肝癌自杀基因治疗研究新进展

万方数据
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第99期
张阳德，等：肝癌自杀基因治疗研究新进展
的抗 肝 癌 效 能 在 体 内、外 实 验 中 不 断 得 到 确 证。 !"#$%&’() 等人［*］构建了分别由 +,-、./0 增强 子／启 动 子 调 控 的 含 12 基 因 的 腺 病 毒 载 体 .34 +,-56和 .34./056，转染人肝癌细胞、非肝癌细 胞和注 射 裸 鼠 体 内 肝 癌 细 胞 来 源 的 移 植 瘤，并 用
养，用 !+- 处理后不仅 12（O）细胞死亡，而且 12 （E）细胞也被杀死。之后，自杀基因治疗的旁观者
效应在各种体内外实验中均得到证实［B，L］。而有研
究显示，旁观者效应不仅存在于一个肿瘤内部互相 接触的细胞间，而且也存在于远距离肿瘤之间［Q，;］。
性作用。另外，2?$@A+ 等［B］用携带 12 基因的腺 病毒载体转染人肝癌细胞后，致瘤裸鼠，并用 !+处理，结果 与 上 述 报 道 一 致，肿 瘤 的 生 长 被 完 全 抑
另外，有研究比较了 AK-9E12／!+- 系统与 +C／DE/+ 系 统 对 肝 癌 细 胞 杀 伤 的 效 能［N］，结 果 发 现 +C／DE/+ 系统在体外对肝癌细胞生长的抑制较 强，而在体内实验中 AK-9E12／!+- 系统的抗肿 瘤效应及肿瘤免疫反应更强。由此可见这两个系统
对肝癌的治疗均有效。
* 肝癌自杀基因治疗的靶向性策略
以安全有效的靶向细胞传递方式实现目的基因 在靶细胞的定位和可控性表达是自杀基因治疗的关 键步骤。只有确保自杀基因仅在肝癌细胞内而不在 周围正常细胞中表达，才能起到杀伤肿瘤细胞而不 损害正常肝脏功能的治疗目的。目前主要从基因导
目前限制基因治疗广泛应用的瓶颈之一就是基 入载体、自杀基因靶向表达及导入途径三方面来实
卫生部肝胆肠外科研究中心（长沙 !"###$） 张阳德 孙 颖
关键词 肝癌 自杀基因 基因治疗 分类号 %&’()&
肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，预 后差。尽管其诊治水平不断提高，世界每年因肝癌 致死的病人仍达百万人之多。传统的手术、放化疗 等手段可一定程度改善早期病人的预后，但对转移、 复发及中晚期患者却无能为力。随着分子生物学技 术的不断进展、人们对肿瘤分子机制研究的不断深 入，利用肿瘤与正常组织基因及调控区域的结构差 异，从分子水平特异性杀伤肿瘤细胞的基因治疗成
" 自杀基因治疗系统
自杀基因是指存在于细菌、病毒和真菌中的一 类基因，其编码的酶能活化一些抗感染药物前体，从 而产生细胞毒作用。由于这类酶并不存在于哺乳动 物中，因此，前体药物对哺乳动物细胞通常是低毒或 无毒的。肿瘤的自杀基因治疗策略就是将这类基因 用基因工程技术构建在一定的表达载体上并导入肿 瘤细胞中，利用其在特定条件下高效表达的酶将无 毒性的药物前体转化为细胞毒性药物，从而达到杀
")" *+,D-./／01, 系统 *+,"-./／01, 系统是利用 *+,"-./ 磷
酸化 01, 产生细胞毒性，从而杀伤肿瘤细胞。实 际上，*+,"-./ 基因的前体药物为一类核苷类似 物，包括 31,、01, 等。由于在该系统中 01, 抗 肿瘤效应较 31, 强"#倍，故目前的抗肿瘤研究主 要应用 01,。病毒源性 ./ 基因不同于哺乳动物 细胞内的 ./ 基因，其单磷酸化 01, 的效率较哺乳 动物细胞内的./ 强"###倍。*+,"-./ 将01, 单磷酸化为 01,-6A，经细胞内鸟苷酸激酶的作 用 01,-6A 双磷酸化为 01,-7A，再经细胞内 激酶作用发生三磷酸化生成 01,-.A。这种三磷 酸化的形式对细胞是剧毒性的，能够抑制 7;3 聚 合酶的 作 用，并 掺 入 到 7;3 链 的 末 端，从 而 抑 制 7;3的 合 成，引 起 细 胞 的 死 亡。在 缺 乏 *+,"./ 的条件下，01, 在治疗浓度时对细胞无毒；相应 的，在缺乏 01, 时，*+,"-./ 的表达对细胞也是 无毒的。
!+- 处理。结果发现，两种质粒在789:;<=>滴度 时均能有效抑制细胞及肿瘤生长，而 .34./056则 特异作用于肝癌细胞，避免了对非肝癌细胞产生毒
未转染细胞具有杀伤作用，为解决基因转染效率低
下的难题提供了新对策。早期的研究已经发现，12 （O）和 12（E）的肿瘤细胞以 ;P9 的比例混合培
非病毒载体主要包括脂质体、裸 !"# 及阳离 子多聚物型载体等。目前解决非病毒载体靶向性问
细胞毒性，而 脂 质 体 则 在 ?KI 细 胞 中 有 毒 性 产 生。 可见，纳米粒基因载体是一种无毒、高效、能稳定转
题的常用办法就是利用细胞表面特异性表达的受体 染的非病毒载体，有望为自杀基因治疗肝癌的研究
因转染 效 率 低，达 不 到 9::M 转 染 靶 细 胞 的 目 的。 现肝癌自杀基因治疗的靶向性策略。
而旁观者效应，即转染自杀基因的肿瘤细胞对周围 *49 高效靶向的基因导入载体
万方数据
·BD·
中国现代医学杂志
第.L卷
自杀基因治疗的载体分为病毒载体和非病毒载 体。
照。结果发现，在 ;CF/AL细胞中转染效率强于其 他两种细胞，而脂质体转染未发现此特点；纳米粒无
第"’卷第""期 E##’年<月
中国现代医学杂志 1FGH5IJK4H5DJL6JCB4H6BCGMGHB
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·综述·
肝癌自杀基因治疗研究新进展
为肿瘤治疗中极具应用潜力的新策略。肝癌的发生 并非某个基因的单独作用，而是一个多基因多阶段 的复杂过程，因而不依赖于肿瘤细胞的遗传背景，直 接向肿瘤细胞引入药物敏感基因而使前体药物对肿 瘤细胞产 生 毒 性 作 用 的 自 杀 基 因 治 疗 以 其 作 用 直 接、合理、有效而备受关注，成为肝癌基因治疗的研 究热点。本文就近年来自杀基因治疗肝癌的新进展 作一简要综述。
的%23(%45%2%’6+4+7)5%483)*79,):+2%%73(93(92) （$%203)*）4!"#复合物转染入表达 #0$1受体的
人肝癌细胞 ;)3$/、鼠肝癌细胞 <"=4>=/及不表 达 #0$1受体的肺!型上皮细胞 #?@A。结果发现 只有表达 #0$1受体的肝癌细胞发生了特异的受体 介导的 !"#内吞作用。
基嘌呤（,2,-./／345-6）系统、胞嘧啶脱氨酶／( 氟胞嘧 啶（17／(-81）系 统、硝 基 还 原 酶／19":(! （;.%／19":(!）系 统、黄 嘌 呤 - 鸟 嘌 呤 磷 酸 核 糖 转 移酶／<- 巯 基 黄 嘌 呤（=>?／<.@）系 统、嘌 呤 核 苷 磷 酸化酶／<- 甲 基 嘌 呤 脱 氧 核 糖 核 苷 酸（A;A／<6BA-C%）系统等。其中 *+,"-./／01, 系统和 17／(-81系统在肝癌自杀基因治疗中应用最为广 泛。
灶中也被显著抑制。旁观者效应的机制尚不完全清 楚，目前较为一致的观点是认为缝隙连接、扩散作用 以及细胞凋亡小体的转移、机体的免疫机制可能在
的前药DE/+转化为高毒性的化疗药物DE0F。D E0F 再经细胞内酶作用生成氟尿嘧啶三磷酸盐（D E/1,0）和氟脱氧尿嘧啶单磷酸盐（DE/3F,0）， 二者抑制胸苷酸合成酶，阻抑 CG.、)G. 及蛋白质 的合成，引起细胞死亡。+C／DE/+ 系统对肝癌的 抑制效应已被许多实验证实。A>&@HI 等人［D］利用 不同的启动子（+.! 启动子、./0启动子）构建了表 达 +C 的 复 制 缺 陷 型 腺 病 毒 载 体 .3"J9+.+C 和 .3"J9./0+C，分别体外转染./0阳性的 A"<!7肝 癌细胞和 ./0阴性的K,,+LL79肝癌细胞，并用D E/+处理。发现，.3"J9+.+C 载体在转染效率不 足7:M时即可产生有效的 肿 瘤 细 胞 生 长 抑 制，而 .3"J9./0+C则只诱导 ./0 阳性肝癌细胞对DE /+的毒性敏感性。同时，体内实验结果与之一致。
病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒
等。逆转录病毒只在分裂增殖细胞中整合入细胞染
色体，因此对肝癌细胞有相对靶向性，但其表达效率
因此通过与 D1//形成融合蛋白的方式进行转运的 蛋白质转运途径可在一定程度上解决基因转运效率 低下的问题。MN:*%,9)6O M# 等［.?］构 建 了 >! 与 D1//融合基因，并克隆入重组腺病毒载体，转染肝 癌细胞，用?4B> 处理。结果发现，?4B> 对表达 >!4D1//融合蛋白的肿瘤细胞的毒性作用较仅表 达 >! 的肿 瘤 细 胞 更 强 烈，肿 瘤 抑 制 更 显 著。 由 此 可见，D1//融 合 蛋 白 转 运 方 式 为 提 高 肝 癌 自 杀 基 因治疗效能提供了新的可行性方案。
7 自杀基因治疗的旁观者效应
不同的自杀基因系统中发挥作用。 加强旁观者效应对充分发挥自杀基因的抗肿瘤
疗效具有重要意义。目前，许多研究从旁观者效应 的机制出发，寻求加强旁观者效应的措施，以提高抗 肿瘤疗效。G(UV$%&W1X 等人研究了在缝隙连接通 讯功能低下的结肠癌细胞 A1E7;中应用结合素 B*（+JB*）对 AK-9E12／!+- 治疗系统的作用，结 果发现转染 +JB*基因可提高细胞中缝隙连接蛋白 的表达，从而增强对旁观者细胞的杀伤，抑制肿瘤的 生长。用 +JB*基因转染 12（E）的肿瘤细胞较转 染 12（O）的肿瘤细胞能获得更强的旁观者效应， 而+JB*基因同时转染 12（E）和 12（O）的 A1E 7;细胞，可获得最强的旁观者效应［99］。由此可见， 加强旁观者效应是提高自杀基因抗肿瘤疗效的一个 有效途径。
较低，且有引起插入突变的可能。而腺病毒载体虽 LP/ 自杀基因的靶向可控性表达
因肝脏有丰富的腺病毒受体而在静脉注射时大量聚
靶向基因转移只能部分地实现自杀基因在肝癌
集于肝脏，但其对分裂及静息期的细胞也有感染性， 细胞的靶向表达，因为借助的抗原或受体并非某种
因此同样达不到肝癌组织靶向性转导的目的。如何 细胞所特有，所以目前研究的热点集中在利用肝癌
伤肿瘤细胞的治疗目的［"］。
*+,"-./／01, 系统在肝括单纯疱 究中进展迅速。自"::(年首次被引入肝癌的基因
疹病 毒 ! 型 胸 苷 激 酶／丙 氧 鸟 苷（*+,"- ./／ 治疗中，并证明能以剂量依赖的方式诱导 01, 对
01,）系统、带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶／阿糖甲氧 肝癌细胞的杀伤作用［E］后，*+,"-./／01, 系统
或蛋白，如肝细胞膜表面独有去唾液酸糖蛋白受体。 $%&’()*+,-等 人［./］是 利 用 唾 液 酸 糖 蛋 白（#0$1） 能与肝细胞上去唾液酸糖蛋白受体特异性结合并介 导内吞的特点，用脂质体转染法将含有半乳糖残基
带来新的突破。
此外，研究已证实，;0D.体被蛋白 D1//具有 在细胞间转运的特性，野生型 D1//及 D1//融合 蛋白均能从其表达细胞中有效地扩散入临近细胞。
（#B1），相对特异性合成白蛋白（#=<），同时肝癌细 胞特异 合 成 的 转 录 调 节 蛋 白（QR1）通 过 与 #B1、 #=<基因的 QR0 结合促 进 #B1 和 #=< 的 表 达。 因此用 #B1、#=< 基因的 QR0调控自杀基因的表 达，可实现对肝癌组织的靶向性。研究也发现此种
制。
R&S>"0等［9:］采用裸 TG. 直接注射法将 +C 基因 表达质粒注射入动物左右肝叶的结肠癌肝转移灶，
并用DE/+处理。结果发现这些肿瘤灶显著消退， 而且，在未注射质粒的肝内其他肿瘤灶和肝外转移
947 +C／DE/+系统 胞嘧啶脱氨酶（+C）只表达于某些细菌和真菌
中，因其能催化胞嘧啶生成尿嘧啶，故而可将无毒性
进一步提高载体的靶向性有待研究。 肝癌自杀基因治疗中载体转染效率印较低是不
特异性转录调控元件（QR0）控制自杀基因仅在肝癌 细胞中表达上。这是增强靶向性的一个重要策略。
争的事实，因此有必要开发新的高效基因转运载体、
研究 证 实，肝 癌 细 胞 特 异 性 合 成 甲 胎 蛋 白
寻求提高转运效率的新途径。纳米粒基因载体是一 种新型的非病毒载体，因易被单核巨噬细胞摄取而 主要分布于肝脏，故具有一定的肝靶向性。研究显 示，纳米载体较裸 !"# 及其他阳离子载体介导的 基因转染效率显著提高，且转染的目的基因能持久