2 工具酶

应用：一些同裂酶间对于切割位点上的甲基化碱基的敏感 度有所不同，利用这样细微的差异可以进行DNA甲基化作 用的研究。
关于限制酶的几个概念（5）
同尾酶（isoaudarner）
来源各异，识别序列也各不相同， 来源各异，识别序列也各不相同，但都产生 相同粘性末端的一类限制酶。 相同粘性末端的一类限制酶。
限制与修饰作用
关于这种寄主控制的限制与修饰现象，最早提出了限制—修饰酶的 假说来解释。在寄主细胞中有一对酶：限制性核酸内切酶（简称限制酶） 和DNA甲基化酶（简称甲基化酶或修饰酶）。它们对DNA底物有相同的 作用部位，但具有相反的生物功能，限制酶要对其底物DNA中的识别序 列进行切割使DNA断裂，甲基化酶则在底物DNA的相同序列上甲基化， 使限制酶不能对这一部位进行识别和切割。
第二章
基因的体外操作需要工具酶
限制酶类像“剪刀” 限制酶类像“剪刀” 连接酶类像“胶棒” 连接酶类像“胶棒” DNA实施操作 对DNA实施操作
工具酶与基因克隆技术
在基因工程的实际操作中，工具酶的使用是一项基本技术，在体外无论对DNA 进行分离纯化、连接重组或者修饰合成等都会涉及一系列酶促反应。工具酶的功 能把握与灵活运用，直接影响到基因工程设计水平的高低与实验技术的成败。正 是这些种类繁多、功能各异工具酶的发现与应用，才使得人们能够对“庞大”的 基因组与微小的DNA实现分子水平的操作，促进基因克隆技术的不断发展。
activity） ★ 号活性（star activity）
当反应条件不恰当时 ， 某 些限制酶的识别或切割位点发生 改变，不再严格遵循识别位点酶 改变， 解DNA。也称第二活性、“星号” 。也称第二活性、 星号” 活性。 活性。
★产生“星号”活性的因
素
高浓度甘油﹡ 碱性pH或低pH 存在Mn2+ 低离子强度
黏性末端
5´CATG 5´GATC 5´CGCG 5´CCGG 5´TCGA 5´CTAG 5´CG 5´TA AGCT3´ GGCC3´ TGCA3´ GCGC3´
限制性核酸内切酶
AflⅢ,DsaI,NcoI,StyI,BspHI Sau3A,NdeII,BglII,XhoII,BamHI,MleI,BelI MluI,AflⅢ,BssHII,DsaI Cfr10,AgeI,XmaI,AuaI,MorI SalI,XhoI,AuaI SpeI,NheI,AurII,StyI,XbaI
Ⅲ型
具有一种共同亚基 的双功能酶 2种不同的亚基 种不同的亚基 ATP、 Mg2+（S-腺 、 腺 苷甲硫氨酸） 苷甲硫氨酸） EcoP1:AGACC EcoP15:CAGCAG
5.切割位点 切割位点
位于寄主特异性位 点或其附近 是
距寄主特异性位点 3´端24~26bp处 ´ 处 是
6.序列特异的切割 序列特异的切割
型限制酶的基本特性（ Ⅱ型限制酶的基本特性（2）
识别特定的核苷酸序列，其长度多为4 2、 识别特定的核苷酸序列，其长度多为4～6个核苷酸呈二 重对称，少数酶识别更长的序列或简并序列。 重对称，少数酶识别更长的序列或简并序列。 例： EcoRⅠ Ⅰ 5′— C— 5′—G A A T T C—3′ 3′— G— 3′—C T T A A G—5′
• BamHⅠ • BclⅠ • BglⅡ • MboⅠ • XhoⅡ 5′……G↓G A T C C……3′ G 5′……T↓G A T C A……3′ 5′……A↓G A T C T……3′ 5′……N↓G A T C C……3′ 5 ……P的作用特点
部分同尾酶组分
工具酶
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA连接酶 大肠杆菌DNA聚合酶I DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶I T7DNA聚合酶 T7DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶 TaqDNA聚合酶 多核苷酸激酶 S1核酸酶 S1核酸酶
主要用途
切割DNA分子形成片段 切割DNA分子形成片段 DNA DNA片段的连接重组 DNA片段的连接重组 切口平移法标记DNA DNA探针 切口平移法标记DNA探针 DNA序列测定分析 DNA序列测定分析 PCR体外扩增技术 PCR体外扩增技术 末端标记法制备探针 去除双链DNA DNA的局部单链结构 去除双链DNA的局部单链结构
限制性核酸内切酶的分类
已发现的限制性核酸内切酶达千 余种，依据与基因工程应用相关的特 性，分为 Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶。 型酶、 型酶、 型酶。
不同类型核酸内切酶主要特性差异
主要特性
1.限制和修饰活性 限制和修饰活性 2.限制酶的蛋白质 限制酶的蛋白质 结构 3.限制作用所需的 限制作用所需的 辅助因子 4.寄主特异性位点 寄主特异性位点 序列
5′……C 5′……C－T－G－C－A↓G……3′ ……G↑A G↑A－ ……5 3′……G↑A－C－G－T－C……5′
PstⅠ PstⅠ
5′……C－T－G－C－A 5′……C－ G……3′ ……G ……5 3′……G A－C－G－T－C……5′
末端形式（3）： 平末端
5′……CCCGGG……3′ ……CCCGGG……3 CCCGGG…… ……GGGCCC……5 GGGCCC…… 3′……GGGCCC……5′
注： 限制酶识别序列同DNA的来源无关，也就是说不具有种的特异 性，对不同的DNA普遍适用。原则上任何不同来源的DNA，经过适 当限制酶消化成片段后，都可以通过其黏性末端或平末端连接起 来，组合成新的重组分子或是新的基因。这种特性是重组DNA技术 的重要基础之一。
限制酶识别序列在DNA分子中出现的频率 限制酶识别序列在DNA分子中出现的频率 DNA
（注：二重对称即同一条单链以中心轴对折可形成互补的双链。） 有少数限制性核酸内切酶可以识别两种以上的核苷酸序列。如HindII的识别 序列为5´---CTPyPuAC---3´其中Py=C或T；Pu=A或G。这样HindII的识别序列实际为 四种：
HindⅡ 5′—G T Py Pu Ⅱ 5′— 5′— G T C A 5′— G T C G 5′— G T T A 5′— G T T G
（理论上）
44 ＝ 256 6 ＝ 4096 4
前提条件：四种碱基随机排列，数量相等。 前提条件：四种碱基随机排列，数量相等。
注：
实际中限制酶切 DNA频率差异较大 频率差异较大， 割DNA频率差异较大， 以酶切λDNA为例， 以酶切λDNA为例， λDNA为例 见右图所示。 见右图所示。
关于限制酶的几个概念（4）
同裂酶（isoschizomers）
识别序列相同而来源不同的一类限 制酶。亦称异源同工酶。 制酶。亦称异源同工酶。
5′……CCCGGG……3′ ……CCCGGG……3 CCCGGG…… ……GGGCCC……5 GGGCCC…… 3′……GGGCCC……5′ XmaⅠ↙ Ⅰ↙ ↘ SmaⅠ Ⅰ
……3 5′……C CCGGG……3′ ……C CCGGG…… ……GGGCC ……5 3′……GGGCC C……5′ ……3 5′……CCC GGG……3′ ……CCC GGG…… ……GGG CCC…… ……5 3′……GGG CCC……5′
A A A A A
C —3 （简并序列） C —3′ C —3′ C —3′ C —3′
Ⅱ型限制酶的基本特性（3） 型限制酶的基本特性（
3、 具有特定的酶切位点，即限制酶在其识别序列的特 、 具有特定的酶切位点， 定位点对双链DNA进行切割，由此产生出特定的酶切 进行切割， 定位点对双链 进行切割 末端。 末端。
限制与修饰作用
由于甲基化酶具有种属专 一性，即只修饰寄主本身的 DNA，因而避免了限制酶对 寄主DNA的破坏；对于外源 DNA，甲基化酶不能识别， 而由限制酶将其水解。
注：外来的噬菌体DNA被切割（右）而细菌本身DNA不被切割（左）
限制与修饰系统的意义
1、是许多细菌所具有的类似免疫 的防卫机制。 的防卫机制。 2、是病毒具有一定寄主范围，感 是病毒具有一定寄主范围， 染具有种属专一性的原因。 染具有种属专一性的原因。 3、既保证物种的遗传稳定性，又 既保证物种的遗传稳定性， 利于生物进化。 利于生物进化。
Ⅰ型
单一多功能的酶 3种不同的亚基 种不同的亚基 ATP、Mg2+、S-腺 、 腺 苷甲硫氨酸 EcoB:TGAN8TGC T EcoK:AACN6GTG C 在距寄主特异性位 点至少数百bp的部 点至少数百 的部 位可能随机地切割 不是
Ⅱ型
分开的核酸内切酶 和甲基化酶 单一的成分 Mg2+ 旋转对称
关于限制酶的几个概念（1）
EcoRⅠ为例说明识别位点 切割位点、 识别位点、 以EcoRⅠ为例说明识别位点、切割位点、 靶子位点的概念 靶子位点的概念
5′……G↓A－A－T－T－C……3′ － － － － 3′……C－T－T－A－A↑G……5′ － － － － 为识别位点（ 1、红字“G-A-A-T-T-C”为识别位点（序列）； 红字“ 为识别位点 序列）； 箭头所示“G↓A”间为切割位点 序列）； 间为切割位点（ 2、箭头所示“G↓A 间为切割位点（序列）； 靶子位点（序列）包括识别位点和切割位点。 3、靶子位点（序列）包括识别位点和切割位点。
末端形式（1）： 5′突出粘末端 突出粘末端
5′……G↓A－A－T－T－C……3′ ……G↓A－ G↓A ……3 ……C A↑G…… ……5 3′……C－T－T－A－A↑G……5′
EcoRⅠ EcoRⅠ
5′……G A－A－T－T－C……3′ ……C ……5 3′……C－T－T－A－A G……5′
末端形式（2）： 3′突出粘末端 突出粘末端
限制酶对切割序列的要求
识别序列位于末端或仅有识别序列， 限制酶能否对其切割？ GAATTC CTTAAG
SmaⅠ Ⅰ
5′……CCC ……CCC ……GGG 3′ ……GGG GGG……3 GGG……3′ …… CCC…… ……5 CCC……5′