Trizol提取RNA的protocol

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Trizol_法提取细菌RNA的实验步骤

Trizol 法提取RNA实验步骤需要的试剂：氯仿异丙醇75%乙醇（in DEPC-treated water)RNase free水或者0.5% SDS溶液[准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC是为了减少RNase 的降解) to 0.01% (v/v)。

静置过夜，然后高压灭菌。

0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]1、组织匀浆(1) 取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。

(2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。

(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。

2、相分离加入0.2 ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离心12,000× g，15 minutes ，2 - 8°C。

离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。

RNA 只存在于水相中。

水相占总TRIZOL的60%。

3、RNA沉淀将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离心12,000 rpm ，10 minutes，2 - 8°C。

离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。

4、RNA洗涤去上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500 × g ，5 minutes，2 -8°C。

5、RNA再溶解去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。

注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。

总RNA的提取(Trizol法提取)

总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。

若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。

在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-free water溶解RNA沉淀。

PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq TM，TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。

TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。

TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。

Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。

trizol提取rna的原理

trizol提取rna的原理Trizol提取RNA的原理RNA是生物体内的重要分子之一，可以传递遗传信息、参与蛋白质合成等生命活动。

因此，RNA的提取对于生物学研究具有重要意义。

Trizol是一种常用的RNA提取试剂，本文将介绍Trizol提取RNA 的原理。

Trizol是由酚和胍组成的一种试剂，能够同时提取RNA、DNA和蛋白质。

其基本原理是利用酚的特殊溶解性质，使RNA在酚相中分离出来。

具体步骤如下：1. 细胞破碎需要将待提取RNA的样品（如细胞、组织等）用Trizol等试剂破碎。

这一步的目的是打破细胞壁和细胞膜，使RNA暴露在外。

Trizol中的胍可以去除RNA分子上的蛋白质质量，避免RNA被蛋白质干扰。

2. 分离RNA将样品中的RNA与Trizol中的酚混合，使RNA分子在酚相中溶解。

酚可将RNA分子周围的水分子脱水，从而使RNA分子聚集在一起。

此时，RNA分子会与DNA和蛋白质分子分别在不同的液相中。

3. 沉淀RNA为了分离RNA纯化，需要将RNA从酚相中沉淀出来。

这一步需要加入异丙醇，异丙醇能够将RNA分子从酚相中析出。

异丙醇浓度越高，RNA得到沉淀的几率越大。

4. 洗涤RNA将RNA沉淀后，需要用75%的酒精洗涤，去除异丙醇等离子体残留。

此外，需要加入DEPC处理的水来去除RNase（核酸酶）等污染物，保证RNA的完整性和纯度。

5. 溶解RNA将RNA沉淀物用TE缓冲液等稳定性较好的溶液进行溶解，即可得到高质量的RNA样品，用于后续实验。

总的来说，Trizol提取RNA的原理是通过酚和胍的组合，将RNA 分子从其他分子中分离出来。

该方法具有操作简单、高提取率、可同时提取DNA和蛋白质等优点。

但也存在一些局限性，如RNA完整性不能完全保证、RNA含量较低时易出现污染等。

因此，在具体实验中需要结合实际情况选择合适的RNA提取方法。

PCR全过程Protocol

总RNA提取1．十二孔板培养细胞，每孔加入1ml Trizol 反复吸吹（无泡沫），冰浴下静置20min，转移至1.5mlEP管中。

2．加入0.2ml氯仿，用手震荡15sec×6，混匀后静置2min3．4℃12000转离心15min。

混合液分三层。

4. 小心吸取最上层无色水相于干净EP管中，按每ml Ttizol加入0.5ml异丙醇，-20℃孵育2小时（或过夜）。

5. 4℃12000转离心10min弃上清，按每ml Trizol加入1ml75%乙醇（无RNA酶，用depc水）轻微混匀。

6. 4℃7500转离心5min弃上清，室温下适度吹干。

7. 加入0.1%DEPC（超纯水）水（20ul）30-50ul溶解RNA。

55-60℃孵育5min分装后在-80℃保存。

纯度鉴定取2ulRNA加DEPC水198ul，即稀释100倍，吸取100ul至紫外板，酶标仪260nm和280nm下测定吸光度。

（1.8-2.0）完整性鉴定1.制胶：在烧杯中放入0.3g琼脂糖，加入15ml 0.5×TBE工作液，摇匀后放入微波炉加热溶解，室温放至60℃（手背无烫感），倒入托盘中。

2.加入4.5ul（0.3ul/ml ）ultrapower TM染料，充分混匀。

3.迅速倒入电泳槽中。

（琼脂糖凝胶需要冷却，凝固60min以上）4.凝胶完全凝固后，小心移走梳子，将凝胶放入电泳槽，加样孔放入靠近负极一侧。

5.加入能没过胶面2-5mm深的电泳缓冲液。

6.RNA样品，6*buffer按照5：1混匀后，用微量移液枪加样（加样10ul）。

7.盖上电泳槽并通电，电压设置100V。

8.电泳完毕，切断电源，取出凝胶于紫外下观测并拍照。

逆转录1．热变性RNase Free H2O (11-a)ul a（体积）=（RNA总量（1微克）/RNA浓度）Random Primer (25pmol/ul) 1ulTotal RNA(1ug以下) aul （根据总RNA的浓度决定此体积）总体积：12ul65°C，5min后，立即置于冰上（冰浴5min）。

trizol组织提取rna步骤

trizol组织提取rna步骤Trizol组织提取RNA步骤引言：RNA是一种重要的生物大分子，它在生物体内起着基因表达和调控的重要作用。

为了研究RNA的结构和功能，科学家们经过不断的探索和研究，发展出了一系列有效的RNA提取方法。

其中，Trizol 组织提取RNA方法是目前应用较广泛的一种方法，本文将详细介绍Trizol组织提取RNA的步骤。

步骤一：样品准备需要准备好待提取RNA的组织样品。

样品可以是动植物组织，也可以是细胞。

样品应该新鲜、完整，并且需要在提取RNA前保存在液氮中，以保持RNA的完整性。

步骤二：组织破碎将样品从液氮中取出，放入细胞破碎液中。

细胞破碎液可以是Trizol试剂，也可以是其他适用的细胞破碎液。

然后，使用离心机将样品离心，以破碎组织细胞，并释放RNA。

步骤三：加入氯仿将破碎的组织样品转移到离心管中，加入适量的氯仿。

氯仿可以与Trizol试剂中的异丙醇和酚形成两相体系，用于分离RNA。

步骤四：离心分离将离心管盖紧，并放入离心机中进行高速离心。

离心的目的是将样品中的RNA分离到上清液中，底物中会残留DNA和蛋白质。

步骤五：收集上清液将离心管从离心机中取出，小心地将上清液转移到一个新的离心管中。

上清液中含有RNA，可以继续进行后续的提取。

步骤六：沉淀RNA向上清液中加入等体积的异丙醇，使其浓度达到70%。

然后，轻轻地摇晃离心管，使RNA与异丙醇充分混合。

接下来，将混合液放置在-20°C的冰箱中，使RNA沉淀。

步骤七：离心沉淀将离心管放入高速离心机中，进行高速离心。

离心的目的是使RNA 沉淀到离心管底部。

步骤八：去除上清液小心地将上清液倒出，注意不要损坏沉淀的RNA。

可以使用70%乙醇进行洗涤，以去除残留的盐和污染物。

步骤九：干燥RNA将离心管中的RNA沉淀放置在室温下，使其自然干燥。

注意不要过度干燥，以免影响RNA的质量。

步骤十：溶解RNA在干燥的RNA沉淀中加入适量的去离子水或RNase-free水，轻轻摇晃或振荡离心管，使RNA溶解。

RNA提取protocol

TRIzol 提取RNA实验试剂：TRIzol、氯仿、异丙醇、75%酒精、DEPC水实验用具：4℃离心机，1mL、200uL、100uL移液器，1.5mL、200uL EP管，一次性手套、口罩等操作步骤1. 样品处理取新鲜或-70℃冻存小鼠视网膜尽量剪碎，每50-100 mg组织加入1 ml TRIzol，匀浆仪进行匀浆处理。

（可先加200uLTRIzol直接用移液枪打碎视网膜，再加TRIzol至1mL）可选步骤：当样品富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例如肌肉，脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。

匀浆化后在2~8°C的条件下以12,000×g的离心力离心10分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，而RNA存在于上清中。

对于脂肪组织的样品中，大量的脂肪漂在最上层也应该除掉。

吸取上清备用。

2. 将匀浆样品反复吹打几次，在室温条件下静置5min，使蛋白核酸复合物完全分离。

3. 向以上溶液中加入氯仿，每使用1ml TRIzon加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2-3min。

4. 4℃12,000 rpm离心15分钟，此时样品分成三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在水相中，把水相（约600μl）转移到一个新的离心管（自备）中。

5. 在得到的水相溶液中加入0.5mL异丙醇（每使用1mLTRIzol加入0.5mL异丙醇），颠倒混匀，室温放置10分钟。

6. 4℃ 12,000 rpm离心10分钟，弃上清。

7. 加入75%乙醇（用无RNase的水配制）洗涤沉淀。

每使用1 ml TRIzol用1 ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤一次。

8. 4℃7500rpm离心5分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃RNA沉淀。

9. 室温放置5分钟，晾干。

加入30-100 μl无RNase的水，充分溶解RNA（可55~60℃溶解10min），得到的RNA分装于200uL EP管中（每管10uL）。

Trizol法提取总RNA Protocol

Trizol法提取总RNATrizol法是一种常用的RNA提取方法，其原理是基于氯仿-异硫氰酸胍的试剂，能够迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。

通过将样品与Trizol试剂混合，可以裂解细胞并释放出RNA。

然后加入氯仿进一步抽提RNA，并通过离心分离出上清液中的RNA。

最后通过乙醇沉淀和洗涤得到纯化的RNA。

所需试剂和耗材1.Trizol试剂：用于细胞裂解和RNA的释放。

2.氯仿：用于抽提RNA。

3.无水乙醇：用于洗涤沉淀的RNA。

4.DEPC水：用于制备无RNA酶的水。

5.1.5ml Eppendorf管：用于RNA的存储。

6.Tips：用于吸取无RNA酶的水和Trizol试剂。

实验仪器1.台式高速离心机：用于离心分离RNA。

2.涡旋振荡器：用于混合样品和试剂。

3.移液器：用于吸取试剂和样品。

4.无菌微量离心管：用于样品和试剂的存储。

5.无菌手套：用于防止RNA酶的污染。

准备工作1.在实验前需要将实验区域和所有实验用具进行清洁和消毒，以避免RNA酶的污染。

2.使用Trizol试剂前需仔细阅读说明书，并确保按照说明书的要求进行操作。

3.为避免RNA酶的污染，需要穿戴无菌手套进行实验操作。

实验方法1.准备无菌的DEPC水，加入DEPC水至10ml，然后加入10μl的氯仿，充分混匀后放置备用。

2.在无菌的1.5ml Eppendorf管中加入100μl的Trizol试剂，加入10μl的氯仿，充分混匀后加入步骤1中制备好的DEPC水-氯仿混合液100μl，再次充分混匀后放置备用。

3.将样品加入到步骤2中制备好的溶液中，充分混匀后加入氯仿，再次充分混匀后进行高速离心，分离出上清液。

4.将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的无水乙醇，充分混匀后进行高速离心，收集沉淀的RNA。

5.用70%乙醇洗涤沉淀的RNA，去除残留的乙醇和盐类，最后将RNA沉淀干燥后重新溶解在水中或指定的缓冲液中。

注意事项1.在加入氯仿之前，不要洗涤细胞，以免降解mRNA。

trizol提取rna的原理

trizol提取rna的原理
Trizol提取RNA的原理
Trizol是一种用于提取RNA的试剂，其原理基于酚-氯仿法。

该方法通过将细胞或组织样品与Trizol试剂混合，使细胞膜破裂，细胞核释放出来，RNA与DNA等核酸被溶解在Trizol试剂中。

接着，加入氯仿进行相分离，使RNA在上清液中，DNA在有机相中，蛋白质在界面形成沉淀，从而实现RNA的提取。

Trizol试剂中的酚会破坏细胞膜，使RNA与DNA等核酸被释放出来。

酚具有疏水性，可以与细胞膜疏水区域相互作用，破坏细胞膜完整性，从而释放内部的核酸。

酚的存在还有助于保护RNA不受核酸酶的降解。

添加氯仿后，形成两相体系。

RNA在上清液中，DNA在有机相中。

通过离心分离，可以将RNA从上清液中提取出来。

氯仿对RNA有很强的萃取能力，可以有效地将RNA从混合体系中分离出来。

加入异丙醇沉淀RNA。

异丙醇可以改变RNA的溶解性，使RNA沉淀下来。

此时，RNA呈现出丝状状况，可以通过离心将RNA沉淀物收集起来。

最终，通过洗涤和溶解步骤，可以得到高质量的RNA。

总的来说，Trizol提取RNA的原理是通过酚破坏细胞膜，释放核酸；氯仿相分离，将RNA与DNA分离；异丙醇沉淀RNA，最终得到纯净的RNA。

这种方法简单、快速，适用于各种类型的样品，是一种
常用的RNA提取方法。

通过了解Trizol提取RNA的原理，可以更好地操作和优化RNA提取的实验过程，确保得到高质量的RNA样品。

RNA提取protocol-我用的

组织：将组织放入破碎管中，加入1ml Trizol，在破碎机上打碎；
细胞：向细胞培养板上加入1ml Trizol，震荡后收集入管内。

1.加入氯仿（三氯甲烷），200ul/1ml Trizol为宜，握拳轻柔上下颠倒30s，冰上静置5min，此时可开始预冷离心机到4℃。

（注意：氯仿应保存在通风橱内，注意避光）
2. 4℃，12000rpm离心15min，取上清液至1.5ml管内。

（注意：保证不吸到中间蛋白质层）
3.向管内加入500ul异丙醇，轻柔混匀，放入-20℃（或-40℃）环境保持30min。

4. 4℃，12000rpm离心15min。

5.弃去上清，用700ul 70%乙醇洗涤沉淀，震荡，让RNA沉淀飘于乙醇中。

（注意：70%乙醇最好现用现配）。

可用500ul 100%乙醇再洗涤一次，一般不用。

6. 4℃，7500rpm离心5min，轻轻倒去上清液，再次离心1min，用10ul的移液器洗去残留的液体，开盖在通风橱中晾干，以沉淀边缘变透明为宜。

（注意：不宜过分晾干，否则溶解较难）
7.用适量DEPC水溶解沉淀（注意：一般为30ul）。

8.测浓度，若浓度过高则加水稀释，以见到完整峰形为宜。

9.保存：-80℃冰箱。

尿液RNA提取protocol

尿液总RNA抽提步骤（Qiagen试剂盒）
建议每次提取200微升体积
1.添加5倍体积的Trizol（1ml）到200微升样本中，Vortex混匀。

2.室温放置5min
3.添加3.5微升Spike-in control（1.6×108）到体系中，混匀
4.添加和样本体积等量的氯仿（200氯仿）。

Vortex混匀。

5.室温放置2-3min
6.12000转，4°离心15min，放置至室温
7.转移上层水相到新的EP管中，添加1.5倍体积的100%乙醇（约900微升），颠倒混匀。

不要离心，及时进行下一步。

8.吸取700微升样本，包括可能形成的沉淀，到柱中（2ml收集管）。

盖盖室温离心15s，
10000转。

弃去液体。

9.将剩余的样本重复步骤8，弃去液体。

10.添加700微升RWT buffer到柱上，盖盖室温离心15s，≥10000转。

弃去液体。

11.添加500微升RPE buffer到柱上，盖盖室温离心15s，≥10000转。

弃去液体。

12.添加500微升的80%的乙醇到柱上，盖盖室温离心2min，≥10000转。

弃去液体连同
收集管。

13.小心将柱置于新的2ml收集管中，打开柱盖，全速离心5min以dry柱膜，弃去液体连
同收集管。

14.将柱置于新的1.5ml离心管中，添加14微升（不得低于10微升）的RNase-free water
到柱中，轻轻盖上盖子，全速离心1min以溶解RNA。

RNA提取-逆转录-protocol

Protocol(2007-1-4 版)1.准备工作：检查提RNA专用的枪头，EP管，以及PBS，Trizol，氯仿，酚氯仿，异丙醇，75%乙醇，DEPC水。

2.从4℃取出Trizol恢复室温，预冷离心机到4℃。

3.用室温的PBS把细胞洗一次，加入1ml Trizol裂解细胞，静置5分钟，反复吹打10次，收集到EP管内。

可储存到-80℃一个月（解冻时需要离心）。

4.向Trizol裂解液内加入200ul氯仿，上下用力颠倒混匀半分钟，静置3分钟。

5.4℃离心，12000rcf,15分钟，此时可见细胞裂解液分三层：上层为水相的RNA；中层为DNA,脂类等；下层为细胞残渣，蛋白，多糖等。

6.转移上层的水相到新的EP管内，150ul吸三次，共450ul。

7.补充200ul的DEPC水，总体积即为650ul。

加入等体积的酚氯仿，混匀，静置3分钟后，4℃离心，12000rcf,15分钟。

8.取上清500ul到新的EP管内，167ul吸三次。

加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟后，4℃离心，12000rcf,10分钟。

9.小心去掉上清，注意不要丢失RNA沉淀。

加入1ml 75%乙醇, 上下颠倒，使沉淀块重悬起。

加75%乙醇后可储存于4℃一周，或-20℃一年。

10.4℃离心，12000rcf,10分钟。

小心去掉上清，尽量吸干管壁的液体，注意不要丢失RNA沉淀，若沉淀松动可再次离心。

晾干约15分钟，至管壁无液体。

11.加入适量体积（20-30ul）的DEPC水溶解RNA，58℃水浴10分钟。

12.取出2 ul定量。

测量buffer: 10mM TrisCl(pH7.8)。

根据定量结果进行逆转录。

RNA抽提指南(TRIZOL)

RNA抽提指南(TRIZOL)警告:有毒物接触皮肤或者不慎吞服。

会导致灼伤。

一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。

若感不适，看医生并寻求苯酚和其他成分（NJTSRN 80100437-5000p)的正确治疗方案。

TRIZOL在室温下能稳定保存12个月。

尽管如此，为达到最佳效果，我们建议保存在2—8°C的环境下。

一般描述：TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。

它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。

加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。

RNA 存在于水样层中。

收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。

乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

无论是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。

TRIZOL 试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。

所有的操作可以在一小时内完成。

TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。

故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。

如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总RNA。

TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。

例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb 和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb 之间 (tRNA, 5S)。

trizol法提取rna步骤

trizol法提取rna步骤TRIzol法提取RNA步骤RNA是一种重要的生物大分子，具有多种功能。

在研究生物学、医学等领域中，需要从细胞或组织中提取RNA。

TRIzol法是一种常用的RNA提取方法，其原理是利用TRIzol试剂将细胞或组织中的RNA溶解，并与其他生物大分子分离。

本文将详细介绍TRIzol法提取RNA 的步骤。

材料准备- TRIzol试剂- 高纯度异丙醇- DEPC水- RNase-free微量离心管和移液器- 1.5 mL离心管- 无菌手套和口罩- 冰桶和冰块步骤一：样品采集首先需要采集样品，可以是细胞或组织。

对于细胞，可以使用离心机将其沉淀；对于组织，则需要切碎并加入适当量的PBS缓冲液。

步骤二：样品裂解将采集到的样品加入适量的TRIzol试剂，并使用移液器充分混合。

然后使用高速离心机将样品离心10分钟，使其裂解。

步骤三：RNA分离将上述裂解物转移至新的离心管中，并加入等体积的异丙醇。

充分混合后，使用高速离心机离心10分钟，使RNA沉淀到底部。

步骤四：RNA洗涤将上述沉淀物转移至新的离心管中，并加入75%的乙醇。

充分混合后，使用高速离心机离心5分钟，去除残留的TRIzol试剂和异丙醇。

步骤五：RNA溶解将上述沉淀物转移至新的离心管中，并加入适量的DEPC水。

充分混合后，在65℃下孵育10分钟，使RNA完全溶解。

步骤六：RNA保存将溶解后的RNA转移至RNase-free微量离心管中，并存放在-80℃冰箱中保存。

注意事项- 在操作过程中要穿戴无菌手套和口罩，以避免污染。

- TRIzol试剂具有强烈腐蚀性，需注意安全操作。

- 所有使用到的器材和试剂都要事先消毒处理。

- 操作过程中需保持低温环境，以避免RNA降解。

- RNA提取后需立即存放在-80℃冰箱中，以避免RNA降解。

trizol RNA提取protocol

TRIzol ® ReagentCatalog NumbersQuantityStore at 2°C to 25°C15596-026 100 mL 15596-018200 mLDescriptionTRIzol ® Reagent is a ready-to-use reagent, designed to isolate high quality total RNA (as well as DNA and proteins) from cell and tissue samples of human, animal, plant, yeast, or bacterial origin, within one hour. TRIzol ® Reagent is a monophasic solution of phenol, guanidine isothiocyanate, and other proprietary components which facilitate the isolation of a variety of RNA species of large or small molecular size. TRIzol ® Reagent maintains the integrity of the RNA due to highly effective inhibition of RNase activity while disrupting cells and dissolving cell components during sample homogenization. TRIzol ® Reagent allows forsimultaneous processing of a large number of samples, and is an improvement to the single-step RNA isolation method developed by Chomcynski and Sacchi (Chomczynski & Sacchi, 1987).TRIzol ® Reagent allows the user to perform sequential precipitation of RNA, DNA, and proteins from a single sample(Chomczynski, 1993). After homogenizing the sample with TRIzol ® Reagent, chloroform is added, and the homogenate is allowed to separate into a clear upper aqueous layer (containing RNA), an interphase, and a red lower organic layer (containing the DNA and proteins). RNA is precipitated from the aqueous layer with isopropanol. DNA is precipitated from the interphase/organic layer with ethanol. Protein is precipitated from the phenol-ethanol supernatant by isopropanol precipitation. The precipitated RNA, DNA, or protein is washed to remove impurities, and then resuspended for use in downstream applications. • Isolated RNA can be used in RT-PCR, Northern Blot analysis, Dot Blot hybridization, poly(A)+ selection, in vitro translation, RNase protection assay, and molecular cloning.• Isolated DNA can be used in PCR, Restriction Enzyme digestion, and Southern Blots.•Isolated protein can be used for Western Blots, recovery of some enzymatic activity, and some immunoprecipitation.CautionTRIzol ® Reagent contains phenol (toxic and corrosive) and guanidine isothiocyanate (an irritant), and may be a health hazard if not handled properly. Always work with TRIzol ® Reagent in a fume hood, and always wear a lab coat, gloves and safety glasses. Contact your Environmental Heath and Safety (EH&S) department for proper work and disposal guidelines. Avoid direct contact with TRIzol ® Reagent, because contact to skin, eyes, or respiratory tract may cause chemical burns to the exposed area. If contact to skin or eyes occurs , immediately wash the exposed area with copious amounts of water for 15 minutes and seek medicalattention if necessary. If you inhale vapors, move to fresh air and seek medical attention if necessary. For more information, refer to the TRIzol ® Reagent SDS (Safety Data Sheet), available from our web site at /support .Contents and StorageTRIzol ® Reagent is supplied in 100 mL (Cat. no. 15596-026) or 200 mL (Cat. no. 15596-018) volumes, and shipped at roomtemperature. Upon receipt, store TRIzol ® Reagent at room temperature. TRIzol ® Reagent is stable for 12 months when properly stored.Intended UseFor research use only. Not intended for human or animal diagnostic or therapeutic uses.Materials NeededThe following additional materials are needed, but not supplied for the isolation of RNA, DNA or proteins.Part no. 15596026.PPS MAN0001271Rev. Date: 13 Dec 2012For support, visit /support or email techsupport@ . To reorder, visit Learn MoreBuy NowBuy NowPreparing SamplesHomogenizing samples1. Determine your sample type, and perform homogenizationat room temperature according to the table below. The sample volume should not exceed 10% of the volume of TRIzol ® Reagent used for homogenization. Be sure to use the indicated amount of TRIzol ® Reagent, because an insufficient volume can result in DNA contamination of isolated RNA.2. (Optional) When preparing samples with high content offat, proteins, polysaccharides, or extracellular material (e.g., muscle, fat tissue, or tuberous plant material), an additional isolation step may be required to remove insoluble material from the samples.Note : Do not perform this additional isolation step if you are performing subsequent DNA isolation on your sample.3. Proceed to Phase separation , or store the homogenizedsample. Homogenized samples can be stored at roomtemperature for several hours, or at –60 to –70°C for at least one month.Phase separation1. Incubate the homogenized sample (see Homogenizingsamples ) for 5 minutes at room temperature to permit complete dissociation of the nucleoprotein complex . 2. Add 0.2 mL of chloroform per 1 mL of TRIzol ® Reagentused for homogenization. Cap the tube securely. 3. Shake tube vigorously by hand for 15 seconds. 4. Incubate for 2–3 minutes at room temperature.5. Centrifuge the sample at 12,000 × g for 15 minutes at 4°C.Note : The mixture separates into a lower red phenol-chloroform phase, an interphase, and a colorless upper aqueous phase. RNA remains exclusively in the aqueous phase. The upper aqueous phase is ~50% of the total volume. 6. Remove the aqueous phase of the sample by angling thetube at 45° and pipetting the solution out. Avoid drawing any of the interphase or organic layer into the pipette when removing the aqueous phase.7. Place the aqueous phase into a new tube and proceed tothe RNA Isolation Procedure .8. Save the interphase and organic phenol-chloroform phaseif isolation of DNA or protein is desired. See DNAIsolation Procedure and Protein Isolation Procedure for details. The organic phase can be stored at 4°C overnight.RNA Isolation ProcedureAlways use the appropriate precautions to avoid RNase contamination when preparing and handling RNA.RNA precipitation1. (Optional) When precipitating RNA from small samplequantities (<106 cells or <10 mg tissue), a dd 5–10 µg of RNase-free glycogen as a carrier to the aqueous phase. Note : Glycogen is co-precipitated with the RNA, but does not inhibit first-strand synthesis at concentrations ≤4 mg/mL, and does not inhibit PCR.2. Add 0.5 mL of 100% isopropanol to the aqueous phase, per1 mL of TRIzol ® Reagent used for homogenization. 3. Incubate at room temperature for 10 minutes. 4. Centrifuge at 12,000 × g for 10 minutes at 4°C.Note: The RNA is often invisible prior to centrifugation, and forms a gel-like pellet on the side and bottom of the tube.5. Proceed to RNA wash .RNA wash1. Remove the supernatant from the tube, leaving only theRNA pellet.2. Wash the pellet, with 1 mL of 75% ethanol per 1 mL ofTRIzol ® Reagent used in the initial homogenization.Note : The RNA can be stored in 75% ethanol at least 1 year at –20°C, or at least 1 week at 4°C.3. Vortex the sample briefly, then centrifuge the tube at7500 × g for 5 minutes at 4°C. Discard the wash.4. Vacuum or air dry the RNA pellet for 5–10 minutes. Do notdry the pellet by vacuum centrifuge.Note: Do not allow the RNA to dry completely, because the pellet can lose solubility. Partially dissolved RNA samples have an A 260/280 ratio <1.6. 5. Proceed to RNA resuspension .RNA resuspension1.Resuspend the RNA pellet in RNase-free water or0.5% SDS solution (20–50 μL) by passing the solution upand down several times through a pipette tip.Note: Do not dissolve the RNA in 0.5% SDS if it is to beused in subsequent enzymatic reactions.2.Incubate in a water bath or heat block set at 55–60°C for10–15 minutes.3.Proceed to downstream application, or store at –70°C. DNA Isolation ProcedureDNA is isolated from the interphase and phenol-chloroform layer saved from the Phase separation step.DNA precipitation1.Remove any remaining aqueous phase overlying theinterphase. This is critical for the quality of the isolatedDNA.2.Add 0.3 mL of 100% ethanol per of 1 mL TRIzol® Reagentused for the initial homogenization.3.Cap the tube and invert the sample several times to mix.4.Incubate samples for 2–3 minutes at room temperature.5.Centrifuge the tube at 2000 × g for 5 minutes at 4°C topellet the DNA.6.Remove the phenol-ethanol supernatant and save it in anew tube if protein isolation is desired. The supernatantcan be stored at –70°C for several months.7.Proceed with the DNA wash step using the DNA pellet. DNA wash1.Wash the DNA pellet with 1 mL of sodium citrate/ ethanolsolution (0.1 M sodium citrate in 10% ethanol, pH 8.5) per1 mL of TRIzol® Reagent used for the initialhomogenization.2.Incubate for 30 minutes at room temperature. Mixoccasionally by gentle inversion.Note: The DNA can be stored in sodium citrate/ethanolsolution at least 2 hours.3.Centrifuge at 2000 × g for 5 minutes at 4°C. Remove anddiscard supernatant.4.Repeat wash (steps 1–3), once.Note: Repeat wash twice for large DNA pellets (>200 µg).5.Add 1.5–2 mL 75% ethanol per 1 mL of TRIzol® Reagentused for the initial homogenization.Note: DNA samples may be stored in 75% ethanol at 4°Cfor several months.6.Incubate for 10–20 minutes at room temperature. Mix thetube occasionally by gentle inversion.7.Centrifuge at 2000 × g for 5 minutes at 4°C. Remove anddiscard supernatant.8.Air or vacuum dry the DNA pellet for 5–10 minutes. Donot allow the pellet to dry out. Do not dry the pellet byvacuum centrifuge.9.Proceed to the DNA resuspension step.DNA resuspensionResuspend the DNA in 8mM NaOH at a concentration of0.2–0.3 µg/µL.1.Add 0.3–0.6 mL of 8mM NaOH per 50–70 mg of tissue,or per 1 × 107 cells.Note: Resuspending the DNA is a mild base is highlyrecommended because isolated DNA does notresuspend well in water or Tris buffer.2.Remove any insoluble material by centrifuging thesample at 12,000 × g for 10 minutes at 4°C.3.Transfer the supernatant containing the DNA to a newtube. Adjust pH as needed with HEPES and proceed to downstream application of choice. The DNA can bestored overnight at 4°C, but for long-term storage adjust to pH 7–8 with HEPES, and add 1 mM EDTA. Store at4°C or –20°C.Determining Yield of RNA and DNAUse absorbance of RNA and DNA at 260 nm and 280 nm to determine concentration.Expected yieldsThe table below presents typical yields of RNA (A260/280 of>1.8) and DNA (A260/280 of 1.6–1.8) from various starting materials.Protein Isolation ProcedureProteins are isolated from the phenol-ethanol supernatant layer left over after the DNA precipitation step. Isolate the protein using either Protein precipitation OR Protein dialysis. Protein precipitation1.Add 1.5 mL of isopropanol to the phenol-ethanolsupernatant per of 1 mL TRIzol® Reagent used for theinitial homogenization.2.Incubate samples for 10 minutes at room temperature.3.Centrifuge at 12,000 × g for 10 minutes at 4°C to pellet theprotein. Remove and discard the supernatant.4.Proceed to the Protein wash step with the remainingprotein pellet.Protein wash1.Prepare a wash solution consisting of 0.3 M guanidinehydrochloride in 95% ethanol.2.Wash the protein pellet with 2 mL of the wash solution per1 mL of TRIzol® Reagent used for the initial homogenization.3.Incubate for 20 minutes at room temperature.Note: Protein samples may be stored in 0.3 M guanidinehydrochloride-95% ethanol for at least one month at 4°C orfor at least one year at –20°C.4.Centrifuge at 7500 × g for 5 minutes at 4°C. Remove anddiscard the wash solution.5.Repeat steps 2–4, two more times.6.Add 2 mL of 100% ethanol to protein pellet after the thirdwash and vortex.7.Incubate for 20 minutes at room temperature.8.Centrifuge at 7500 × g for 5 minutes at 4°C. Remove anddiscard ethanol wash.9.Air dry the protein pellet for 5–10 minutes. Do not allow thepellet to dry out.10.Proceed to the Protein resuspension step.Protein resuspension1.Add 1% SDS to the protein pellet (200 μL) and pipet up anddown until the protein is resuspend.Note: To completely dissolve the protein pellet, you may need to incubate the sample at 50°C in a water bath or heat block.2.Centrifuge at 10,000 × g for 10 minutes at 4°C to sediment anyinsoluble material.3.Transfer the supernatant containing the protein to a new tubeand proceed to downstream application of choice, or store the sample at –20°C. Protein resuspension, continuedPoor solubility of the pellet in SDS can occur, because the solubilityof specific classes of proteins differs with different solvents. If the protein pellet is insoluble in SDS, the following alternative solvents(Hummon et. al., 2007) may be required to solubilize the pellet: •1% SDS and 62.5 mM sarkosyl at pH 8.0–8.8•9.5 M urea and 2% CHAPS, pH 9.1•250mM glycerol, 10mM TEA, and 4% CHAPS•2% diethylamine•10M UreaProtein dialysis1.Load the phenol-ethanol supernatant into the dialysismembrane.Note: The phenol-ethanol solution can dissolve some types ofdialysis membranes (e.g., cellulose ester). Test dialysis tubingwith the membrane to assess compatibility before starting.2.Dialyze the sample against 3 changes of 0.1% SDS at 4°C. Makethe first change of solution after 16 hours, the second change4 hours later (at 20 hours), and the final change 2 hours later (at22 hours).Note: 0.1% SDS is required to resolubilize the proteins from the pellet; a lower concentration of SDS is insufficient. If desired,the SDS can be diluted after solubilization.3.Centrifuge the dialysate at 10,000 × g for 10 minutes at 4°C.Proteins are located in the clear supernatant.4.Transfer supernatant to a new tube and proceed to downstreamapplication, or store the sample at –20°C.5.(Optional) Solubilize the pellet by adding 100 μL of 1% SDS and100 μL of 8 M urea.Determining Yield of ProteinMeasure protein concentration by Bradford assay (SDSconcentration must be <0.1%).TroubleshootingReferences:Chomczynski, P. (1993) A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques 15, 532-537Chomczynski, P., and Sacchi, N. (1987) Single Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159Hummon, A. B., Lim S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. (2007) Isolation and solubilization of proteins after TRIzol® extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage.BioTechniques 42, 467-472Limited Use Label License No. 358: Research Use Only: The purchase of this product conveys to the purchaser the limited, non-transferable right to use the purchased amount of the product only to perform internal research for the sole benefit of the purchaser. No right to resell this product or any of its components is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. This product is for internal research purposes only and is not for use in commercial services of any kind, including, without limitation, reporting the results of purchaser’s activities for a fee or other form of consideration. For information on obtaining additional rights, please contact outlicensing@ or Out Licensing, Life Technologies, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 92008.©2010 Life Technologies Corporation. All rights reserved. The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation or their respective owners.TRIzol® is a registered trademark of Molecular Research Center, Inc.。

trizol提取rna的原理

trizol提取rna的原理
Trizol是一种广泛应用于RNA提取的试剂，其原理基于离心分离和有机相分离。

RNA在细胞中通常与蛋白质和DNA结合，因此需要使用
化学试剂将其从其他分子中分离出来。

Trizol中含有一种称为guanidine thiocyanate的物质，它能够破坏
细胞膜、溶解细胞核和细胞质，并且可以使RNA保持完整性。

同时，Trizol中还含有酚和氯仿等有机溶剂，这些溶剂能够与RNA结合形成一个稳定的复合物，并与其他杂质分子分离开来。

RNA提取过程中，首先将组织样本或培养细胞加入到Trizol试剂中，并迅速混匀。

此时，guanidine thiocyanate会立即破坏细胞膜并释
放出RNA。

接着加入氯仿，并在高速离心下使得混合液分为两相：上层为无色透明的水相，下层为深黄色的有机相。

RNA会在两相之间进行分配，在水相中含量较低，在有机相中则较高。

利用这个特性可以通过简单地将上层水相转移至新的离心管中，即可
将绝大部分DNA和蛋白质等杂质分离开来。

接着加入异丙醇，用于沉淀RNA，并在高速离心下使其聚集成团。

最后，将异丙醇去除并用无水乙醇洗涤RNA，即可得到高质量的RNA。

总之，Trizol提取RNA的原理是通过使用化学试剂破坏细胞膜和细胞核、形成RNA-有机溶剂复合物、利用两相分离法和沉淀法从其他杂质中分离出纯净的RNA。

Trizol_法提取细菌RNA的实验步骤

Trizol_法提取细菌RNA的实验步骤Trizol 法提取RNA实验步骤需要的试剂：氯仿异丙醇75%⼄醇（in DEPC-treated water)RNase free⽔或者0.5% SDS溶液[准备不含RNase的⽔，将其装⼊不含RNase的玻璃瓶中，加⼊diethylpyrocarbonate (DEPC 是为了减少RNase 的降解) to 0.01% (v/v)。

静置过夜，然后⾼压灭菌。

0.5% SDS溶液必须⽤DEPC预处理、⾼压灭菌的⽔]1、组织匀浆(1) 取出⾼温⾼压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒⼊液氮，研碎。

(2) 每50-100mg均浆组织标本中加⼊1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。

(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋⽩复合体。

2、相分离加⼊0.2 ml的氯仿，加盖好后⽤⼿剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离⼼12,000× g，15 minutes ，2 - 8°C。

离⼼后分成三层，下⾯的红⾊为酚-氯仿相，⼀个中间层，⼀⾯是⽆⾊的⽔相。

RNA 只存在于⽔相中。

⽔相占总TRIZOL的60%。

3、RNA沉淀将上层⽔相转移到另⼀⼲净的EP管中，加⼊0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离⼼12,000 rpm ，10 minutes，2 - 8°C。

离⼼前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。

4、RNA洗涤去上清，加⼊1ml 75%⼄醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离⼼7,500 × g ，5 minutes，2 -8°C。

5、RNA再溶解去上清，置真空或空⽓中5-10分钟，⼲燥RNA沉淀，（不能在真空中离⼼⼲燥）。

trizol的RNA提取方法

Phase separation1.从-80取出样品，室温孵育5分钟。

2.对每1ml的TRIzol试剂，加200ul的氯仿，安全地给试管盖盖子。

3.用手有力地shake试管大约15s。

4.在室温孵育2-3分钟5.在4℃下，离心样品以12000g的速度，15分钟主意：RNA主要是在上层的水相层6.把离心管倾斜45°的角度，移出水相层中的样品，用试管吸出。

避免吸出中间层和水相层的液体。

7.把吸出水相层的放到新的tube。

RNA Isolation Procedure当准备和处理RNA时，总是采取合适的预防措施便面RNAase的污染RNA precipitation1.加500ul的100%异丙醇于水相层（注意：每1ml的TRIzol试剂加500ul）。

2.在室温孵育10min3.在4℃离心10min，转速12000g ，在离心前，RNA经常是看不见的，离心后tube底部应该可以看白色沉淀。

RNA wash1.移出tube上清液，留下RNA白色沉淀。

2.加1ml的75%乙醇洗。

3.短暂地V ortex样品，接着在4℃下，7500g 离心五分钟，吸掉上清。

4.真空or 空气晾干水分约5-10min。

请不要真空离心晾干pellet（注意：请不要让RNA完全晾干，那样会降低pellet的溶解度，部分未溶解的RNA样品的A260/A280<1.6）RNA resuspension1.加DEPC水20-50ul溶解RNA。

2.55~60℃下水浴or 干浴10-15min3.继续下面的应用或者-80℃保存。

trizol提取rna的方法

trizol提取rna的方法Trizol提取RNA的方法RNA是生物体内重要的核酸之一，其在基因表达、蛋白质合成等生物过程中起着重要的作用。

而Trizol是一种广泛应用于RNA提取的试剂，其提取RNA的方法简单、快速、高效。

下面将介绍Trizol提取RNA的方法。

1. 样品的准备首先需要准备好需要提取RNA的样品，可以是细胞、组织、血液等。

对于细胞和组织样品，需要先用PBS等缓冲液洗涤去除杂质，然后用RNase-free水洗涤，最后用组织匀浆器或超声波破碎仪将样品破碎。

2. Trizol的添加将破碎后的样品加入Trizol试剂中，按照样品量与试剂量的比例加入。

一般来说，每1ml Trizol试剂可以处理100mg组织或1×10^7个细胞。

加入后充分混合，使样品与试剂充分接触。

3. 分离RNA加入Trizol试剂后，需要将样品离心，使其分为有机相、界面相和水相。

有机相中含有RNA，界面相中含有DNA和蛋白质，水相中含有多余的盐和杂质。

将上清液转移到新的离心管中，加入同等体积的异丙醇，充分混合后离心，使RNA沉淀到离心管底部。

4. 洗涤RNA将RNA沉淀用70%乙酸乙酯洗涤，使其去除异丙醇和杂质。

然后用75%乙酸乙酯洗涤，使RNA更加纯净。

最后用RNase-free水洗涤，使RNA更加纯净。

5. 测量RNA浓度和纯度用紫外分光光度计测量RNA的浓度和纯度。

RNA的纯度可以通过A260/A280比值来判断，一般来说，纯度在1.8-2.0之间为较好的RNA。

6. 储存RNA将提取好的RNA用RNase-free水稀释至适当浓度，然后分装到RNase-free离心管中，储存在-80℃冰箱中。

总之，Trizol提取RNA的方法简单、快速、高效，适用于各种类型的样品。

在操作过程中需要注意使用RNase-free试剂和器具，避免RNA的降解和污染。