蛋白的方法
本发明提供了一种从Cohn组分Ⅴ上清中分 离纯化人血清白蛋白的 方法 ，包括以 下步骤 ：将 Cohn组分Ⅴ的上清液上样至含有阴离子交换层 析介质的层析柱中 ，使用洗脱液洗脱层析柱，收 集洗脱液得到人血清白蛋白 ；本方法首次提出以 低温乙醇沉淀组分V上清为原料分离纯化白蛋白 的 新思路 ，不采 用超滤工艺脱除乙 醇 ，从而大大 降 低了缓冲液 用量 ，减少操作时间 ，避免了蛋白 长时间在较高乙醇溶液中的变性失活问题，具有 操作简单，成本低廉，过程耗时短，蛋白活性收率 高等优点。利用本发明方法可以对组分Ⅴ上清中 的白蛋白进一步回收 ，有效提高血浆利用率，降 低成本，对于实际应用具有重要的价值。
( 19 )中华人民 共和国国家知识产权局
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910012824 .3
(22)申请日 2019 .01 .07
(71)申请人 中国科学院过程工程研究所 地址 100190 北京市海淀区中关村北二街1 号
(72)发明人 罗坚 苏志国 陈颖 向杰
(74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司 11332
2 .根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析介质的孔径为10～ 90nm；
优选地，所述阴离子交换层析介质的间隔臂包含3～12个碳原子； 优选地，所述阴离子交换层析介质包括DEAE Sepharose Fast Flow、QSepharose Fast Flow、Capto Q、Capto DEAE、Capto Q XP或Fractogel EMD TMAE中的任意一种。 3 .根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将Cohn组分Ⅴ的上清液上样前，还包括 使用平衡液平衡阴离子交换层析介质； 优选地，所述平衡液为磷酸盐缓冲液； 优选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为20～100mM； 优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6 .0～8 .0。 4 .根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述Cohn组分Ⅴ的上清液pH值 与平衡液的pH值相同。 5 .根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述上样结束后，还包括使用 平衡液淋洗层析柱； 优选地，所述淋洗使用的平衡液的体积为3～10倍柱体积。 6 .根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述洗脱液为柠檬酸-柠檬酸 钠缓冲液； 优选地，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为20～100mM； 优选地，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH值为4 .0～6 .0。 7 .根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述收集洗脱液后，使用清洗 液清洗层析柱； 优选地，所述清洗液为含有氯化钠的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液； 优选地，所述氯化钠在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的浓度为0 .2～1M； 优选地，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为20～100mM； 优选地，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH值为4 .0～6 .0。 8 .根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述洗脱液进行超滤浓缩并置 换缓冲液得到人血清白蛋白。 9 .根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述超滤浓缩为使用超滤膜将洗脱液进行 超滤； 优选地，所述超滤膜的截留分子量为10～30kDa。 10 .根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：使用体积为3 ～10倍柱体积、浓度为20～100mM、pH值为6 .0～8 .0的磷酸盐缓冲液平衡孔径为10～90nm、 间隔臂包含3～12个碳原子的阴离子交换层析介质，将Cohn组分Ⅴ的上清液上样至含有阴 离子交换层析介质的 层析柱中 ，其中Cohn组分Ⅴ的上清液与磷酸盐缓冲液pH值相同 ，然后 使用浓度为20～100mM、pH值为4 .0～6 .0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗脱层析柱，收集洗脱 液，将洗脱液使用截留分子量为10～30kDa的超滤膜进行超滤浓缩并置换缓冲液，得到人血
代理人 巩克栋
(51)Int .Cl . C07K 14/765(2006 .01) C07K 1/18(2006 .01)
(10)申请公布号 CN 109627322 A (43)申请公布日 2019.04.16
( 54 )发明 名称 一种从Cohn组分Ⅴ上清中分离纯化人血清
白蛋白的方法 ( 57 )摘要