自身免疫性肝炎新型抗原分子高迁移率族蛋白B1的

文章编号：１００６—３１１０（２００７）叭一００５３—０４【论著】自身免疫性肝炎新型抗原分子高迁移率族蛋白Ｂ１的克隆表达鉴定及蛋白纯化赵擎１，辛绍杰２，胡燕３，侯俊３，貌盼勇３摘要：目的获得高纯度的人高迁移率族蛋白Ｂ１（ｈｉ曲Ⅱｌｏｂｉｌｉｔｙｇｍｕｐｂｏｘ一１ｐｍｔｅｉｎ，ＨＭＧＢｌ），为制备单克隆抗体及研究其与自身免疫性肝炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＡＩＨ）的关系打基础。

方法应用ＰｃＲ从乳腺文库中扩增得到ＨＭＧＢｌ基因片段，并将其克隆到ｐＥＴ２８ａ（＋）载体上，对获得的ｐＥＴ２８ａ（＋）一ＨＭＧＢｌ重组质粒扩增后进行ＰｃＲ、酶切和测序鉴定。

将鉴定完全正确的质粒转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），ＩＰＴＧ诱导重组蛋白表达，表达产物经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳分析和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定。

最后进行大量诱导并纯化，得到带Ｈｉｓ标签的ＨＭＧＢｌ蛋白。

结果成功构建ｐＥＴ２８ａ（＋）一ＨＭＧＢｌ重组质粒，并经诱导表达，得到了纯化的Ｈｉｓ—ＨＭＧＢｌ蛋白。

结论构建ｐＥＴ２８ａ（＋）一ＨＭＧＢｌ重组质粒并得到其表达蛋白，为今后深入研究ＨＭＧＢｌ在ＡＩＨ中的作用机理提供有力的实验工具。

关键词：高迁移率族蛋白Ｂ１；自身免疫性肝炎；党隆表达；蛋白纯化中图分类号：Ｒ４４６文献标识码：ＡＣｏ璐ｔｒｕｃｔｉ佃，Ｅｘｐｒ皓ｓｉｏｎ柚ｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨｉｓ—ＨＭＧＢｌａｎｄＮｏＶｅｌＡｎｔｉｇｅｎｉｎＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅＨｅｐａｔｉｔｉｓＺＨＡｏＱｉ矗ｇ，ＸＪＮｓＪｌ∞一伽，日Ｕｙｎｎ，甜ｎｆ．（１．胁姆俐Ｈｎ据Ｍ础ｃｎｌＣｏｆ姆西ＰＬＡ，”Ｂ阿ｉ愕１００８５３，劬ｆｎｎ；２．豫ｆｒｄ隗舶ｒｆｍ蹦ｆｏ，ｊ咖ｆｆＤ比ｓＤｌ姗ｓｅ，３０２Ｈ傩ｐｆｆｎｆＤ，ＰＬＡ，Ｂ町ｆ咒ｇ１０００３９，Ｃ矗ｌｎ口；３．Ｌｎ厶ｏｍ胁唧Ｄ，Ⅵ，ｏＺｐｇｙ，３０２Ｈｏｓｐ打口ｆｏ，ＰＬＡ，Ｂ西－一孵１０００３９，ＣＡ蛔口）作者单位：１解放军军医进修学院（北京１００８５３）；２解放军第三０二医院感染三科；３解放军第三。

二医院传染病研究所病毒研究室作者简介：赵擎（１９７７一），女，河北保定市人，博士，主要从事自身免疫性肝病和生物人工肝脏的研究工作。

通讯作者：辛绍杰，貌盼勇。

活方式与儿童单纯性肥胖的关系进行了研究。

研究发现，半岁至一岁以前喂养方式、肉食添加时间、吃油腻食品频率、每餐用餐时间、每天户外活动时间等因素与儿童单纯性肥胖的发生有关。

３．１儿童单纯性肥胖与婴儿期喂养情况的关系本研究结果表明半岁至一岁以前母乳喂养是儿童肥胖的一个保护因素，同时，一岁以前过早添加肉食是儿童肥胖的危险因素。

谷晶¨。

等的研究也发现人工喂养和过早添加辅食是儿童肥胖的危险因素。

其原因可能是由于人工喂养易造成过量喂养，以至供给超过需求，从而导致婴儿期肥胖，而婴儿期肥胖又使儿童期肥胖发生的危险性增加。

因此。

小儿出生后应坚持母乳喂养，人工喂养时应按婴儿的需要喂养，４个月后合理增加辅食，断乳后注意营养措施，避免过度喂养或不合理的喂养是减少肥胖儿童发生的重要途径。

３．２儿童单纯性肥胖与饮食和运动的关系儿童单纯性肥胖症是一种热能代谢障碍，由于能量的摄入和消耗之间的不平衡，引起体内脂肪积聚过多所致，即营养过剩所致旧１。

影响能量平衡的关键因素是饮食和运动。

本次研究发现，肥胖儿童吃含热量较高的油腻食品频率高于正常儿童，而每餐用餐时间则短于正常儿童，这可能与肥胖儿童食欲好于正常儿童而进食速度快有关。

Ｄａｖｉｅｓ的研究表明，学龄期儿童体育活动量过少将导致体内脂肪过多增加。

本次调查也充分证实了这一点，肥胖儿童每日运动时间明显少于正常儿童。

因此，教育儿童从小培养良好的生活习惯，进食习惯，不偏高热量食物，纠正进食快等不良习惯；鼓励参加各种体力活动和适度的劳动，是防治儿童单纯性肥胖的有效措施。

（注：本论文来源于立项课题《出生体蕈与儿童单纯性肥胖相关关系的研究》）［参考文献］［１］ＥｂｂｅｌｉｎｇＣＢ，ＰａｗｌａｋＤＢ，ＬｕｄｗｉｇＤｓ．Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄｏｂｅｓｉｔｙ：ｐｕｂｌｉｃ—ｈｅａｌｔｈｃｒｉｓｉｓ，ｃｏｍｍｏｎｓｅｎｓｅｃｕｒｅ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，２００２，３６０：４７３８２．［２］余毅震．肥胖症对青少年身心发育的影响［Ｊ］．国外医学．社会医学分册，１９９５，１２（４）：１５６［３］ＴｉｍＪｃｏｌｅ，ＭａｒｙｃＢｅｌｌｉｚｚｉ，ｅｔａ１．ＥｓｔａｂＩｉｓｈｉｎｇａｓｔａｎｄａｒｄｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｆｏｒｃｈｉｌｄｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔａｎｄｏｂｅ《Ｌｙｗｏｒｌｄｗｉｄｅ：ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｒｍｌｓｕｒｖｅｙ［Ｊ：ＢＭＪ，２０００，３２０：１０［４］谷晶．８～１１岁儿童单纯性肥胖影响因素的配对调查［Ｊ］．中国公共卫生，１９９９，１５（４）：３５７．［５］祝俊．儿童单纯性肥胖症［Ｊ］．中国校医，２００５，１９（６）：６６１—６６５．［６］叶广俊．现代儿童少卫生学［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，１９９９．４２９—４３３．（收稿日期：２００６—０９—１４）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｏｂｔａｉｎｐｕｒｉｆｉｅｄｈｕｍａｎｈｉｇｈｍｏｂｉｌｉｔｙｇｒｏｕｐｂｏｘ一１ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＭＧＢｌ）ｕｓｅｄｉｎｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅ．ａｒｃｈｏｆｔｈｅｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏＩｇｉｃａｌｒｏｌｅｏｆＨＭＧＢｌｉｎａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｈｅｐａｔｉｔｉｓ（ＡＩＨ）．ＭｅｔｈｏｄｓＦｕｌｌｌｅｎｇｔｈＨＭＧＢｌｃＤＮＡｃｌｏｎｅｄｂｙＰＣＲｆｒｏｍｍａｍｍａｒｙｌｉｂｒａｒｙｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｐＥＴ２８ａ（＋）ｖｅｃｔｏｒｓｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｐＥＴ２８ａ（４－）一ＨＭＧＢ！ｐｌａｓｍｉｄ．Ａｆｔｅｒｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ，ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｐＥＴ２８ａ（＋）一ＨＭＧＢｌｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３），ａｎｄｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧｗａｓｅｘａｍｉｎｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨｉｓ—ＨＭＧＢＩｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄ．ＲｅｓｕｌｔｓｐＥＴ２８ａ（＋）一ＨＭＧＢｌｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｃｏｒｒｅｃｔｌｙ，ａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄＨｉｓ—ＨＭＧＢｌｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＣｏｒｒｅｃｔｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐＥＴ２８ａ（＋）一ＨＭＧＢｌｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨｉｓＨＭＧＢＩｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏ—ｖｉｄｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｏｏｌｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｏｆＡＩＨ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｈｉｇｈｍｏｂｉｌｉｔｙｇｒｏｕｐｂｏｘ１ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＭＧＢｌ）；Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｈｅｐａｔｉｔｉｓ（ＡＩＨ）；Ｃｌｏｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｐｒｏｔｅｉｎｐｕ—ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ自身免疫性肝炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＡＩＨ）是一种免疫介导的肝脏炎症性疾病，目前尚缺乏可资诊断的致病性特征。

ｍ循环中自身抗体的检测是ＡＩＨ诊断和分型的主要依据、１Ｊ。

Ｉ型ＡＩＨ最常见，约占全部ＡＩＨ的６０％～８０％，抗核抗体（ＡＮＡ）ｌ、抗平滑肌抗体（ＳＭＡ）、抗肝细胞膜抗体（ＬＭＡ）、和抗中性粒细胞胞浆抗体一核周型（Ｐ—ＡＮＣＡ）阳性为其特征。

抗肝肾微粒体Ｉ型抗体（ＬＫ．Ｍ—１）或抗肝细胞溶质抗原Ｉ型抗体阳性是Ⅱ型ＡＩＨ的特征性标志。

Ⅲ型ＡｌＨ特征性标志是血清中出现抗可溶性肝抗原／肝胰抗原抗体。

但这些并不能完全排除其他原因引起的肝脏病变，药物性肝炎、病毒感染等也可产生相应的自身抗体。

而且，引起ＡＩＨ的靶抗原目前尚不明确。

高迁移率族蛋白（ｈｉｇｈｍｏｂｉｌｉｔｙｇｒｏｕｐｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＭＧ）是存在于真核生物细胞内的一类非组蛋白染色体结合蛋白，ＨＭＧ又分为ＨＭＧＡ、ＨＭＧＢ、ＨＭＧＮ家族。

研究显示ＨＭＧＢＩ是Ｐ—ＡＮＣＡ的一种新型靶抗原分子，ＡＩＨ患者体内抗ＨＭＧＢｌ＋抗体的阳性率达８９％；在Ｐ—ＡＮｃＡ阳性的ＡＩＨ患者体内，抗ＨＭＧＢｌ抗体的阳性率为９６％，两者具有很好的相关性。

２１。

本实验通过构建ＨＭＧＢｌ重组表达质粒，得到并纯化ＨＭＧＢｌ表达蛋白，为今后深入研究ＨＭＧＢｌ在ＡＩＨ发病中的作用机制提供了有力的实验工具。

１材料与方法１．１材料载体ｐＥＴ２８ａ（＋）由本研究室保存，大肠杆菌ＤＨ５ｎ和ＢＬ２１（ＤＥ３）购自北京博大泰克公司；ｐｆｕＴａｑ酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ内切酶、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、蛋白质低分子量Ｍａｒｋｅｒ购自ＴａＩ≮ａＲａ公司；微量质粒提取试剂盒、ＰＣＲ产物纯化和胶回收试剂盒购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；人重组ＨＭＧＢＩ蛋白、小鼠抗人组氨酸抗体、小鼠抗人ＨＭＧＢｌ单克隆抗体购自Ｓｉｇｍａ公司；组氨酸Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ珠购自ＱＩＡＧＥＮ公司；免疫发光检测试剂盒购自Ｐｉｅｒｃｅ公司；乳腺文库由解放军总医院烧伤研究所刘辉博士惠赠。

１．２方法１．２．１引物设计和合成根据ＧｅｎＢａｎｋ中ＨＭＧＢｌ的开放读码框序列（登录号ＢＣ０６６８８９），设计带有ＥｃｏＲＩ酶切位点的上游引物和带有ＨｉｎｄＩＩＩ酶切位点的下游引物，由北京奥科生物公司合成、纯化。

上游，５’一ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＡＡＣ辩ＡＧＡＴＣＣＴＡＡＧ一３’；下游，５’一ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴ＇Ｉ、Ｃ一３’。

１．２．２ｐＥＴ２８ａ（＋）一ＨＭＧＢｌ重组质粒的构建以乳腺文库为模板扩增ＨＭＧＢｌ基因片段，扩增条件为９４℃预变性４ｍｉｎ；然后９４℃变性４０Ｓ、５４℃退火４０Ｓ、７２℃延伸４０Ｓ，共３０个循环；ｔｌ后７２℃延伸５ｍｉｎ。

ＰＣＲ产物经低熔点胶回收后和ｐＥＴ２８ａ（＋＞质粒分别用ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄｌＩｌ双酶切，酶切完毕后以低熔点胶回收连接，按摩尔比６：１的比例用Ｔ４连接酶进行连接，连接体系２０ｕｌ，４℃过夜，连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，涂布含５０／ｔｇ／ｍＬ卡那霉素的１．５％的琼脂乎板，挑选阳性克隆并提取质粒进行ＰＣＲ、酶切和序列测定。

１．２．３Ｈｉｓ—ＨＭＧＢｔ融合蛋白的小量诱导表达鉴定将鉴定正确的ｐＥＴ２８ａ（＋）一ＨＭＧＢｌ重组质粒转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），涂布卡那霉素琼脂平板，３７℃孵育过夜。

挑取单克隆菌落摇菌，接种列含卡那霉素的５ｍＬＬＢ培养基中，３７℃Ｘ２００ｒｐｍ振荡培养过夜。

按２％的接种量再次接种在含卡那霉素的５ｍＬＬＢ培养基中，３７℃Ｘ２００ｒｐｍ振荡培养至０Ｄ６。