分子生物学常用技术_图文-文档资料
2024版分子生物学常用技术共35张
电泳法
在电场作用下,利用蛋白质带电 性质和分子大小的差异进行分离, 如SDS-PAGE、双向电泳等。
亲和层析法
利用生物分子间的特异性相互作 用进行分离纯化,如免疫亲和层 析、金属螯合亲和层析等。
蛋白质鉴定和定量分析手段Fra bibliotek质谱法
通过测量蛋白质分子的质 量和碎裂模式进行鉴定和 定量分析,如MALDI-TOF MS、LC-MS/MS等。
信号传导途径涉及多种分子,包括受体、配体、信号转导蛋白和效应器等。
信号传导途径的异常与多种疾病的发生和发展密切相关,如癌症、神经退 行性疾病等。
受体介导信号传导途径研究方法
01
受体结合实验
利用放射性标记的配体或抗体, 检测受体与配体的结合情况,确 定受体的类型和数量。
02
信号转导蛋白活性 检测
通过检测信号转导蛋白的磷酸化、 去磷酸化等修饰状态,评估其活 性。
发展历程
自20世纪50年代以来,随着DNA双螺旋结构的发现、遗传密码 的破译、基因工程技术的建立等一系列重大突破,分子生物学 迅速崛起并渗透到生物学的各个领域,推动了整个生物科学的 飞速发展。
分子生物学研究内容
基因与基因组研究 包括基因的结构、功能、表达调控以 及基因组的结构、功能与进化等。
DNA复制、转录与翻译
工具使用
BLAST、Bowtie、BWA等软件进行序列比对;CAP3、Velvet、 SPAdes等软件进行序列拼接。
基因结构和功能预测方法
基因结构预测
通过识别编码区、非编码区、启动子、终止子等 元素,预测基因的结构和组成。
基因功能预测
利用基因表达谱、蛋白质互作网络、代谢通路等 信息,预测基因的功能和调控机制。
分子生物学常用技术
分子生物学常用技术
Ⅰ.核酸分子杂交( Ⅰ.核酸分子杂交(DNA/DNA or DNA/RNA)技术 DNA/RNA) 核酸分子杂交
核酸分子杂交技术,是在1968年由华盛顿卡内基 1968年由华盛顿卡内基 核酸分子杂交技术,是在1968 学院( Washington) 学院(Cavnegie Institute of Washington)的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是, Britten及其同事发明的。所依据的原理是,带有互补 及其同事发明的 的特定核苷酸序列的单链DNA RNA, DNA或 的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA,当它们混合在一 起时,其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 起时,其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
2、诺赛恩RNA印迹技术(Northern blotting) 、诺赛恩RNA印迹技术( blotting)
1979年 J.C.Alwine等人发展而来,是将RNA 1979年,J.C.Alwine等人发展而来,是将RNA分子从电泳凝 RNA分子从电泳凝 等人发展而来 胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上, 胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上,进行 核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA DNA印迹杂交 核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交 技术十分类似,所以叫做诺赛恩RNA印迹技术(Northern 技术十分类似,所以叫做诺赛恩RNA印迹技术(Northern blotting)。 blotting)。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上, 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后 标记的特定蛋白质之抗体进行反应, 同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应,这种技 术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术( blotting)。 术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术(Western blotting)。
分子生物学常用技术资料
温 度 72 (℃)
94
高温变性 低温退火 适温延伸 形 成
1
2
3
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
55 22
DNA单链 与引物复性 DNA双螺旋
DNA 2
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍
1
2
3
时间(min)
4
5
PCR运行图
PCR结果的鉴定
• 通过凝胶电泳的方式来进行。
•PCR结合多态性分析
PCR扩增产物的多态性分析有2种情况: 限制片段多态性分析(A)、(B) 重复序列多态性分析(A)、(C)
PCR-限制片段多态性分析
重复序列多态性分析
• SSCP技术进行点突变的诊断
实时荧光定量PCR技术
电泳技术
electrophoresis technology
⑤引物-3’端的碱基,特别是最末及倒数第 二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 这 对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据 库的其它序列无明显同源性。引物量: 每条 引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol, 以最低引物 量产生所需要的结果为好,引 物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且 可增加引物之间形成二聚体的机会。
5ul 各200umol/L 各10~100pmol 0.1~2ug 2.5u 1.5mmol/L 50ul
•加样:
单样本加样 多样本加样 加样的顺序
•PCR反应条件的设定:
预就性温度: 变性温度: 退火温度: 延伸温度: 总延伸温度: 94℃,5分 94℃,30秒 需要摸条件 72℃,30秒 72℃,15分
分子生物学技术 PPT课件
RNA制备
• Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织 或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。用Trizol 法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直 接用于Northern斑点分析,斑点杂交, Poly(A)+ 分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。
• RNA提取试剂盒:国产、进口 常用总RNA提取试剂盒 尽量选用含DNA酶的试剂盒
步骤
• 以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积 不能超过所用Trizol体积的10%。
• 研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的 比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。
• 取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙 醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10 分钟。
• 操作过程中带手套、口罩。
PCR
• 聚合酶链式反应(PCR)扩增:指数扩增是一 种很灵敏的技术,可以检测很低拷贝数的 RNA。
• 一种选择性体外扩增DNA的方法. • 一种将微量的目的DNA片段在体外快速、
大量扩增的技术。 • 半保留复制
• 三个基本步骤: • (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下
PCR反应体系的基本成分
• 模板: cDNA • 引物:与模板DNA特异互补的单链寡聚核苷
酸片段,一般18-30bp, 上下游引物 • DNA聚合酶: 如Taq酶 • 底物: 等浓度的四种核苷酸(dNTP) • 反应环境: 含有Mg2+的Tris-Cl缓冲液。
含DNA聚合酶的2×反应混合物
PCR反应体系的基本成分
✓ 引物长度约为16-30bp, 太短会降低退火温度影响引物与模板配对,从而使 非特异性增高。
分子生物学中的实用技术
分子生物学中的实用技术分子生物学是现代生物学领域中不可或缺的一部分,其运用了一系列重要的实用技术,为基因组学、病原微生物学、生态学和发育生物学等领域的研究提供了基础。
下面将对分子生物学中的一些重要技术进行介绍。
1. PCR技术PCR即聚合酶链反应(polymerase chain reaction),是分子生物学中常用的技术之一。
通过PCR技术,可以将微小的DNA样本扩增到足够数量,以便在分子生物学涉及的各种实验中进行使用。
PCR技术可以非常快速地扩增特定DNA序列,因此应用广泛。
例如,PCR技术可以用于检测DNA中的特定基因突变、检测病原体和人类DNA样本中的单核苷酸多态性(SNP)等。
2. 凝胶电泳凝胶电泳(Gel Electrophoresis)是分离和分析DNA、RNA、蛋白质等大分子生物分子常用的技术。
凝胶电泳利用电场将荧光染色的DNA、RNA等分子沿着凝胶条中特定孔洞运动,根据分子大小、电荷和形状的不同,实现分子的分离。
凝胶电泳可以帮助分析基因的大小、分析基因的表达、检测微生物、检测哺乳动物血清中的抗体等。
3. Western blotting技术Western blotting技术又称为免疫印迹(Immunoblotting),是蛋白质检测和分析的经典方法。
Western blotting可用于检测和分析蛋白质的存在和分子量,该技术可用于检测抗原、抗体、细胞因子、酶、膜蛋白等。
与其他方法相比,Western blotting技术具有高特异性、高灵敏性和高可重复性等优点。
4. DNA测序技术DNA测序技术是分子生物学研究中的一项重要技术,通过DNA测序可以读取DNA序列并得出基因的组成及其顺序。
DNA测序技术可以用于分析食品检测、分析传染病的基因、预测遗传性疾病、鉴别病原体等。
5. RNA干扰技术RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)是目前分子生物学研究领域中最有前途和最具有活力的技术之一。
分子生物学一些基本技术
分子生物学一些基本技术第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA 分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。
F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。
当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种,这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。
分子生物学常用技术(简化版)
Northern blot
类似于 Southern 印迹杂交的方法,用于 RNA 检测
in situ hybridization
原位杂交:特定 mRNA 的组织细胞分布
FISH Fluorescence in situ hybridization (FISH):特定基因的染色体定位
反 Northern 杂交与 DNA 芯片
DNA解旋解链
DNA的体内复制
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
5’
3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
GGAUCG
5’
AUCGCG
5’
引物酶
引物酶
RNA引物
RNA引物
DNA解旋解链
引物合成
DNA的体内复制
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
核酸:测序、印迹、杂交、体外扩增技术 蛋白质:电泳与印迹、组学技术、相互作用
基本技术:
基因工程技术 转基因生物与基因敲除技术
综合技术:
基因诊断 基因治疗
应用技术:
第一节:核酸分子杂交
Molecular hybridization: 利用已知核酸序列 (探针/probe) 检测与其互补的未知核酸序列 用途: 确认核酸序列间同源性 对特定核酸序列进行定量 自核酸混合体中辨认特定核酸序列
1.什么是耐热 DNA 聚合酶
早期 PCR 曾使用 DNA 聚合酶 I
在高温时发生变性,每一循环都需要重新添加酶 延伸反应温度为 37℃,非特异性太多
目前常用 Taq DNA 聚合酶
纯化自嗜热水生菌 (Thermus aquaticus) 可耐受 95℃ 高温,最适反应温度为 72℃ 左右