HLA2I分子对B711共刺激作用的影响①

H LA2I分子对B711共刺激作用的影响①李增山　隋延仿　叶　菁　(第四军医大学病理教研室肿瘤抗原肽实验室,西安710032) 中国图书分类号　R392112　R73517 文献标识码　A 文章编号　10002484X(2001)0920466203摘　要　目的:研究H LA2I分子表达与B711分子的共刺激作用的相互关系,以探讨在肿瘤细胞所诱发的免疫排斥反应中共刺激分子对抗原递呈机制的影响。

方法:通过流式细胞仪(FC M)检测转染共刺激分子B711编码基因前后其表面H LA2I分子的表达情况。

利用单克隆抗体阻断细胞表面H LA2I分子,以外周血混合淋巴细胞对阻断前后的细胞行杀伤实验。

结果:表达B711的肝癌细胞其表面H LA2I分子表达明显增高(P<0101),而γ2I NF刺激对细胞表面H LA2I分子的表达情况并无影响(P>0105)。

T淋巴细胞对转染后细胞的杀伤作用远远大于未转染组(P<0101),当表面H LA2I分子被阻断后,T淋巴细胞的杀伤效应几乎降至零点。

结论:转染B711后肝癌细胞高表达H LA2I分子,增强抗原提呈作用的同时又表达第二信号—共刺激分子B711,从而可诱发更强的免疫排斥反应。

关键词　肝癌细胞　B711　H LA2I　阻断　细胞毒E ffect of H LA2I on the role of B711LI Zeng2Shan,SUI Yan2Fang,YE Jing.Department o f Pathology,the Fourth Military Medical Univer sity,Xi’an 710032Abstract　Objective:S tudy the relationship of H LA2I and B711to elucidate the role of costimulatory m olecule on antigen presentation in immunological rejection.Methods:FC M was applied to detect the expression of B7111Then the cytotoxicity of P BM L was observed before and after blocking the H LA2I1R esults:The level of H LA2I expression increased greatly(P<0101)after trans fection1Als o we found that the intro2 duction of B711into HHCC cells in vitro induced a strong immunity that was ass ociated with T cells in contrast to the untrans fected cells which B711was not expressed(P<0101)1The cytotoxicity of T lymphocytes decreased nearly to zero level when H LA2I were blocked1Conclusion: The expression of B711in HHCC conduce to high level of H LA2I expression and increased effect of antigen presentation and costimulation in immunological reject reaction1K ey w ords　HCC　B711　H LA2I　Block　Cytotoxicity B711是目前研究最为广泛的共刺激分子,可介导淋巴细胞和抗原递呈细胞之间的识别作用,增强淋巴细胞的杀伤活性,在肿瘤的免疫排斥反应中起着十分重要的作用1。

本研究将共刺激分子B711的编码基因转入肝癌细胞系HHCC后,H LA2I分子对B711共刺激作用的影响,以为肝癌的免疫治疗提供一定的理论基础。

1　材料与方法111　材料　肝癌细胞系HHCC为本室保存,转染B711基因的肝癌细胞株HHCC2P B2为本室建立2,上述细胞均在含10%新生牛血清的DME M(高糖)培养基、37℃、5%C O2条件中培养。

B711单克隆抗体、FITC羊抗鼠IgGΠIgM多克隆抗体为Becton Dickins on①国家自然科学基金资助(N o.39770827)作者简介:李增山,男,28岁,博士;指导教师:隋延仿,教授,博士生导师,主要从事肝癌的分子免疫病理研究。

公司产品,H LA2I鼠抗人单克隆抗体为本校免疫学教研室提供。

乳酸脱氢酶底物混合液:514×10-2 m olΠL(+)乳酸钠,616×10-4m olΠL I NT,218×10-4 m olΠL PMS,113×10-3m olΠL NAD钠盐,012m olΠL Tris 缓冲液(pH812),使用时新鲜配制。

112　方法11211　肝癌细胞系HHCC表面H LA2I分子表达情况实验研究　取5×104癌细胞接种96孔板,并加入人γ2I NF(2000UΠml)刺激癌细胞,第48小时取样,以FC M检测γ2I NF刺激前后的细胞表面H LA2I 分子表达情况。

11212　淋巴细胞的分离培养和杀伤实验　取健康人外周血,肝素(200UΠml)抗凝,常规分离外周血淋巴细胞,在含10%新生牛血清的DME M(高糖)培养基、37℃、5%C O2条件中培养。

第2天,补充PH A (1μgΠml)、I L22(200UΠml),继续培养,第4天,再次补充PH A(1μgΠml)、I L22(200UΠml),以后隔日补充I L22(100UΠml),维持生长,第6天,将丝裂霉素灭活・664・中国免疫学杂志2001年第17卷的肿瘤细胞以1:25的比例加入淋巴细胞诱导活化,第10～12天时用于杀伤实验,同时取一部分淋巴细胞在流式细胞仪上检测细胞表面C D4、C D8分子的表达情况。

刺激诱导3周后行杀伤实验。

本研究采用乳酸脱氢酶(LDH)释放实验来评价细胞杀伤活性3。

调整靶细胞浓度至4×105ml-1,取011ml接入96孔板,调整淋巴细胞浓度以25:1的效靶比加011ml淋巴细胞于96孔板中,以同样条件分别设置靶细胞自然释放孔、效应细胞自然释放孔和K562杀伤孔,以011ml2%Triton X2100代替效应细胞为最大释放孔,每1例均做3个复孔,之后分别在培养后4h、12h、24h取培养上清,加入011ml乳酸脱氢酶底物混合液,以3min的间隔在酶联仪上读取490 nm处的吸光值,以每分钟吸光值的变化代表乳酸脱氢酶活性,并按如下公式计算杀伤率:混合淋巴细胞杀伤率(%)=(实验孔LDH活性-靶细胞自然释放孔LDH活性-效应细胞自然释放孔LDH活性)Π(最大释放孔LDH活性-靶细胞自然释放孔LDH活性);T淋巴细胞杀伤率(%)=(实验孔LDH活性-靶细胞自然释放孔LDH活性-效应细胞自然释放孔LDH活性-K562杀伤孔LDH活性)Π(最大释放孔LDH活性-靶细胞自然释放孔LDH活性)。

11213　H LA2I抗体阻断实验　靶细胞中加入的H LA2I抗体以阻断细胞表面的H LA2I分子,具体阻断步骤如下:调整细胞浓度至8×105ml-1,取0105 ml接入96孔板,加入10μg抗体,充分混匀,37℃, 5%C O2条件下培养2～4h,不弃培养液,调整淋巴细胞浓度后以25:1的效靶比加0105ml淋巴细胞于96孔板中然后进行杀伤实验,方法同前。

11214　统计学处理　采用U检验、t检验等方法对所得资料进行统计学检验,以SSPS统计学软件处理。

2　结果211　流式细胞仪检测H LA2I分子表达情况　由表1可知,γ2I NF刺激前后,肝癌细胞表面H LA2I分子的表达情况无改变(P>0105),而转染B711后肝癌细胞表面H LA2I分子的表达明显增加(P<0101)。

212　外周血混合淋巴细胞杀伤实验　在利用外周血混合淋巴细胞进行杀伤实验时,以同等条件设置K562细胞杀伤组,在计算杀伤率时,将杀伤K562细胞的NK活性予以去除。

在靶细胞4×105ml-1的浓度和效靶比为25:1的条件下,靶细胞和效应细胞自然释放的LDH活性均低于0102min-1,最大释放为1171±0116min-1。

213　HHCC2P B2诱发的免疫排斥反应　如图1示,在4h时,HHCC2P B2的杀伤率同HHCC的杀伤率几乎无差别(P>0105),在12h时,混合淋巴细胞杀伤率达6311%,去除NK活性后亦可达4819%,均高于相应的HHCC的杀伤率(P<0105),在24h时,针对HHCC2P B2的杀伤活性几乎全部来自T淋巴细胞,且明显高于HHCC(P<0101)。

214　H LA2I抗体阻断对杀伤效果的影响　利用H LA2I抗体将细胞表面H LA2I分子阻断,然后进行杀伤实验。

结果如图2示,HHCC2P B2表面的H LA2I 分子被阻断后,杀伤率明显下降,T淋巴细胞杀伤率在阻断后几乎接近零点。

图1　淋巴细胞对HH CC2PB2和HH CC的杀伤结果Fig.1　Cytotoxicity of lymphocyte against HH CC2PB2and HHCC图2　淋巴细胞对阻断HH CC2PB2细胞表面H LA2I分子前后的杀伤结果Fig.2　Analysis of cytotoxicity against HH CC2PB2before and after blocking H LA21moleculer・764・李增山等　H LA2I分子对B711共刺激作用的影响　第9期表1　流式细胞仪检测HH CC 细胞表面H A L 2I 分子表达情况T ab.1　F low cytometric analysis of H LA 2I expression on HH 2CC cellsHHCCHHCC 2P B2PBefore stimulation with γ2INF 79109719<0101A fter stimulation with γ2INF6819——————P>0105——————N ote :S tatistical analysis was ,performed using U test.3　讨论肝癌细胞在引发免疫排斥反应的过程中存在着许多自身的缺陷,不能够有效的被机体的免疫系统所排斥,如何增强肝癌细胞诱导免疫排斥的效应是肝癌免疫排斥或基因治疗实施的一个重要基础。